Summary
이 문서 내용을 사용 하 여 탄소 섬유 전극 효소 바이오 센서 기술에 자연적인 보상 행동 동안 도파민과 높은 시간 해상도와 조미료의 릴리스를 측정 하는 고정 잠재력 amperometric 녹음의 사용은 여자는 햄스터
Abstract
신경 전달 물질 방출 빠른 시간 규모를 측정 하는 능력 수 있습니다 특정 동작 또는 조작;에 연결 될 neurotransmission의 패턴을 기본 메커니즘 및 회로 elucidating에 강력한 도구입니다. 측정 하는 뇌의 거의 모든 분석을 수십 년 동안 microdialysis의 기술을 사용 하는 동안이 기법은 시간적 해상도 제한 됩니다. 또는 빠른 검색 주기적 voltammetry가 이다 일시적으로 정확 하 고 매우 민감한; 그러나,이 기술적으로 어려운 방법 관심의 분석의 electroactivity에 의존, 때문에 nonelectroactive 물질 (예를들면, 신경 전달 물질 글루타민 산 염)를 검출 하는 가능성은 제거 됩니다. 이 종이 고정 잠재적인 amperometry 및 임시 정밀 electroactive와 nonelectroactive 신경 전달 물질을 측정 하는 효소 바이오 센 싱 결합 하는 턴키 시스템의 사용을 자세히 설명 합니다. 이러한 두 가지 강력한 기술을의 페어링를 비교적 쉽게 토 닉과 phasic neurotransmission의 측정에 대 한 허용 하 고 허용 하는 동시에 여러 신경 전달 물질의 기록. 이 원고의 목표는 도파민과 조미료 neurotransmission에서 비보에 표시의 궁극적인 목표와 여성 햄스터에 자연스럽 게 보상 행동 (즉, 성적 행동)을 사용 하 여 측정 하는 과정을 설명 하는 이 분석 결과 다른 행동과 실험 패러다임 검사의 기술적 타당성
Introduction
깨어 동작 동물에서 신경 전달 물질 방출 측정 하는 능력을 허용 한다 neurotransmission는 강력한 도구를 조사 메커니즘 및 모두 기본 회로의 공간 및 시간 패턴을 가진 특정 동작을 연결 하는 연구자를 자연 그리고 실시간으로 작동 동작입니다. 역사적으로, microdialysis 뇌1의 세포 외 환경에서 모두 전기 반응과 nonreactive 물질 측정 하 고용 하고있다. 이 기술은 반 투과성 빈 섬유 막2의 팁과 작은 샤프트 구성 microdialysis 프로브를 통해 extracellular 액체에 유사한 이온 성분의 수성 해결책의 지속적인 흐름을 사용 합니다. 프로브 삽입 후 신경 전달 물질 또는 관심의 다른 analytes 수 있습니다 교차 반 투과성 막 이후 분석에 대 한 간격-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 수집 되 고 전에 수동 확산에 의해 한 일반적으로, 별도로 활용 하는 분석 화학 기술 식별, 그리고 이질적인 혼합물3구성 요소를 계량.
Microdialysis 관심의 거의 모든 분석을 측정 하는 데 사용할 수 있는 중요 한 기술 이지만, 시간적인 해상도 수십 분1,2분 순서 최대 샘플링 속도와 낮은. 빠른 스캔 주기적 voltammetry (FSCV), electroactive 종의 산화 환 원 잠재력에 의존 하는 기술 발명 extracellular 액체의 분석의 즉각적인 농도 근처 명료 수 있습니다. 간단히 (참조 로빈슨 외. 4 광범위 한 검토를 위해), 전극 인상 하 고 낮은 전압 빠른 시간 규모4에 삼각형 웨이브 패션에 적용 됩니다. 전압이 올바른 범위에 있을 때 관심의 화합물은 반복적으로 산화 고 감소. 작은 교류 전류를 생성 하는 전자의 운동에이 산화 및 감소 결과. 산화 및 감소 마이크로초에 발생 하는 화합물의 초 규모 요금 걸릴 장소를 검색 합니다. 결과에서 프로브에 의해 만들어진 배경 현재 빼서 하나 현재 플롯 각 화합물에 대 한 전압을 생성할 수 있습니다. 전압 진동의 시간 규모 알려져 있기 때문에 이러한 데이터는 현재의 시간의 함수로 계산 하 사용할 수 있습니다. 따라서, 화합물의 상대적인 농도 각 산화에 전송 되는 전자의 수와 감소 반응4알려져으로 결정 될 수 있습니다.
이 화학 특이성 및 높은 시간 해상도 확인 FSCV vivo에서화학 농도 변화를 감지 하는 강력한 기술. 그러나, 이러한 매니폴드 장점에도 불구 하 고이 기술은 광범위 한 기술적 전문성과 고가의 장비 및 설치가 필요합니다. 또한, nonelectroactive 신경 전달 물질 (예, 조미료)이이 기술을 사용 하 여 측정 될 수 없습니다. 다행히도, 이러한 발명의 상용화로 서 전기 화학5의 분야에서 기술 발전 깨어 동작 동물에서 비 electroactive 신경 전달 물질을 측정 하는 비교적 간단한 방법 소개 했다 일시적인 정밀도는 기술을 타협 하지 않고 효소 바이오 센서 기술 이라고 합니다. 이 기술은 효소 변환을 사용 관심의 nonelectroactive 신경 전달 물질의 두 개의 기판으로 적용된 가능성5에 의해 생성 되는 amperometric 산화 현재로 감지 하는 과산화 수소 electroactive 중 하나는 . 상업적으로 이용 가능한 바이오 센서 프로브 생 interferents의 기여를 경쟁적으로 줄여 관심의 analytes를 측정 선택적으로 ( 그림 1참조). 조미료, 경우 일반적인 interferent ascorbic 산 (AA)의 기여는 경쟁적으로 감소 측정된 전류에 공동 electroactive 비 하 AA를 변환 하는 센서의 활성 효소 표면 산화 효소 AA 지역화 dihydroascorbate 그리고 물입니다. 또한, 부정 청구 Nafion 폴리머 레이어 효소 레이어에서 현재 생 음이온 화합물 제외합니다.
이 같은 바이오 센서 실험 설치 프로그램 electroactive 신경 전달 물질 FSCV에서 측정할 수 있지만 대신 고정 잠재력 기록6를 사용 하 여. 진동 전압 FSCV에 적용, 달리 고정 잠재력 기록에서 전압은 유지는 산화 환 원에 관심의 분석에 대 한 잠재적인. 여러 신경 전달 물질은 압도적으로 한 신경 전달 물질 쪽으로 왜곡 하는 뇌 영역에서 동일한 산화 환 원 잠재력, 있을 수 있습니다 FSCV 보다 덜 화학적 선택적 이더라도,이 접근의 턴키 자연 화학 물질의 부족을 능가 하는 것 특이성입니다.
모두 electroactive nonelectroactive 신경 전달 물질 릴리스에 거의 실시간으로 측정 하 고 특정 행동의 이벤트와 연결할 수 수렴 신경 전달 물질 자료를 검토 하는 기회를 제공 한다. 이 원고는 응답 깨어 동작 햄스터에 자연적인 보상으로 도파민, 조미료 neurotransmission가이 시스템의 사용을 자세히 설명 합니다. 이 문서의 목표는 다른 행동과 실험 패러다임을 조사 하기 위한 그것의 타당성을 보여주는 목표와 함께 여성 햄스터에 성적인 행동 중이 신경 전달 물질 자료를 측정 하는 과정을 자세히.
햄스터는 전기 녹음에 사용 하기 위해 이상적인 모델
역사적으로, 쥐 및 쥐 모델 성적 행동의 학문에 고용 되었다 있다. 이러한 설치류 종 귀 방도 추적 하 고 궁극적으로는 여성7을 탑재 하는 남성을 유혹 하 고 호핑, 다트를 포함 하는 수많은 여성 요청 동작을 관련 된 동적 copulatory 시퀀스에 참여. 남성 (또는 질 침투 없이)에 의해 장착 기간 동안 여성에에서 종사 하는 그녀의 성적 행동 자세 ( 절곡되 나) 또한 활성 요청 동작을 다시 시작 하기 전에 몇 초 동안만 단 몇 초 지속. 이 패턴의 부동성의 짧은 기간과 interspersed 활동의 높은 수준의 구성 문제의 측정 neurotransmission 동물 행동에 대 한 문제 이다. 첫째, 운동 유물 amperometric 녹음 신경 활동에 관련 되지 않은 수 있습니다. 둘째,는 운동 특정 뇌 영역에 특정 신경 전달 물질의 출시와 함께 연결 됩니다. 예를 들어 도파민 방출 등 쪽과 복 부가8,9, psychostimulant에 따라 도파민의 microdialysis 측정을 위한 기초를 형성 했다 찾는 운동 활동 결합 되어 있다 관리10. 때문에 mos에 여성 일반적인 권유 동작어렵게 neurotransmission에 변화만 최근 공동으로 성적 행동의 명시적 구성 요소에 돌리다, t 설치류, 운동 활동의 높은 수준을 포함 하 고 10 분 성적 행동 테스트 일괄으로 표시 됩니다. 분입니다.
여성 성적인 행동의 neurochemical 프로필을 분석 하이 랩 종은 성적 행동을 동반 하는 최소한의 운전 활동을 추구. 시리아 햄스터 (Mesocricetus auratus)에 copulatory 시퀀스 neurochemical 녹음 권유 행동 일반적으로 쥐 및 쥐11본의 부족에 이상적입니다. 결과적으로, 여성 햄스터 입력 하 고 테스트 세션1210 분 중 9 분 이상을 위한 절곡 자세 유지. 여성, vivo에서 외부 운동 운동의 부족으로 남자와의 성적인 상호 작용의 구성 요소와 연관 될 수 있는 전기 녹음을 얻을 수 있습니다.
햄스터에 copulatory 관찰
소개 후에 남성 자극 동물의 테스트 챔버로, 남성 그녀의 (그림 2A)를 탑재 하기 전에 여성의 anogenital 조사 (AI)에 처음 참여 한다. 위해서 탑재 하 남성, 여성 절곡, 그녀 그녀를 다시 아치 고 장착 남성 성 기에 대 한 액세스 그녀의 음부를 얻을 수 있도록 그녀의 꼬리를 굴절 이라고 받아들이는 성적 자세를 가정 합니다. 남성 여성, 두 발 (그림 2B), 그녀의 엉덩이 쪽을 clasping 탑재 하 고 성 기 수단 (그림 2C)를 얻기 위해 시도에서 밀어 시작 것입니다. 남성은 뿐만 아니라 여러 번 결국 루를 달성 하기 전에 intromit 마운트 (삽입) 없이 여성 것입니다. 마운트 및 사정에 지도 하는 intromissions의이 시퀀스 "copulatory 시 합" 이라고 불린다. 남성은 단일 세션 내에서 여러 copulatory 복싱을 있을 것 이다.
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Protocol
여기에서 설명한 모든 절차 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미네소타의 대학에 의해 승인 되며 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 13 .
1. 동물과 Cannulation 수술
나이의 대략 55 일에 일반적인 동물 공급 업체에서- 받기 시리아 햄스터.
참고: 다양 한 실험적인 패러다임의 제약으로 인해 동물의 나이 다르지만 성적 행동에 대 한 그것은 성적으로 성숙 동물을 모두 대략 같은 나이 얻기 위해 중요 한. - 집 동물 제어 온도 (22 ° C)와 (14 h 빛 뒤에 10 h 13시 h 소등 어두운) 조명 환경, 음식과 물을 사용할 수 있는 광고 libitum 제외 하 고 실험 테스트의 기간 동안.
참고: 햄스터 계절 재현, 이후이 14시 10분 명암 주기 싫어 하지 그들의 자연 번 식 조건. - 는 1 주일 새 환경 순응 실험실에, 다음과 같은 무 균 양자 ovariectomies 및 intracranial stereotaxic cannulations (예를 들어, pentobarbital), 전신 마 취하에 수행 하 고 관리할 적절 한 제도 승인 수술 후 진통제 및 항생제 치료로 설명한 14 , 15.
참고: 성적인 행동의 연구를 위해 ovariectomies은 동물 실험 일정에 따라 외 인 호르몬과 성적 감수를 균일 하 게 유도 될 수 있다 성 호르몬의 주요 생 소스를 제거 하는 데 필요한.- Dopaminergic와 glutamatergic 프로브 이식에 대 한 stereotaxically 임 플 란 트 가이드 cannulae (0.7 m m 직경; 그림 3) 관심의 영역으로 (예를 들어,이 실습 대상 바로 핵 accumbens (NAc)) 15 stepwise 세부 다른 곳에 설명 된 대로.
참고: 비록 동물 당 1 개의 조미료 또는 도파민 프로브의 단일 센서 녹음에서 제시 하는 데이터는,이 시스템 수 있습니다 단일 동물; 최대 4 센서 동시 녹음에 대 한 따라서, 1-4 cannulae 원하는 실험 설계 및 결과 따라 이식 될 수 있었다.- Stereotaxic atlas를 사용 하 여 관심 영역의 이식 좌표 결정 (예를 들어, 골든 햄스터 두뇌 Morin에 의해 & 나무), 센서 뇌 조직으로는 정 아래 1 m m를 확장 하는 마음에 유지.
- 는 정 stereotaxically 복 부 등의 원하는 위치에 낮춘 다, 후 치과 아크릴, 스테인리스 뼈 나사와 플라스틱 머리 확보에서 건설 하는 모자를 사용 하 여 두개골에 부착 마운트 ( 그림 3 ; 15 대 한 자세한 내용은 참조).
- 탄소 섬유 테스트용 contralateral 반구에 (350 μ m 직경, 길이 7.5 m m) 기준 전극 삽입.
참고: 특정 위치 또는 거리는 정에서 필요; 하지 않습니다. 참조 전극 편리 contralateral 반구에서 어디 든 지 놓일 수.
- Dopaminergic와 glutamatergic 프로브 이식에 대 한 stereotaxically 임 플 란 트 가이드 cannulae (0.7 m m 직경; 그림 3) 관심의 영역으로 (예를 들어,이 실습 대상 바로 핵 accumbens (NAc)) 15 stepwise 세부 다른 곳에 설명 된 대로.
2. 바이오 센서 및 탄소 섬유 테스트
- 수술에서 회복의 1 주, 다음 성적 감수 유도 호르몬 못쓰게 처방 관리.
- Estradiol benzoate 면 화씨 기름 0.1 ml에서의 10 µ g을 피하 주사 (사우스 캐롤라이나), 약 48 h와 테스트, 성적 감수 남성 11 쪽으로 유도를 하는 성적 행동에 앞서 24 h.
- 면 화씨 기름, 사우스 캐롤라이나, 성적 감수 11 유도 남자의 소개 이전에 4 h의 0.1 ml에서 황 체 호르몬의 주사 500 µ g.
- 설치류의 사회적 행동 흰 빛과 붉은 빛 조건 16 , 17 테스트에서 변경 될 수 있습니다으로 그들의 매일 주기의 어두운 단계의 시작에서 모든 동물 테스트 , 18.
- 효소 바이오 센서 조미료 테스트, 센서에는 생체 외에서 ( 그림 4) 15 , 이전에 설명 된 대로 사용 하기 전에 보정 19.
- 게 보정 솔루션 20 mL 유리에서 테스트의 날에 신선한 원심 관. 분석 솔루션에 대 한 부드럽게 튜브를 거꾸로 하 여 7.4 m g L-글루탐산의 울트라 순수 H 2 O의 10 mL에 녹. 매우 순수한 H 2 o.의 10 ml에서 176.1 mg AA를 용 해 하 여 interferent 솔루션으로 만들기
- 설정 기본 랩 링 스탠드의 기지에는 자력을 배치 하 여 교정 자력, 위에 20 mL 외피 비 커를 배치 하 고 중간 2 단자 클램프를 사용 하 여 장소에 클램프.
- 추가 자석 저 어 바와 100 m m 인산 염의 20 mL 외피 비 커에 식 염 수 (PBS)를 버퍼링. 37 버퍼 솔루션 열 순환 물 목욕에 외피 비 커를 연결 ° c.
참고: 효소 바이오 센서 교정에서 수행 해야 체온 때문에 효소 활동은 온도 의해 영향을 받습니다.
- 추가 자석 저 어 바와 100 m m 인산 염의 20 mL 외피 비 커에 식 염 수 (PBS)를 버퍼링. 37 버퍼 솔루션 열 순환 물 목욕에 외피 비 커를 연결 ° c.
- 외피 비 커 위에 센서 캘리브레이션 홀더를 배치 하 고 4 채널 교정 프리 앰프 위에 직각 클램프를 사용 하 여 장소에 보안 설정. 기록 캘리브레이션 데이터를 데이터 컨디셔닝 및 수집 디바이스는 프리 앰프 연결.
- 교정 홀더 꼭대기에 프로브를 배치 하 여 실험 녹음 하기 전에 조미료 (또는 다른 상업적으로 이용 가능한 바이오 센서 프로브 예, 포도 당에 대 한 관심의 다른 analytes) 각 효소 바이오 센서의 감도 테스트를 자 켓된 비이 커, 감지 캐비티와 염화는 (AgCl) 참조의 일부 물속 버퍼 솔루션에 연결 합니다.
- 4 채널 교정 프리 앰프에 포트 테스트 (4)까지 각 센서를 연결 하기 전에 무료 다운로드 수집 소프트웨어를 활용 하 여 컴퓨터 인터페이스에 새 녹음을 시작. 안정적인 기준선에 도달 센서 허용.
- 센서 안정 기준선에 도달 실정이 주사를 추가 시작. 교정 홀더에서 구멍을 사용 하 여 버퍼 솔루션에 피 펫 팁을 소개. 레코딩 소프트웨어에서 빠른 키 주석 도구를 사용 하 여 주석을 주사 될 때.
버퍼 솔루션에 분석 솔루션의
- pipetting 40 여 조미료의 만들 10 µ M 추가 μ. 센서 추가 사이 안정화를 기다립니다. 분석 솔루션의 3 주사 interferent AA 솔루션 (250 μ M 변화 농도에 대 한 50 μ 주입 볼륨)에서 단일 주사를 추가 하기 전에 추가.
참고: 경우 보정 조미료 농도 변화 (2.12 단계에서 효소 실험 기록 중 본) amperometric 신호에 변화 변환할 수 있다. 단계적 교육에 대 한 참조 15를 참조 하십시오. Dopaminergic 프로브가이 실험실에서 사용 되는 상업적인 공급자에 의해 제조 과정에서 보정 됩니다. 그들의 감도 효소 구성 요소 저하 19 시간이 지남에 줄일 수로 사용 시 조미료 프로브를 보정 해야 합니다. 탄소 섬유 전극 저하를 받아야 하지 않습니다, 때문에 이전에 선적 회사에 의해 수행 하는 교정 만으로는 따라 t로여기는 추가 처리를 통해 얇은 탄소 섬유 (350 μ m 직경) 손상의 증가 가능성.
- pipetting 40 여 조미료의 만들 10 µ M 추가 μ. 센서 추가 사이 안정화를 기다립니다. 분석 솔루션의 3 주사 interferent AA 솔루션 (250 μ M 변화 농도에 대 한 50 μ 주입 볼륨)에서 단일 주사를 추가 하기 전에 추가.
참고:이 여성 증가 ' s 친숙 테스트 챔버, 뿐만 아니라 여성 estradiol 치료에 대 한 응답에서에 의해 배 부 되었다 후 각 짝짓기 신호를 성적으로 자극 하는 남성 노출.
참고:이 실습 사용 10 갤런 유리 수족관 (24.5 x 48.9 x 29.4 cm), 하지만 같은 영역의 둥근 약 실 또한 고용 수 있습니다.
참고: 사용자 지정된 연결선 탄소 섬유 전극과 참조 전극에 연결할 potentiostat, 효소 조미료 센서는 potentiostat에 직접 연결 될 수 있습니다 하는 동안 필요 하다.
참고: 평형 시간 기록 센서 마다 다릅니다 (예를 들어, 효소 센서 필요 2-4 h 평형, 탄소 섬유 전극만 약 30 분을 필요로 하는 동안). 두 종류의 센서를 이식 하는 경우 장시간 효소 센서에 대 한 equilibrate.
참고: 때문에 탄소 섬유 녹음에 필요한 간단한 평형 단계 2.3 2.14 같은 날에 여러 동물 테스트를 반복할 수 있습니다. 효소 센서에 필요한 평형의 약 4 h, 때문에 동물의 차이로 인해 가능한 간 주제 변화를 제한 하는 일 당 하나의 동물을 테스트 하는 반면, ' 테스트에서 circadian 시간.
3. 희생과 관류
- euthanizing 에이전트와 함께 여성 테스트 주제 anesthetize 깊이 테스트 기간에 따라 (예를 들어이 실험실 0.2 mL phenytoin pentobarbital 솔루션의 복 주사를 사용 하 여) .
- Transcardially perfuse 25 mM PBS, pH 7.6, 다음 20 분 고정 4 %paraformaldehyde-PBS를 사용 하 여 모든 순환 혈액 제거와 동물.
- 두뇌를 제거 하 고에 후 위 ~ 30 mL 50 mL 원뿔 튜브를 하룻밤에 4 %paraformaldehyde 솔루션의.
직렬 섹션 준비까지
- 스토어는 10%에서 뇌 자당 PBS 솔루션.
참고: 두뇌 저장 될 수 있습니다 2-주, 오염 물질의 잠재적인 성장을 방지 하기 위해 매주 자당 솔루션 변경.
- 스토어는 10%에서 뇌 자당 PBS 솔루션.
- 직렬 섹션 40 µ m에 뇌 동결 톰으로 이식된 영역을 통해 조각 또는 cryostat 앞에서 설명한 19.
- 상용 접착제 코팅 슬라이드에 분할 영역을 순차적으로 탑재 (또는 20을 참조). 적어도 하룻밤 건조 허용.
- 얼룩, cresyl 보라색 염료와 슬라이드 및 coverslip 앞에서 설명한 20.
- 이미지 센서의 해 부 위치를 확인 하려면 밝은 분야 현미경 검사 법을 사용 하 여 슬라이드.
4. 행동 코딩
- 보기 무료 상업적으로 다운로드할 수 있는 소프트웨어를 사용 하 여 비디오에 주석을 추가 하 고 (재료의 표 참조) 정확 하 게 코드 동작 시간-amperometric 신호에 잠겨 슬로우 모션에서.
참고: 분석에서 MATLAB 코드를 사용 하 여 (참조 ), 시작 및 끝 각 여성 주석 ' s와 남성 ' s 행동. - 여성 그녀의 dorsoflexion를 시작 하 고 그녀의 꼬리를 위쪽으로 결함 때 프레임에서 주석 startLordosis
- . 여성 여성 테스트 실에서 다른 위치로 readjusts 때 자주 발생 하는이 자세를 종료 되 면 endLordosis 주석.
- 주석을 startAI 여성 절곡 자세에서 이며 남성 여성 쪽으로 그의 주 둥이 이동 ' s anogenital 지역, 스니핑, 사슬, 또는 그녀의 교장의 쾌 감 발생할 수 있습니다. 남성은 여성에 가까운 근접에서 그의 주 둥이 제거할 때 endAI 주석을 ' s anogenital 지역.
- 남성에 접근 하 고 그의 forepaws 마운트 시도 (예를 들어, 측면, 엉덩이)의 방향에 장착 자세에서 여성에 배치 하는 때 startMount를 주석을.
- 주석을 startIntromission 성공적인 밀어 여성에 탑재 된 남성 성 기 액세스를 얻을 때 ' s 질.
참고: 한 수단은 행동 탑재 밀어 남성 가시 그의 몸으로 그의 위 사지를 끌어, 앞으로, 그의 골반을 thrusts 및 침투를 나타내는 그의 꼬리를 위쪽으로 컬로 수단, 이전 발생 하 구별 (참조 < 강력한 클래스 "xfig" = > 그림 4 C).- 해당 하는 경우 주석을 루.
참고: 짝짓기 시 합을에 함께 성공적인 수단, 남성은 사정 됩니다. 하나는 실제 방출 시각화 수, 남자 햄스터는 주석을 발 운동의 발생에 루는 수단 21, 동안 그들의 뒷 발 움직임 속에 따라서 특성.
- 해당 하는 경우 주석을 루.
- 남성과 그의 앞 두 발을 제거 했다 따라서,가 여자와 접촉 하는 때 endIntromission 및 endMount 프레임에 동시에 주석. 시각화를 자주 못하는 때문 그의 철수, 동시 관찰 짝짓기에 걸쳐 일관성과 신뢰성에 대 한 수 있도록 이러한 두 가지 동작이 코드.
참고: 짝짓기 시 합 다음과 성공적인 사정 또는 여성 하나 이상 탑재 다음 절곡 자세 휴식 때.
5. 예제 데이터 분석
참고: 도파민에 대 한 고정 잠재력 탄소 섬유와 효소 녹음의 사용을nd 조미료, 각각, 강장제 및 전기 릴리스의 phasic 패턴을 측정 하는 능력에 대 한 수 있습니다. 이 연구소는 무료, 상업 수집 시스템을 사용 하 고 기록 하 고 변환 소프트웨어 기록 아날로그에서 디지털으로 신호 (바이어스 0.600 V, 샘플링 속도 = 1 Hz).
- 예제 데이터 분석 프로토콜의 설명
- 다른 프로그램을 사용할 수 있지만 계량 강장제 및 MATLAB을 사용 하 여 기록 된 전기 신호에 phasic (과도) 변화.
- 제시 데이터에 대 한 토 닉 신호 50 포인트 이동 평균 필터를 사용 하 여 계산. 신호의 과도 전용 정규화 된 표현 원시 데이터에서 토 닉 신호를 빼서 계산 됩니다. 다양 한 알고리즘 옵션 있다 phasic 봉우리를 식별 하는 경우 (예를 들어, 변경으로 1 보다 더 많은 신호에 봉우리를 라벨 평균 위에 SD).
- 식별이 봉우리, 즉, 로컬 맥시 마의 위치, 정규화 된 신호에서 신호의 제곱 평균 설정 최소 피크 진폭 MATLAB 함수 peakfinder를 사용 하 여. 정규화 된 신호에서 감지 하는 봉우리의 위치에서 각 피크 진폭 추출에 사용 되었다. 와, 또는 상대 피크 neurochemical 조사에서 운전 수 시간 동기 행동의 식별에 대 한 봉우리를 검색할 수 있습니다.
- 행동 주석 (3 단계 참조)에 따라 처리 된 데이터 세그먼트, 학생 ' s t-테스트 토 닉 신경 전달 물질 수준, 과도의 발생의 진폭의 차이 평가 하는 데 사용 했다 복싱 짝짓기 하는 동안 절곡 대 절곡 미리 짝짓기 시 합 중의 과도 전기 방출의 토 닉 패턴에 변화를 측정, 하 절곡 위치 (즉, 미리 짝짓기 시 합 lordosis) 짝짓기 시 합 전에 직접 동안 발생 하는 데이터 요소 짝짓기 시 합 중 데이터 요소에 비교 했다 t-테스트를 사용 하 여 세션
- 다른 프로그램을 사용할 수 있지만 계량 강장제 및 MATLAB을 사용 하 여 기록 된 전기 신호에 phasic (과도) 변화.
- 설명된 데이터 분석 프로토콜에 대 한 원시 데이터의 준비
참고: 명시 된, 있지만 다른 프로그램 또는 분석 될 수 있습니다 동등 하 게 가능한 옵션, 위에서 설명한 MATLAB 코드를 사용 하려면 원시 데이터를 준비 해야 합니다에 다음과 같은 방법으로:- 주석 및 전압 파일 내보내기. 이렇게 하려면, 아래는 ' 파일 ' 탭을 선택은 ' 수출 ' 작동 하 고 선택는 ' 주석 ' 주석을 저장을 탭. 아래는 ' 파일 ' 탭을 선택은 ' 수출 ' 작동 하 고 선택는 " TSV ' 전압 측정 TSV 확장 파일로 저장을 탭.
- 스프레드시트 프로그램으로 각 파일 열기 및 다른 이름으로 저장 ' xls/xlsx ' 파일 MATLAB과 호환 수 있도록.
: 참고는 ' 주석 ' 파일, 추가 수동으로 해야 하는 주석 추가 후 수출 스프레드시트 프로그램을 시작 및 끝 (PreMBlordorsis 주석이 달린 두는 미리 짝짓기 시 합 절곡의 지시에 )와 짝짓기 시 합을 했 듯이이 시간 포인트 직접 비교 될 수 있다 단계에서 5.1.2. - 절곡 동작 또한 (startLordosis)을 시작으로 동시에 미리 짝짓기 시 합 절곡 (startPreMBlordosis)의 시작 주석을 탑재 동작을 포함 하 고 또한 새로운 것의 시작에 짝짓기 가릴 경우 여성 절곡 자세 유지.
- 시작 처음 탑재 될 때 미리 짝짓기 시 합 절곡 (endPreMBlordosis)의 끝에 주석을.
- 이 짝짓기 시 합 시작을 의미 하는 대로 endPreMBlordosis의 동시에 짝짓기 시 합 (startMB)의 시작을 주석을.
- 는 탑재 루를 포함 하는의 끝에 짝짓기 시 합 (endMB)의 끝에 주석을 (단계 4.1.4.1 참조), 또는 다음 여성 ' 절곡 자세 (endLordosis)의 s 종료.
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Representative Results
전기 화학 및 코딩 방법론 위에서 설명한 동작을 사용 하 여,이 연구소는 vivo에서 성적인 행동의 기록 중 토 닉과 도파민에 조미료 phasic 변동 특성 하기 시작 했다. 이 방법론의 일시적으로 정확한 방식으로 인해 우리 보다 정확 하 게 성적인 행동; 동안 neurotransmission을 특성 수 있습니다. 뿐만 아니라 개별 copulatory 동작 (예를 들어, 수단, 사정)의 여성의 접수 기간 동안 짝짓기 관찰 하 고 해당 과도 변동 하는 동안 해당 토 닉 변경 릴리스 패턴에 특정 변화를 돌리다 장착 남성.
특히, 우리는 도파민과 별도 동물의 NAc에 조미료의 릴리스 패턴 측정에 초점이 방법론을 사용 합니다. NAc22 처리 보상에 관련 된 중요 한 지역 이며, 성적 행동23의 보상 측면에 필수적인 영역으로 설명 하고있다.
우리는 성적 행동, 동안 여성 복싱 (그림 5) 짝짓기 하는 동안 NAc 코어에서 dopaminergic 수준에서 토 닉 증가 보여 관찰 했다. 이 토 닉 변경 하는 동안 모든 짝짓기 복싱에 대 한 표시 위에서 설명한 방법론 수 측정 각 짝짓기 시 합 사이 토 닉 변경 하 고 따라서 토 닉 레벨에 걸쳐 신경 전달 물질 방출의 전체 변경의 임시 id를 증가 전체 세션입니다. 또한,이 기술된 방법론 phasic 변화를 정확 하 고 일시적으로 이러한 phasic 신경 전달 물질 변동 가능성이 연관 동작을 지도 수 있습니다. 특히, 이러한 예비 결과 복싱, 짝짓기 하는 동안은 NAc에서 dopaminergic 과도 발생 질 삽입 (수단) 남성 (그림 6)에 의해 것이 좋습니다. 또한, 수단으로이 협회는 특정 AI 같은 다른 copulatory 동작을 무시할 수 dopaminergic 응답.
유사한 패턴은 조미료 릴리스, 빠른 과도 등 NAc에서에서 개별 intromissions에 해당 하는 (그림 7) copulatory 시 합 중에 관해서는 다른 동물에서 관찰 되었습니다. 이 패턴은 NAc 셸 또는 다른 동물의 꼬리가 중간에 발생 없이 뚜렷한 신호 특정 지역.
그림 1 : 효소 바이오 센서 기술.
상업적으로 이용 가능한 효소 바이오 센서 프로브 효소 중재 처리 (왼쪽된 이미지)를 통해 신경 전달 물질을 검출 하는의 표준 제작. Glutamatergic 센서의 경우 조미료 산화 효소는 효소 레이어 (오른쪽 이미지)에서 electroactive 과산화 수소 (H2O2) 산화에 의해 감지 되는 nonelectroactive 신경 전달 물질 변환에서 근무를 백 금-이리듐 (Pt-Ir) 전극. Ascorbic 산 (AA)는 동일한 잠재력에 산화 하는 일반적인 interferent nonelectroactive 물에 있는 interferent를 변환 하는 효소 계층에서 AA 산화 효소의 추가 통해 제외 됩니다. 두뇌에 있는 다른 부정적인 electroactive interferents 수동 선택적 막 통해 제외 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 시 합 짝짓기 햄스터의 구성 요소.
햄스터에는 여성에에서 남아 움직이지 절곡 자세 남성 anogenitally (A)조사 하 고 (B)를탑재 하 고, 수단 를 달성 하는 동안 copulatory 동작의 시퀀스 짝짓기 시 합에 의하여 이루어져 있다 (C). . 한 수단은 행동으로 남성 그의 몸으로 그의 위 사지를 끌어 장착 구별 thrusts 그의 골반을 앞으로 그리고 위쪽으로, 침투를 나타내는 그의 꼬리를 컬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 두개골 모자 건축.
가이드 cannulae, 뼈 나사, 그리고 치과 아크릴 탄소 섬유 또는 효소 프로브 삽입을 허용 하도록 두개골 모자의 건설에 사용 되는 (stepwise 자세한15 참조). 이 수치는 효소 센서 (이식된 참조 전극) 및 센서 안정성에 대 한 플라스틱 헤드 마운트 오른쪽 NAc 통해 단일 정 임 플 란 트를 묘사 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 조미료 바이오 센서 캘리브레이션.
조미료를 각 바이오 센서의 감도 테스트 있다 생체 외에서 37 ° C에서 조미료 (녹색)의 10 µ m 추가 하 여 실험 녹음 하기 전에 (이후 효소 활동은 온도 의해 영향을 받습니다). 각 센서 비 의약품 (AA, 레드) 또는 도파민 (DA; 블루) 응답을 확인 합니다. 이 교정 변화 조미료 농도 변화 실험 기록 중 본 amperometric 신호에 변환 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 토 닉 짝짓기 시 합 중에 도파민 증가.
A. 한판 절곡 신호 짝짓기 시 합 절곡 신호. 대 premating의 Stylized 예 토 닉 도파민 방출 측정, 하 절곡 짝짓기 시 합 (MB) 전에 동안 도파민 수준에 amperometric 응답 그는 MB 중 비교 되었다. 회색 상자는 MB 전에 절곡을 나타냅니다. Blue 상자는 MB 중 절곡을 나타냅니다. B. preMB 절곡 절곡 MB 사이의 평균 전압을 비교 하는 하나의 동물에서 대표적인 정량화. 오차 막대 (SEM), 의미의 표준 오류 나타내고 별표 나타냅니다 중요 한 차이 (p-값 < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 대표 도파민 추적.
Phasic 릴리스 도파민의는 시간 동기 intromissions 하는 등 NAc에서 남성 에서입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 대표 조미료 추적.
조미료 과도 확장된 성적 경험 동안는 등 NAc에서 남성에서 개별 intromissions에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
비록 비교적 간단 하 고,이 기술을 채용 하는 경우 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 첫째, 조사의 stereotaxic 배치 정확 해야: microdialysis 샘플 조사를 둘러싼 extracellular 환경에의 더 넓은 반경, 달리이 기술은 허용 직접 접촉으로 오는 신경 전달 물질의 측정 와 조사. 둘째, 섬유의 작은 폭으로 인해 탄소 섬유 녹음의 경우 파손 발생할 수 있습니다, 그리고 신중한 주의 프로브를 삽입 해야 합니다. Glutamatergic 바이오 센서의 경우 효소 저하는 프로브 3 주 보장된 기간 내 사용 하지 않은 경우 발생할 수 있습니다. 다행히도, 이러한 모든 문제는 주소 지정, 그리고 적절 한 주 및 세부 사항에 주의 함께 삭제 될 수 있다.
잠재적으로 문제가 있는 경고 고정 잠재력 탄소 섬유 녹음의 특이성에 발생합니다. 녹음은 모두 신경 전달 물질을 릴리스 하는 영역에서 만들어진 경우 도파민에 대 한 적용된 가능성 노르, 같은 다른 monoamines와 일치 하기 때문에 화학 특이성의이 부족 보다 제한할 수 있습니다 결과의 해석. NAc에서이 주요 문제, 기본 카 테 콜 아민 송신기24되 고 도파민 포즈를 하지 않습니다. 때문에 대략 NAc에 세포의 98% dopaminergic neurotransmission24에 응답 하는 중간 가시 뉴런, 신호 도파민의 감지 쪽으로 치우친이 더 턴-키 방식의 사용을 촉진 한다.
이 효소 바이오 센서 및 고정 잠재력 탄소 섬유 녹화 시스템의 또 다른 혜택은 듀얼-프로브 녹음 수행 수 electroactive와 nonelectroactive 신경 전달 물질 도파민 등 조미료를 측정할 수 있도록 동시에 같은 동물. 여기에 제시 된 데이터는 별도 동물에 녹음에서 온, 하지만 이러한 기술은 사용할 수 있습니다 동시에 되도록 하나 양측 neurotransmission 여러 두뇌 지구에서 또는 동일한 지역에서의 컨버전스를 평가할 수 있다. 같은 동물 내 녹음의 조합 또는 동물 같이, 걸쳐 녹음의 비교는 elucidating 네트워크 연결 뒤에 메커니즘 및 신호에 모두 강력한 도구입니다.
합계에서는,이 종이는 효소 바이오 센 싱 및 여러 electroactive 및 nonelectroactive 신경 전달 물질 단일 실험적인 체제를 활용 하 여 측정 하 고정 잠재력 기록의 강력한 기술을 보여 줍니다. 데이터가 여기에 제시 된 개별 신경 녹음에서 여러 동물에 걸쳐, 하지만이 시스템 한 동물에 최대 4 개의 센서에서 기능을 제공 하는 동시에15. 총체적으로 제시 하는 샘플 결과 남성에서 copulatory 자극의 특정 패턴에서 발생 하는 여성 햄스터 빠른 neurotransmission에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 또한, 이러한 실험 입증 여성의 NAc 핵심에서 dopaminergic과 glutamatergic 과도의 시간 동기 응답 수단을이 릴리스 인코딩의 고유한 보람 속성에 대 한 책임이 있을 수 있습니다 제안, 남자에서 성적 행동입니다. 우리의 목표는 vivo에서 도파민 및 조미료 릴리스 copulatory 자극의 개별 구성 요소에 기본 회로의 관계의 더 포괄적인 그림을 개발 하 여 시리아 햄스터의 짝짓기 패턴을 활용 하 여 계속 하 남자. 우리는 이러한 신경 전달이 물질의 패턴을 특성화 하는 기능 뿐만 아니라 유리 하다는 기본적인 과학 관점23, elucidating 보상 동작 등의 병 적인 형태에 대 한 잠재적인 치료 접근에서 뿐만 아니라 생각 으로 마약 중독25.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 다니엘 한미 Matlab 코드를 실행 하는 그의 도움에 대 한 학부 및 학부 알렉스 Boettcher 행동 실험 실행에 그의 원조에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 프로젝트는 NSF IOS 1256799 R.L.M.에 의해 및 보너스 번호 T32DA007234에서 국립 보건원의 약물 남용에 국가 학회에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nembutal | Oak Pharmaceuticals Inc. | 76478-501-50 | Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally. |
| Loxicom analgesic | Norbrook Laboratories | 6451603670 | NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. |
| Enroflox antibiotic | Norbrook Laboratories | 5552915411 | Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin. |
| Beuthanasia-D | Merck Animal Health | 00061047305 | Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent. |
| Bone screws | Pinnacle Technologies, Inc. | 8111-16 | 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. |
| Dental acrylic (Bosworth Duz-All) | Bosworth | 166261C | Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull. |
| Hardware biosensor setup | Pinnacle Technologies, Inc. | 8400-K2 | Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system |
| Base video computer package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K1 | The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. |
| Video EQ700 EverFocus camera package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K10 | EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. |
| Sirenia Acquisition software | Pinnacle Technologies, Inc. | Free--available to download from pinnaclet.com | Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review. |
| Tethered rat in vitro calibration kit | Pinnacle Technologies, Inc. | 7000-K2-T-BAS | In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). |
| Stir plate | Corning | 6795-410D | Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors. |
| Water bath capable of closed loop circulation | PolyScience | 8006A11B | PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. |
| Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae | Pinnacle Technology, Inc. | 7002-CFS | Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission. |
| Ag/AgCl reference electrode | Pinnacle Technology, Inc. | 7065 | Necessary for carbon fiber recordings. |
| Glutamate biosensors | Pinnacle Technology, Inc. | 7001 | Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission. |
| BASi guide cannulae | Pinnacle Technologies, Inc. | 7030 | Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe. |
| BASi cannula plastic headpiece for rats | Pinnacle Technologies, Inc. | 7011 | Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat. |
References
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