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Methodenartikel

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

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DOI:

10.3791/56171

⸱

20. August 2017

 ,  , 
1Unitat de Biologia Cellular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, um effizient leiten und Kultur pluripotenten Stammzelllinien aus Maus-Embryonen im Blastozystenstadium.

Zusammenfassung

Maus embryonalen Stammzellen (mESC) Ableitung ist der Prozess, durch welche, den pluripotenten Zelllinien aus preimplantation Embryos ansässig sind. Diese Zeilen erhalten die Möglichkeit, entweder selbst zu erneuern oder unter bestimmten Bedingungen zu unterscheiden. Aufgrund dieser Eigenschaften mESC sind ein nützliches Werkzeug in der regenerativen Medizin, Krankheit Modellierung und Gewebe Ingenieurstudium. Dieser Artikel beschreibt ein einfaches Protokoll mESC Linien mit hoher Ableitung Wirkungsgraden (60-80 %) erhalten durch Kultivierung Blastozysten von freizügigen Mausstämme Feeder-Zellen in definierten Mediums mit Leukämie hemmenden Faktor ergänzt. Das Protokoll kann auch angewendet werden um effizient mESC Linien nicht freizügig Mausstämme, abgeleitet durch die einfache Zugabe von einem Cocktail aus zwei kleine Molekül-Inhibitoren auf die Ableitung Medium (2i Medium). Einzelheiten über die Vorbereitung und die Kultur der Feeder-Zellen, Sammlung und Maus-Embryonen und Ableitung und Kultur mESC Linien stehen zur Verfügung. Dieses Protokoll erfordert keine speziellen Ausrüstung und kann in jedem Labor mit grundlegenden Säugerzelle Kultur Expertise durchgeführt werden.

Einleitung

Embryonale Stammzellen (ESC) sind pluripotente Zellen aus Präimplantations Embryonen, die behalten die Fähigkeit, selbst zu erneuern oder unter bestimmten Bedingungen1zu unterscheiden. Basierend auf diesen Eigenschaften, ESC sind ein nützliches Werkzeug für die regenerative Medizin, Krankheit Modellierung und Tissue engineering Studium2geworden.

ESC wurden zum ersten Mal von Präimplantationsdiagnostik Mäuseembryonen, mit ESC (mESC) Mauslinien mit geringen Erfolg3,4Ursprung abgeleitet. Jahrelang blieb der Herleitung Wirkungsgrad niedrig wegen der Schwierigkeit der Aufrechterhaltung der Pluripotenz in Vitro. Außerdem das Vorhandensein von Feeder Zellen5, die Ableitung effizienter zu gestalten, Kolonie Anlage fördern und verbessern karyotypic Stabilität6, einige Modifikationen von den Protokoll führen zu einer Verbesserung der Pluripotenz Wartung. Die wichtigsten waren die Zugabe von Leukämie hemmenden Faktor (LIF), mESC Kulturmedium7,8, die Verwendung von Embryonen aus dem 129S2 permissive Hintergrund9 und die Kultur der mESC mit Medium ergänzt mit definierten Serum, frei von möglichen Differenzierung Faktoren10. Vor kurzem hat zwingende Beweise gezeigt, dass Zusatz von einem Cocktail aus zwei kleinen Molekül-Modulatoren der Signalwege, die mESC Kulturmedium (bekannt als 2i) am besten, Pluripotenz beizubehalten. Die 2i cocktail besteht aus einer Kombination von MEK-Inhibitor PD0325901, die die Differenzierung Signale reduziert durch die Hemmung des Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) Weges, und der GSK3β-Inhibitor CHIR99021, die Zelle Überleben bei geringer Dichte verbessert durch die Aktivierung der Wnt-Signalweg-11.

In diesem Artikel beschreiben wir ein einfaches Protokoll um effizient mESC Linien von Maus Blastozysten abzuleiten. Wir folgen Standardverfahren, Kultivierung der Embryonen von freizügigen Belastungen für Feeder-Zellen in Ableitung Medium mit LIF und ein Serum-Ersatz-12ergänzt. Nach diesem Protokoll mESC Linien kann mit Wirkungsgraden Äquivalent zu denen, die in 2i Medium abgeleitet werden. Trotzdem können 2i hinzugefügt werden, um mögliche Probleme mit Pluripotenz Wartung oder beim Arbeiten mit nicht-freizügigen Belastungen zu vermeiden.

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Protokoll

die Verwendung von Tieren, die in den folgenden Abschnitten beschriebenen genehmigt wurde, durch die Ethikkommission für Tier- und Human Research von der Universitat Autònoma de Barcelona und Handelsverträge d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca ich Alimentació von der Generalitat de Catalunya (Protokoll #8741).

1. Feeder Zelle Inaktivierung und Lagerung

Hinweis: menschliche Vorhaut Fibroblasten (HFF-1) in 1 mL eiskalte Lösung bestehend aus 90 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 10 % Dimethyl Sulfoxid (vorher eingefroren wurden DMSO) und in flüssigem Stickstoff bis zum Gebrauch gespeichert.

  1. Auftauen eine kryogene Phiole der HFF-1 (1 mL) durch das Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad eintauchen.
  2. Vorgewärmt Dulbecco den aufgetauten Inhalt der kryogenen Durchstechflasche hinzufügen ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % FBS zu einem 01:10 Verdünnung.
  3. Saatgut die verdünnten Zellen (10 mL) in einem T75 Kolben und Kultur sie bei 37 ° C und 5 % CO 2.
  4. Am nächsten Tag ändern das Medium, die DMSO-Reste zu beseitigen. Entfernen Sie das Medium und 10 mL vorgewärmten DMEM mit 10 % ergänzt FBS.
  5. Kultur der HFFs und das Medium alle 48 h verändern, bis die Kultur der konfluierende Stadium erreicht. Dies dauert etwa 7 bis 10 Tage.
  6. , Bereiten Sie die Inaktivierung Lösung verdünnen Mitomycin C in DMEM mit 10 % ergänzt FBS auf eine Endkonzentration von 10 µg/mL. Inkubation der Zellen mit der Inaktivierung Lösung für 3 h bei 37 ° C und 5 % CO 2.
  7. Die Inaktivierung Lösung entfernen und spülen Sie die Zellen dreimal mit 2 mL von Hanks ausgewogen Salz Lösung (HBSS), Mitomycin C Reste zu beseitigen.
  8. Um die inaktivierten Zellen zu entfernen, fügen Sie 1 mL vorgewärmten Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° C und 5 % CO 2.
  9. Beobachten die Zellen unter einem inversen Mikroskop um sicherzustellen, dass sie getrennt (10 X Objektiv mit 0,3 numerische Apertur oder NA). Wenn sie nicht sind, brüten sie für ein paar Minuten bei 37 ° C und 5 % CO 2. Überprüfen Sie die Zellen wieder unter die inversen Mikroskop.
  10. Die Lösung mit einer Pasteurpipette pipette, um die Zelle Klumpen zu distanzieren.
  11. Neutralisieren die enzymatische Lösung durch Zugabe von 4 mL DMEM mit 10 % FBS und Aufschwemmen ergänzt.
  12. Ein Aliquot der Zellsuspension und machen eine 1: 100 Verdünnung in HBSS. Um die Anzahl der Zellen zu bestimmen, laden 10 µL der Verdünnung in einer Neubauer ' s-Kammer. Zählen der Zellen in einer der großen Plätze der Kammer unter einem inversen Mikroskop (20 X Objektiv mit einem 0,45 NA).
    1. Wiederholung die Zählung in insgesamt vier große Quadrate. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen (N) n = durchschnittliche Anzahl von Zellen gezählt x Gesamtvolumen x Verdünnung X 10 4.
  13. Zentrifugieren dem Rest der Probe für 5 min bei 200 X g. verwerfen den Überstand und Aufschwemmen der Pellets mit dem Einfrieren Lösung mit einer Konzentration von 10 6 Zellen pro mL.
  14. Aliquot Suspension in kryogenen Fläschchen mit 10 6 Zellen (1 mL) jeder. Die kryogenen Fläschchen in einem eiskalten Behälter legen und Einfrieren bei-80 ° c
  15. Am nächsten Tag speichern die kryogenen Fläschchen in Flüssigstickstoff.

2. Feeder-Zellkultur

  1. bis zu vier Tage vor der Ableitung, Tauwetter eine kryogene Fläschchen mit 1 x 10 6 inaktiviert HFF-1-Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° c
  2. Stellen eine Verdünnung von 1:6 des aufgetauten HFF-1 in DMEM ergänzt mit 10 % FBS und halten die Temperatur bei 37 vorgewärmt ° c
  3. Jeder Brunnen ein 4-Well-Platte mit 500 µL vorgewärmten 0,2 % Gelatine aus Schweinehaut füllen und halten Sie die Platte bei 37 ° C für 10 min.
  4. 500 µL von Gelatine aus den Brunnen zu entfernen und fügen Sie 500 µL HFFs-Verdünnung. Schütteln Sie die Platte, um eine gleichmäßige Verteilung des HFFs auf der Unterseite der Brunnen zu gewährleisten. Vermeiden Sie Kreisbewegungen, sonst werden die Zellen in der Mitte des Brunnens konzentrieren.
  5. Inkubieren die Platte mindestens 24 h bei 37 ° C und 5 % CO 2 eine Monolage von inaktivierten HFFs in jede Vertiefung erhalten.
  6. Am nächsten Tag die Zellen unter einem inversen Mikroskop (10 X-Objektiv mit 0,3 NA) beobachten und überprüfen, dass sie befestigt und homogen verteilt. Ändern Sie das Medium, um die DMSO-Reste zu beseitigen. Entfernen Sie das Medium und fügen 500 µL vorgewärmten DMEM mit 10 % ergänzt FBS.

3. Embryo-Sammlung und Kultur

  1. vier Tage vor dem Embryo Sammlung verwalten 5 IU trächtige Stute ' s Serum Gonadotropin durch intraperitoneale Injektion, 6-12 Wochen alten weiblichen Mäusen.
    Hinweis: Wir haben Weibchen aus dem 129S2 oder B6CFAF1 Stämme verwendet, obwohl Weibchen aus anderen Mausstämme verwendet werden können. Dennoch, wenn arbeiten mit Weibchen aus non-permissive Stämme (z. B. CBA), Medium sollte ergänzt werden mit 2i wie unter Schritt 4.2.
  2. Nach 48 h, 5 IE humanes Choriongonadotropin durch intraperitoneale Injektion verabreichen und paaren sich die Weibchen mit Männchen, mindestens 8 Wochen alt, im Verhältnis 1:1. Die Weibchen von den Männchen am nächsten Tag trennen.
  3. Am Vortag Embryo Sammlung, vorbereiten eine 35-mm-Zellkultur Petrischale mit mehreren 40 µL Tropfen des KSOMaag Mediums ergänzt mit 4 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) und füllen die Platte mit Mineralöl, die Tropfen in vollem Umfang abdecken. Inkubieren Sie die Schüssel bei 37 ° C und 5 % CO 2 auf das Medium equilibrate.
  4. Embryo Manipulation Pipetten, Vorbereitung erhitzen den dünneren Teil eines langen Spitzen Glases Pasteurpipette mit dem Bunsenbrenner. Sobald weich, die Flamme entziehen Sie und ziehen Sie die beiden Enden auseinander. Brechen sie auf die gewünschte Länge. Der innere Durchmesser an der Spitze sollte 100-150 µm.
  5. Einschläfern der weiblichen Mäusen durch zervikale Dislokation 45-48 h Post Coitum (p.c.).
  6. Sezieren die Mäuse um die Bauchhöhle verfügbar machen, indem die Haut mit einer gebogenen glatt scharfen Schere und das Bauchfell mit gerade scharfen Schere schneiden. Eine Gebärmutter mit Zange greifen, die Eileiter mit gerade scharfen Schere abgeschnitten und legen Sie sie in Hepes gepufferten CZB Medium (HCZB) 13 bei 37 ° c wiederholen Sie den Vorgang, der andere Eileiter entfernen.
  7. Flush die Eileiter mit einer 1 mL Spritze mit HCZB geladen gehalten von Uhrmacher-Pinzette, die 2 Zellen Embryonen zu sammeln.
    Hinweis: Um der Spülung Nadel nehmen eine 30 G Injektionsnadel vorzubereiten, schneiden Sie das Ende und zu einer stumpfen Spitze auf einem Schleifstein geschliffen.
  8. Mit der Mund-Pipette-Apparat, die Embryonen abholen, waschen Sie sie in HCZB und Kultur sie in der Kulturschale vorbereitete Embryo bei 37 ° C und 5 % CO 2 bis zum Blastozystenstadium. Bis zu 50 Embryonen können in jedem Tropfen 40 µL kultiviert werden. Überwachen der Embryonalentwicklung alle 24 h unter einem Stereomikroskop.
    Hinweis: Alternativ können Embryonen im Blastozystenstadium in Vitro Embryonenkultur verkürzen gesammelt werden. In diesem Fall einschläfern Sie den Weibchen am Tag 3,5-4,5 p.c., sezieren Sie die Gebärmutter zu. und spülen Sie es mit HCZB.

4. Stem Cell Ableitung

  1. Vorbereitung der Ableitung Platten
    1. am Tag der Embryo Aussaat, bereiten die Ableitung Medium durch Ergänzung DMEM Medium mit 100 µM 2-β-Mercaptoethanol, 1 x nicht-essentiellen Aminosäuren , 20 % der Serum-Ersatz und 10 3 U/mL LIF.
    2. Auf Wunsch auch hinzufügen 1 µM von der MEK-Inhibitor PD0325901 und 3 µM GSK3-Inhibitor CHIR99021 2i Medium zu erhalten.
    3. Nehmen die 4-Well-Platte mit der Monolage von inaktivierten HFFs (Schritt 2,6) von der Inkubator. Entfernen Sie das Medium und jedes gut fügen Sie 800 µL vorgewärmten Ableitung Medium hinzu. Die Platte in den Inkubator zurück.
  2. Zona Pellucida Entfernung und Embryo Aussaat
    1. Vorbereitung eine 35 mm-Zellkultur Petrischale mit drei 30 µL Tropfen der sauren Tyrode ' s Lösung 14 und drei 30 µL Tropfen Ableitung Medium. Decken die Tropfen mit Mineralöl und halten Sie die Schüssel bei 37 ° c
    2. Nehmen die Embryo-Kulturschale aus dem Inkubator. Eins nach dem anderen, übertragen die Blastozysten von Kultur-Tropfen auf einen sauren Tyrode ' s Lösung Tropfen mit einem Embryo Manipulation Pipette. Wenn möglich, wählen Sie nur die erweiterte Blastozysten um die Ableitung zu starten.
    3. Überwachen die Zona Pellucida Verdauung unter dem Stereomikroskop. Sobald die Zona Pellucida verschwindet, übertragen die Blastozyste zu einer Ableitung Mittel um die sauren Tyrode auszuwaschen ' s Lösung.
    4. Nehmen die Ableitung 4-Well Platte aus Inkubator und Samen einer Zona-freie Blastozyste auf die Zuführung Zellen in jedem Bohrloch.
    5. Rückkehr die Ableitung 4-Well-Platte zum Inkubator und Kultur bei 37 ° C und 5 % CO 2.
  3. Monitoring Stammzellen Wachstum und Medium ändern
    1. Kulturen alle 24 h unter einem inversen Mikroskop (20 X Objektiv mit 0,45 NA) zu überwachen. Es ist wichtig zu beachten, ob es Anzeichen von Stammzell-Differenzierung, z. B. geschwollenen refraktiven Zellen rund um den Auswuchs oder sogar schieben die Zuführung Zellen beiseite.
    2. Jeden zweiten Tag, das Medium der Kultur verändern. Nehmen Sie die 4-Well-Platte aus dem Inkubator, entfernen Sie das Medium aus jedem Bohrloch und fügen Sie 800 µL vorgewärmten Ableitung Medium ergänzt mit LIF und 2i, hinzu, wenn verwendet. Pflegen die Kultur bis Auswüchse (6-8 Tage) eingehalten werden.

5. Stammzelle-Kultur und Wartung

  1. Prepare Kolle-ähnliche Griffe und Stammzellen Manipulation Pipetten. Folgen Sie Schritt 3.4 vorzubereitende Stammzell-Manipulation Pipetten mit einem Innendurchmesser an der Spitze von 250-300 µm. verwenden andererseits zog Pasteurpipette Kolle-ähnlichen Griff vorzubereiten. Erhitzen und gestalten Sie es bis zum Erreichen eines Hakens.
  2. Kultur 4-Well-Platte aus dem Inkubator nehmen und zu den Auswuchs unter einem Stereomikroskop suchen. Verwenden Sie den Griff um die differenzierte Zellen und die Anleger, die den Auswuchs umgeben wegzudrücken.
    Hinweis: Zur Vermeidung von eventuellen Differenzierung der Auswuchs ist es wichtig, die differenzierte Zellen vom Rand der Auswuchs entfernen.
  3. Auswuchs mit einer Stammzelle Manipulation Pipette abzusaugen und legen Sie sie in ein neues Gericht in einem 50 µL Trypsin-EDTA Tropfen.
  4. Verwenden ein Skalpell zu den Auswuchs in mehrere Teile geschnitten, um es sowohl mechanisch als auch enzymatisch disaggregieren.
  5. Sofort, übertragen die Auswuchs Fragmente zu einem frischen Tropfen Ableitung Medium Trypsin Aktion neutralisieren.
  6. Übertragen die Auswuchs Fragmente auf einen neuen 4-Well-Platte mit einem monomolekularen Film Feeder. Übertragen Sie bis zu 10 Fragmente pro Bohrloch und Kultur sie mit Ableitung Medium bei 37 ° C und 5 % CO 2.
  7. Pflegen die Stammzell-ähnliche Kulturen für mindestens sechs Wochen vor der Prüfung der mESC-Linie gegründet. Das Medium verändern, jeden anderen Tag und Subkultur ihnen einmal pro Woche.

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Ergebnisse

Nach diesem Protokoll sollte mehr als 95 % der Auswuchs Bildung nach der ersten Woche der Kultur (Abbildung 1A) erreicht werden. MESC Linien nach sechs Passagen sind Variable unter experimentellen Wiederholungen mit eine durchschnittliche Erfolgsquote von 60-80 %. Die Zugabe von 2i deutlich verbessert nicht die Ergebnisse bei der Arbeit mit freizügigen Mausstämme, z. B. mit einem 129S2 Hintergrund, aber es ist notwendig, bei der Arbeit mit nicht-freizügigen S...

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Diskussion

Obwohl mESC Linie Ableitung ein bekannter Verfahren routinemäßig in vielen Laboratorien eingesetzt wird, ist der Wirkungsgrad nicht immer so hoch wie erwartet aufgrund der multiplen Faktoren, die Aufrechterhaltung der Pluripotenz stören können. In diesem Artikel zeigen wir Schritt für Schritt, wie man mESC Linien mit hohen Wirkungsgraden über ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zu etablieren. Diese Effizienz sind ähnlich denen in der Literatur beschrieben.

Um maximale Effizienz zu gewähr...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken Jonatan Lucas für seine technische Unterstützung mit Feeder-Zellkultur, Servei Estabulari De La UAB für Tierpflege und Domènec Martín für die Videoaufnahme. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R und Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC ist ein PIF-UAB-Stipendium.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL SryringBD 
2-β-mercaptoethanolLife Technologies31350-010
4-Well-PlatteThermo Scientific Nunc176740
Saure Tyrodenlösung HausgemachtSiehe Rezept in Nagy et al., 2003. Für die kurzfristige Lagerung (bis zu 1 Monat) halten Sie es bei 4 °C. Alternativ können Sie es für die Langzeitlagerung bei -20 °C aufbewahren. Wenn die Wirksamkeit der Lösung abnimmt, sollte sie durch Zugabe eines kleinen Tropfens HCl 1M angesäuert werden.
BSASigmaA3311
Hühner-Anti-Maus-IgG, Alexa Fluor 488Molekulare Sonden - InvitrogenA-212001:500 Verdünnung. Sekundärer Antikörper für Oct4, Tuj1, αSMA- und AFP-Maus-Antikörper. 
CHIR990212Axon Medchem 1386Rekonstituieren Sie mit 2,15 ml DMSO pro mg Pulver, um eine 1 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie das gewünschte Volumen und lagern Sie es bei -20 °C. Vermeiden Sie Gefrier- und Auftauzyklen.
CryoTubeThermo Scientific Nunc3754518
DMSOSigma41640
DMEMBioWestL0107
FBSBioWestS1810Vor Gebrauch durch Erhitzen für 30 Minuten bei 56°C inaktivieren. Aliquotieren und bei -20°C lagern; C
SpülnadelBD 304000Das Ende der Nadel abschneiden und auf einem Schleifstein bis zur stumpfen Spitze zerkleinern
Gelatine aus SchweinehautFluka48724Bei 0,2 % in destilliertem Wasser verdünnen und autoklavieren. Jede Verdünnung kann einen Monat lang verwendet werden.
Ziege Anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 594Molekularsonden - InvitrogenA-110371:500 Verdünnung. Sekundärer Antikörper für Sox2-Kaninchen-Antikörper.
HBSSBioWestL0611
Hepes-gepuffert CZB HausgemachtSiehe Zusammensetzung in Chatot et al., 1989
Humanes ChoriongonadotropinDivasa-FarmavicVeterin-Corion 3000 UIVerdünnt in NaCl 0,9% bei 50 IE/ml. Aliquotieren Sie es in 1 ml und lagern Sie es bei -20μg; C für bis zu zwei Monate. Nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren.
Humane VorhautfibroblastenATCCATCCSCRC-1041Für die Langzeitlagerung wird empfohlen, sie in flüssigem Stickstoff zu lagern.
KnockOut Serum ReplacementLife Technologien  10828-028Lichtempfindlich. Es wird empfohlen, es in kleinen Volumina wie 10 ml zu aliquotieren und bei -20° ordm zu lagern; C (Überprüfen Sie das Ablaufdatum). Vermeiden Sie Frost- und Auftauzyklen.    
KSOMaag EvolveZenith BiotechZEKS-050Supplement mit 4 mg/ml BSA. Äquilibrieren bei 37° ordm; C und 5% CO2 pro Tag vor der Anwendung.
Leukämie-HemmfaktorMerk MilliporeESG1106
Mäuse Charles River/HarlanEs wird empfohlen, Mäuse aus einem permissiven Stamm in Bezug auf die mESC-Ableitung (z. B. 129S2 oder C57BL) zu verwenden. Inzuchtstämme sind jedoch weniger effizient bei der Produktion von Embryonen. Daher wird empfohlen, einen Hybridstamm wie 129S2 x C57BL oder B6CBAF1 zu verwenden, um die Vorteile der Hybridkraft zu nutzen.
MineralölSigmaM8410Embryo getestet. Lichtempfindlich. 
Mitomycin CServa2980501Rekonstituieren Sie das Pulver mit MilliQ Wasser in einer Menge von 0,5 mg/ml. Bei 4 μm lagern; C vor Licht geschützt. Achtung, es ist schädlich und steht im Verdacht, Krebs zu verursachen.
Maus Anti-Tubulin Β III (Tuj1)BiolegendMMS-435P1:500 Verdünnung
Maus monoklonal anti-αSMASigmaA52281:200 Verdünnung
Maus monoklonal anti-AFPR& D SystemsMAB13681:50 Verdünnung
Maus monoklonal anti Oct3/4 Santa CruzSc-52791:50 Verdünnung
Nicht-essentielle AminosäurenLife Technologies11140-035
PD0325901Axon Medchem 1408Rekonstituieren Sie mit 2,08 ml DMSO pro mg Pulver, um eine 1 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie das gewünschte Volumen und lagern Sie es bei -20 °C. Vermeiden Sie Gefrier- und Auftauzyklen.
Petrischale (35 mm)Thermo Scientific Nunc153066
Petrischale (60 mm)Thermo Scientific Nunc150288
Serum für trächtige Stuten GonadotropinFoligonFoligon-1000 UIIn NaCl 0,9 % bei 50 I.E./ml verdünnen. Aliquotieren Sie es in 1 ml und lagern Sie es bei -20 I.E.; C für bis zu zwei Monate. Nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren.
Kaninchen poliklonales Anti-Sox2Merck MilliporeAB56031:200 Verdünnung
T75 FalkeThermo Scientific130190
Trypsin-EDTA 10xBioWestX09301:10 in HBSS verdünnen, um eine 1x Lösung zu erhalten
309628

Referenzen

  1. Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).
  2. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
  3. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
  6. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
  7. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
  8. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  9. Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
  10. Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
  11. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  12. Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
  13. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
  14. Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
  15. Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
  16. Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
  17. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
  18. Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
  19. Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).

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