Summary
Aquí describimos un método simple y ampliamente accesible para lesionar nervios segmentarios en larvas de Drosophila para visualizar y cuantificar la neurodegeneración de neuronas motoras en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de tercer estadio.
Abstract
La degeneración de las neuronas se produce durante el desarrollo normal y en respuesta a lesiones, estrés y enfermedades. Las características celulares de la degeneración neuronal son notablemente similares en los seres humanos e invertebrados como son los mecanismos moleculares que impulsan estos procesos. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster , proporciona un poderoso pero simple organismo modelo genético para estudiar las complejidades celulares de las enfermedades neurodegenerativas. De hecho, aproximadamente el 70% de los genes humanos asociados a la enfermedad tienen un homólogo de Drosophila y una plétora de herramientas y ensayos se han descrito utilizando moscas para estudiar enfermedades neurodegenerativas humanas. Más específicamente, la unión neuromuscular (NMJ) en Drosophila ha demostrado ser un sistema eficaz para estudiar enfermedades neuromusculares debido a la capacidad de analizar las conexiones estructurales entre la neurona y el músculo. Aquí, informamos sobre un ensayo de lesión de neurona motora in vivo en Drosophila , queInduce de forma reproducible la neurodegeneración en el NMJ por 24 h. Utilizando esta metodología, hemos descrito una secuencia temporal de eventos celulares que resultan en la degeneración de la neurona motora. El método de lesión tiene diversas aplicaciones y también se ha utilizado para identificar genes específicos necesarios para la neurodegeneración y diseccionar las respuestas transcripcionales a la lesión neuronal.
Introduction
La degeneración neuronal se produce durante el desarrollo normal y puede ser causada por el proceso de envejecimiento natural, lesiones, estrés o estados de enfermedad. Drosophila melanogaster , la mosca común de la fruta, proporciona un organismo modelo simple y poderoso para estudiar la neurodegeneración debido a las notables similitudes en los mecanismos moleculares que impulsan la degeneración de las neuronas. Estas similitudes se destacan por el hecho de que aproximadamente el 70% de los genes humanos asociados con la enfermedad tienen un homólogo de Drosophila . 1 Además, numerosos ensayos y herramientas tecnológicas para estudiar enfermedades neurodegenerativas humanas se han desarrollado y utilizado en Drosophila. 2 , 3 Dentro de Drosophila , la unión neuromuscular (NMJ) permite el análisis de las propiedades celulares y electrofisiológicas y ha demostrado ser un importante sistema para estudiar la enfermedad neuromuscular debido a la visible nEurón-músculo. 2 En este estudio, describimos un ensayo de lesión neuronal in vivo en larvas de Drosophila que permite la lesión reproducible de los nervios segmentarios. Esta lesión motoneurónica da lugar a una secuencia temporal de eventos celulares que dan como resultado la neurodegeneración en el NMJ 24 h después de la lesión. La capacidad de motoneuronas de lesión reproducible que da lugar a neurodegeneración tiene aplicaciones diversas tales como la identificación de genes específicos requeridos para el proceso degenerativo, la disección de respuestas transcripcionales a lesión neuronal y el análisis de cascadas de señalización protectora. 4 , 5 , 6 Este método también se ha utilizado en combinación con microfluidos para estudiar la degeneración neuronal y la regeneración en animales vivos. 7
Utilizamos un ensayo cuantitativo establecido para examinar la degeneración de las neuronas motorasIon en el Drosophila NMJ después de lesión mecánica. Este ensayo se basa en el hecho de que la pérdida de membrana y proteínas presinápticas precede al desmontaje del retículo subsináptico (SSR) caracterizado por los pliegues de la membrana muscular postsináptica. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Este ensayo permite la cuantificación de "huellas sinápticas" en las que la neurona pre-sináptica ha perdido la conexión con el músculo postsináptico adyacente. Se ha demostrado que el proceso degenerativo es progresivo a lo largo del desarrollo larvario 12 y no puede explicarse por el desarrollo alterado de la sinapsis o el brote. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 El anuncioLa ventaja de usar lesiones mecánicas sobre mutaciones preexistentes es que permite la disección de la secuencia temporal de eventos celulares que conducen a la neurodegeneración en el NMJ. 13
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Protocol
1. Preparación de reactivos y equipos
- Preparar 1x Disección Buffer (NaCl 70 mM, KCl 5 mM, 0,02 mM CaCl 2 mM, MgCl 2 20, 10 mM de NaHCO3, sacarosa 115 mM, trehalosa 5 mM, HEPES 5 mM; pH 7,2).
- Preparar 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Preparar 1x PBT usando 1x PBS con Triton X-100 al 0,01%.
- Preparar las placas de agar de jugo de frutas. 14 Brevemente, mezclar 30 g de agar en 700 ml de H 2 O y autoclave. Disolver 0,5 g de metil parabeno en 10 ml de etanol y agregar la solución a 300 ml de concentrado de jugo de frutas (uva o manzana). Mezclar el concentrado en una solución de agar autoclavada y verter en las tapas de placas de Petri de 10 mm x 35 mm.
NOTA: La premezcla de poder de agar de uva también se puede comprar de varias compañías (ver Tablas de Materiales ). - Obtenga pinzas de tamaño 5 que permitan dañar mecánicamente a las larvas.
- Utilice Drosophila CO 2 estándar
2. Selección de larvas de Drosophila
- Tome un vial o una botella de Drosophila que contiene larvas errantes de tercer estadio que se han cultivado a 25 ° C.
- Seleccionar diez 2º individuales o larvas 3ª basados en la apariencia. Las larvas de tercer estadio pueden ser identificadas por la aparición de espiráculos ramificados anteriores, mientras que las larvas de segundo estadio son más pequeñas y tienen más espiráculos anteriores de tipo club.
NOTA: Las etapas Larval también pueden ser identificadas por el momento. A 25 ° C, las larvas del segundo estadio aparecen aproximadamente 48 h después de la eclosión, y las larvas del tercer estadio se mueven aproximadamente 24 h después. Si están interesados en examinar la neurodegeneración en la NMJ, las larvas de segundo estadio necesitan ser lesionadas.
3. Preparación de larvas de Drosophila para lesiones mecánicas
- Cuidadosamente recoger las larvas individuales con una pinza o un pincel, siendo cautelosoNo para comprimirlo de todos modos.
- Coloque directamente diez larvas en un plato de vidrio que contenga 1X PBS frío o tampón de disección para eliminar cualquier desecho de alimentos y para desacelerar la motilidad larvaria.
4. Lesión mecánica y tratamiento de larvas de Drosophila
- Colocar cada larva individual en un aparato de anestesia de CO 2 .
- Bajo un microscopio de disección, cuidadosamente rodar cada larva en su lado dorsal con el fin de visualizar los nervios segmentarios a través de la cutícula.
- Posición de tamaño 5 pinzas de aproximadamente 1/2 a 2/3 de la longitud de la larva a partir de los ganchos boca. Una vez posicionado, pellizque aproximadamente 1/3 de la cutícula ventral que contiene los nervios segmentarios con fórceps de tamaño 5.
- Para asegurarse de que los nervios segmentales larvales se lesionan, aplique fuerza suficiente para aplastar los nervios segmentarios, pero dejar la cutícula intacta. Para determinar la cantidad correcta de fuerza, aplaste 10 larvas y asegúreseLa tasa de mortalidad después de 5 h es inferior al 50%.
- Tras la lesión, transferir cuidadosamente las larvas a una placa de agar de zumo de fruta que contenga aproximadamente 0,5 g de pasta de levadura. Coloque cada larva para que su extremo anterior esté en la pasta de levadura, para la alimentación continua a pesar de la motilidad interrumpida.
NOTA: Para asegurar que los nervios segmentales de las larvas se hayan lesionado, se puede observar la motilidad larval interrumpida tras la transferencia a la placa de agar. Las larvas lesionadas se paralizan de forma efectiva posterior al sitio de la lesión, pero todavía pueden mover sus ganchos bucales y alimentarse. Una alta tasa de mortalidad de los animales después de la lesión es común por lo que es mejor dañar 20-50% más animales de lo necesario para un experimento. - Coloque las placas de agar que contengan pasta de levadura y 10 larvas dañadas en el fondo de una placa de Petri vacía de 100 x 15 mm. Cubra esta placa de Petri, que ahora contiene las larvas dañadas en una placa de agar con una toalla de papel húmedo, asegurando que la toalla de papel no toque las larvas o las placas de agar. Coloque estoPetri en un recipiente hermético más grande, a RT.
- Recuperar larvas para disección después de períodos especificados (6, 12 o 24 h) después de la lesión.
NOTA: Para examinar los efectos inmediatos de la lesión en el citoesqueleto axonal, las larvas pueden ser disecadas directamente después de la lesión. Para examinar defectos de transporte axonal, las larvas pueden ser disecadas aproximadamente 6 h después de la lesión. Alrededor de 12 horas después de la lesión se puede observar una acumulación de proteínas ubiquitinadas, y 24 horas después de la lesión, se puede observar la degeneración de las neuronas motoras en el NMJ.
5. Análisis de la neurodegeneración en el NMJ
- Disecar Drosophila larval NMJ como se describió anteriormente. 15 , 16 En pocas palabras, ponga las larvas en una placa de Sylgard, corte a lo largo de la superficie dorsal, y filetee con los pernos en una gota del amortiguador de la disección para exponer la musculatura de la pared del cuerpo. Fije las larvas en 4% de paraformaldehído (PFA) o solución de Bouin dependiendo del antiCuerpos utilizados para visualizar neuronas y músculos.
NOTA: Debe usarse la fijación de PFA si las etiquetas fluorescentes de la proteína, tales como la proteína fluorescente verde (GFP) se visualizan como fijador de Bouin puede ser demasiado áspera. - Realizar la inmunofluorescencia, que se ha descrito anteriormente 11 , 13 , 16 , para marcar simultáneamente las neuronas motrices presinápticas y pliegues musculares postsinápticos (SSR) adyacentes. Visualice membranas presinápticas y axones con peroxidasa de rábano conjugado con fluorescencia (HRP) (1: 300) 17 y las zonas activas pueden ser teñidas usando un anticuerpo anti-Bruchpilot (Brp) (nc82; 1: 100; Developmental Studies Hybridoma Bank). Simultáneamente etiquetar los músculos post-sinápticos con un anticuerpo anti-Dics Large (Dlg) (1: 10.000). 18
- Realizar un ensayo establecido para cuantificar la neurodegeneración en el NMJ como se describió anteriormente. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Brevemente, visualice simultáneamente NMJ individuales para los compartimentos pre y post-sinápticos. Cualquier boutons etiquetados con marcadores postsinápticos pero no marcadores presinápticos indican sitios de neurodegeneración ( Figura 1 ). El número medio de boutons por NMJ así como el número medio de NMJs por animal puede ser cuantificado.
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Representative Results
Utilizando el procedimiento presentado aquí, hemos demostrado que la lesión neuronal mecánica permite la disección temporal de los eventos neurodegenerativos. 14 , 18 La secuencia de eventos se ha caracterizado previamente y comienza con una interrupción inmediata del citoesqueleto, seguida de defectos de tráfico axonal, acumulación de proteínas ubiquitinadas y posterior neurodegeneración 24 h después de la lesión. Antes de la lesión, WT NMJ muestran el marcador de zona activa presináptica Brp en aposición al marcador postsináptico Dlg a lo largo de todo el NMJ ( Figura 1A ). La lesión mecánica de los nervios segmentarios puede inducir una neurodegeneración moderada a severa en la que los boutons teñidos con Dlg carecen ahora de la proteína de la zona activa presináptica Brp ( Figura 1B ). Cualquier botón que está teñido con Dlg pero carece de tinción Brp se considera un "synhuella APTIC" y puede ser contado y se cuantificó como un evento neurodegenerativa. Tanto la frecuencia y la gravedad del fenotipo neurodegenerativo pueden cuantificarse como se ha descrito anteriormente. 11
Figura 1: La lesión neuronal mecánica induce neurodegeneración en el NMJ del músculo 6/7. ( A ) Los NMJ no dañados muestran el marcador de la zona activa pre-sináptica, Brp (verde) en aposición con el marcador postsináptico, Dlg (rojo) a lo largo de todo el NMJ. ( B ) La lesión mecánica neuronal induce la neurodegeneración indicada por los boutons teñidos con Dlg (rojo) con la pérdida de Brp. Las puntas de flecha indican sitios individuales de neurodegeneración. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande deesta figura.
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Discussion
La lesión mecánica neuronal descrita anteriormente y demostrada aquí puede usarse para inducir lesión / estrés en los nervios segmentarios de larvas de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Esta técnica experimental se ha empleado previamente para diseccionar la secuencia temporal de los eventos que conducen a la neurodegeneración, así como para examinar los cambios transcripcionales en los cuerpos de las neuronas motoras después de la lesión. 5 , 14 Además, esta técnica se ha descrito en conjunción con chips microfluídicos para observar y estudiar la degeneración y regeneración axonal en larvas de Drosophila . 7 Las limitaciones de esta técnica incluyen la muerte de las larvas debido a la punción de la cutícula durante la introducción de la lesión. Sin embargo, un gran número de larvas puede ser aplastado en un shPara superar una elevada tasa de mortalidad larvaria. Una modificación que hemos incluido es la lesión de 2 ª instar o temprano larvas 3 ª instar, que es crítico para visualizar la degeneración de las neuronas motoras en el NMJ, que se produce 24 h después de la lesión.
Aquí, demostrar que la lesión neuronal puede ser utilizado para estudiar la degeneración de las neuronas motoras en el NMJ. Utilizamos un método establecido para cuantificar la neurodegeneración que aprovecha el hecho de que las neuronas y sus proteínas asociadas degeneran más rápidamente que el músculo adyacente. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Para observar y cuantificar la neurodegeneración, es crítico que el NMJ sea teñido simultáneamente para los marcadores pre- y post-sinápticos. Aquí teníamosEmontrar el uso del marcador de zona activa Brp y el marcador postsináptico Dlg, sin embargo, hay una plétora de otros marcadores pre y post-sinápticos disponibles que pueden utilizarse para estudiar la neurodegeneración en el NMJ. Adicionalmente, se pueden emplear moléculas marcadas fluorescentemente de una elección para estudiar sus efectos durante el proceso neurodegenerativo. Existen métodos más complicados para estudiar la degeneración después de la lesión axonal, como la microfluídica 7 , sin embargo, nuestro método tiene varias ventajas: 1) es muy barato, 2) la mayoría de los laboratorios Drosophila ya tienen el equipo necesario, y 3) La microscopía de fluorescencia convencional se puede utilizar para cuantificar los eventos neurodegenerativos después de la lesión.
Prevemos que este protocolo puede ser adaptado para examinar una amplia gama de mecanismos celulares y moleculares relacionados con la neurodegeneración después de la lesión. En particular, estos métodos podrían ser utilizados para examinar el behAvior de cualquier proteína marcada fluorescentemente antes y después de la lesión neuronal y la degeneración y regeneración de las neuronas motoras.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a todos los miembros de los Laboratorios Keller y Magie en la Universidad Quinnipiac por sugerencias útiles. En particular, queremos agradecer a Barron L. Lincoln II por el desarrollo de este ensayo de lesión dentro del Laboratorio Keller. También queremos agradecer a la Universidad de Quinnipiac el premio otorgado a LC Keller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
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