Method Article

Verwendung von Kapseln zur Negativfärbung von Virusproben im Biocontainment

DOI:

10.3791/56122

July 19th, 2017

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll liefert eine Anleitung für Negativfärbevirusproben, die leicht in BSL-2-, -3- oder -4-Laboratorien verwendet werden können. Es beinhaltet die Verwendung einer innovativen Verarbeitungskapsel, die das Transmissionselektronenmikroskopie-Gitter schützt und dem Anwender eine leichtere Handhabung in den turbulenteren Umgebungen im Biokontainment ermöglicht.

Abstract

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Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) dient zur Beobachtung der Ultrastruktur von Viren und anderen mikrobiellen Pathogenen mit Nanometerauflösung. Die meisten biologischen Materialien enthalten keine dichten Elemente, die in der Lage sind, Elektronen zu streuen, um ein Bild zu erzeugen; Daher ist ein negativer Fleck, der dichte Schwermetallsalze um die Probe platziert, erforderlich. Um Viren in Suspension unter dem TEM zu visualisieren, müssen sie auf kleine Gitter aufgetragen werden, die mit einer transparenten Oberfläche beschichtet sind, die nur Nanometer dick ist. Aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer Zerbrechlichkeit sind diese Gitter schwer zu handhaben und leicht durch Luftströme zu bewegen. Die dünne Oberfläche wird leicht beschädigt, so dass die Probe schwierig oder unmöglich abbilden kann. Infektionsviren müssen in einem Biosicherheitsschrank (BSC) behandelt werden, und einige erfordern eine Biocontainment-Laborumgebung. Die Färbung von Viren in Biosicherheitsstufen (BSL) -3 und -4 ist besonders anspruchsvoll, da diese Umgebungen turbulenter sind und Techniker erforderlich sindO trage persönliche Schutzausrüstung (PSA), die Geschicklichkeit verringert.

In dieser Studie haben wir ein neues Gerät zur Unterstützung von negativen Färbeviren im Biokontainment evaluiert. Das Gerät ist eine Kapsel, die als spezialisierte Pipettenspitze arbeitet. Sobald die Gitter in die Kapsel geladen sind, saugt der Benutzer Reagenzien einfach in die Kapsel, um das Virus und die Flecken an das verkapselte Gitter zu liefern, wodurch die Handhabung von Gittern eliminiert wird. Obwohl diese Technik speziell für die Verwendung in BSL-3 oder -4 Biocontainment entwickelt wurde, kann sie die Probenvorbereitung in jeder Laborumgebung erleichtern, indem sie eine leichte Negativfärbung des Virus ermöglicht. Dieselbe Methode kann auch angewendet werden, um negativ gefärbte TEM-Proben von Nanopartikeln, Makromolekülen und ähnlichen Proben herzustellen.

Introduction

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Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist ein effektives Werkzeug für die Betrachtung der Morphologie und der Ultrastruktur von biologischen Proben, die zu klein sind, um mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop 1 , 2 , 3 , 4 zu sehen . TEMs schießen Elektronen durch eine sehr dünne Probe, die ein Bild mit höherer Auflösung erzeugt, da Elektronen eine viel kürzere Wellenlänge als Licht haben. Regionen der Probe, die Elektronen biegen oder blockieren, erscheinen dunkel, während Regionen, die elektronen licht sind, weiß erscheinen.

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Protocol

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1. Versuchsvorbereitung in einer BSL-2-Umgebung vor dem Arbeiten mit den Virusproben

  1. Vorbereiten oder kaufen Formvar und Kohlenstoff beschichtet TEM Kupfer Gitter, in der Regel 200-400 Mesh.
  2. Setzen Sie die beschichteten TEM-Gitter in Kapseln ein.
    1. Verwenden Sie ein vergrößertes Objektiv, um diesen Vorgang einfach durchzuführen. Ein oder zwei Gitter können in jede Kapsel eingeführt werden. Vorgeladene Kapseln können gekauft werden, um diesen Schritt zu beseitigen, falls gewünscht.
  3. Übertragen Sie die Kapseln mit eingefügten TEM-beschichteten Gittern, zusammen mit anderen Vorräten und Reagenzien, zur Biok....

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Results

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Die Kapselmethode produziert gute Qualität Negativfärbung für TEM-Bildgebung:

Zuerst haben wir die Qualität der Bilder ausgewertet, die durch die Verwendung der manuellen Tröpfchenmethode und der Kapselmethoden für die Negativfärbung von Zaire ebolavirus erzeugt wurden. Ebolaviren sind Mitglieder der Filoviridae Familie, zusammen mit Marburg Virus. Ebolavirus hat typischerweise einen Durchmesser von 80 bis 100 nm und kan.......

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Discussion

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Negative Färbung ist eine wertvolle TEM-Technik zur Bewertung und Größenbestimmung von Viren, Proteinkomplexen und Nanopartikeln. Die Tröpfchenpräparation dieser Proben durch manuelles Bewegen von Gittern von Reagenz zu negativen Flecken ist seit mehr als einem halben Jahrhundert das klassische Protokoll. Es ist ein einfacher Prozess, aber erfordert Know-how durch Training für den erfolgreichen Abschluss gewonnen. Ausgezeichnete Negativfärbung gilt nach wie vor als hochmoderne Kompetenz und ist in vielen TEM-Labors sehr.......

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Disclosures

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Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen im Artikel sind die der Autoren und werden nicht unbedingt von der US-Armee oder dem Verteidigungsministerium unterstützt.

Acknowledgements

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Wir danken Dr. John Carra und Rowena Schokman für die Bereitstellung gereinigter Ebola Nano-VLPs, Dr. Rajini Mudhasani für die Bereitstellung von Chikungunya Virus und Dr. Charles (Jason) Schuhmacher für die Bereitstellung von Murine Leukämie VLPs, die Ebolavirus Glykoproteine ​​exprimieren. Wir möchten uns auch bei MAJ Carl Soffler für die Erleichterung des Summer Praktikumsprogramms (SIP) und des Science and Engineering Apprenticeship Program (SEAP) und Dr. Catherine Wilhelmsen für die Laborsicherheitstraining bedanken.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Formvar/kohlenstoffbeschichtete TEM-GitterSPI3420C-MB200 Mesh Cu Pk/100
mPrep/g KapselnEMS85010-01Box
mPrep/f KopplerEMS85010-11Standard 16/Pk
GlutaraldehdydEMS1632050% Lösung, EM Klasse
Osmium TetroxidEMS191904% wässrige Lösung
UranylacetatEMS22400Pulver
KaliumphosphotungssäureEMS19500Pulver
FilterpapierWhatman1450-090Größe 50
TransmissionselektronenmikroskopJEOLJEM-1011TEM

References

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  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
  3. Curry, A., Appleton, H.....

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Negative StainingTEM GridsBiocontainmentVirus TEMCapsule MethodElectron MicroscopyGlutaraldehyde FixativeUranyl AcetatePhosphotungstic AcidOsmium Tetroxide

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