Summary
La falta de un procedimiento bien definido que limpia constantemente las superficies de cupón fue identificada como el principal contribuyente a recuperaciones bajo y variable en verificación de limpieza. Este manuscrito describe el protocolo correcto de limpieza de los cupones de acero inoxidable.
Abstract
El objetivo de este trabajo es identificar los parámetros que afectan la recuperación de residuos farmacéuticos desde la superficie de los cupones de acero inoxidable. Se evaluaron una serie de factores, incluyendo drogas producto spike niveles, procedimiento spiking, ratios de droga excipiente, variabilidad de Analista a analista, variabilidad intradiaria y procedimiento de limpieza de los cupones. La falta de un procedimiento bien definido que limpia constantemente la superficie del cupón fue identificada como el principal contribuyente a recuperaciones bajas y variables. Evaluación de la limpieza de la superficie de los cupones con las soluciones de limpieza en el lugar (CIP) dio de alta recuperación (> 90%) y la reproducibilidad (Srel≤4%) independientemente de las condiciones que se evaluaron previamente. El enfoque fue aplicado con éxito para la limpieza de verificación de pequeñas moléculas (MW < 1.000 Da) así como de grandes biomoléculas (MW hasta 50.000 Da).
Introduction
La limpieza de los equipos no dedicados debe ser verificada antes de su posterior liberación para su uso en la fabricación de productos intermedios y de ingredientes farmacéuticos activos (API), producto cambio para evitar la contaminación cruzada. Procedimientos de limpieza deben contener información suficiente para que los operadores limpiar cada tipo de equipo de una manera reproducible y eficaz, y estos procedimientos deberían validarse según el U.S. Food y Drug Administration (FDA) requisitos1. Numerosas cartas de ADVERTENCIA debido a la inadecuada limpieza2,3,4, falta para validar el método de verificación de limpieza y no seguir los procedimientos de limpieza5 han sido emitidas por la FDA. 21 CFR §211.67 describe los requisitos necesarios para la exitosa verificación de limpieza.
Es el estándar en la industria que la validación de los métodos de análisis para verificación de la limpieza se realiza en cupones de acero inoxidable con el misma superficie/final como el equipo de fabricación. Cupones de acero inoxidable (p. ej., 50 cm2) se utilizan para representar superficies de equipo para experimentos de verificación en el laboratorio de la limpieza. Durante el desarrollo y validación de estos métodos analíticos, la muestra de interés (es decir, los residuos que deben ser recuperados desde la superficie de los equipos) se añadió en el residuo blanco en el cupón inoxidable determinado por el límite máximo permisible remanente (MACO). Este nivel es determinado basado en el límite de exposición aceptable que se define como el límite en que un paciente puede obtener expuesto sin efectos adversos para la salud (no-observado-adverso-efecto-nivel, NOAEL).
El analista u operador de producción realizar el hisopado debe seguir un procedimiento estructurado para garantizar que las recuperaciones son reproducibles independientemente de quién realiza el hisopado. El procedimiento deberá detallar explícitamente el tipo de aplicador, utiliza número de hisopos, el diluyente, la cantidad de solvente utilizado, el patrón de barrido exacto, el número de golpes aplicados a la superficie de muestreo, la cantidad de tiempo gastado hisopado/extracción de las muestras, el método de detección (ULTRAVIOLETA, fluorescencia, espectrometría de masas, carbono orgánico total, etc.), la técnica de extracción del material de la cabeza de esponja , etcetera.
Además todos los factores antes mencionados que afectan la recuperación de muestra, la superficie del cupón y por lo tanto, la superficie de los equipos también juegan un papel. La superficie del cupón puede ser modificada debido a la deposición de una capa delgada de material en la superficie o a cambio en el estado de oxidación de uno o más de los elementos de acero inoxidable (p. ej., Fe, Cr y Ni)6,7,8. La regeneración de la superficie de los cupones de acero inoxidable a su estado original es vital para el éxito del proceso de intercambio cuantitativo. Estudios, en los que los cupones de acero inoxidable no se limpiaron adecuadamente, mostraron variabilidad en como analista a otros, diferentes medicamentos, o varios spike niveles9,10,11. La desviación estándar de recuperación de diez repeticiones de un cupón puede ser hasta 14% y 26% en cinco cupones9. Es importante tener en cuenta que los valores de desviación estándar relativa (Srel) aumentan con el aumento del número de repeticiones o con el aumento de la cantidad de cupones utilizados (es decir, cinco cupones en lugar de spiking cinco veces en el mismo cupón)11. En tales casos, la variabilidad no puede interpretarse como fluctuaciones al azar. Sin embargo, sus resultados pueden ser explicados por nuestro encontrar que la limpieza de la superficie del cupón afectará a la recuperación. Los resultados descritos en este artículo muestran un aumento significativo en los resultados de recuperación y disminución de la variabilidad después de limpiar correctamente la superficie de los cupones de acero inoxidable.
Limpio-en-lugar (CIP) es una forma automatizada de la limpieza de la superficie de equipo que involucra un mínimo o ningún desmontaje de los equipos. Durante el proceso de la limpieza del CIP, se ejecuta un procedimiento definido de lavado consecutivo con base seguida por un ácido para eliminar residuos orgánicos e inorgánicos. Surfactantes, compuestos quelantes o secuestrantes agentes generalmente se añaden a soluciones para mejorar la eficacia de cualquier producto de la superficie de los equipos de limpieza CIP. La eficacia de la limpieza depende de varios parámetros incluyendo la selección y concentración de las soluciones CIP (es decir, tipo y composición de la base, ácido y surfactante), el tiempo de limpieza, temperatura (típicamente 60-80 ° C), tipo de contaminación y la presencia de difíciles de limpiar partes12. Basado en el tipo de producto de medicamentos, soluciones CIP 100 y 200 han sido elegidas para utilizar para la limpieza de los cupones de acero inoxidable utilizados para la limpieza de verificación, ya que simula el proceso CIP utilizado para limpiar el equipo de fabricación.
Este estudio reporta la influencia de diferentes factores que afectan la recuperación de residuos farmacéuticos desde la superficie de los cupones de acero inoxidable y recomienda las mejores prácticas para el desarrollo de método analítico de limpieza para pequeñas moléculas, proteínas terapéuticas y los anticuerpos. La falta de un procedimiento bien definido que constantemente limpiado la superficie del cupón fue identificada como el principal contribuyente a recuperaciones bajas y variables. Recuperación alta y reproducible se obtuvo cuando la superficie del cupón se limpió correctamente13.
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Protocol
1. solución de la muestra
- Calcular el límite de limpieza (CL) de un medicamento basado en el arrastre permisible máxima (MACO) según los criterios de dosis terapéutica.
Nota: Aquí, el límite de limpieza (CL) para la droga A se ha calculado que 2,4 μg por 50 cm2 basado en el arrastre permisible máxima (MACO) según los criterios de dosis terapéutica. La verificación de la limpieza se ejecuta en el 50%, 100% y 150% límite de limpieza. La verificación de la limpieza ha sido evaluada para dos formulaciones (carga 2,5% y el 60% de la droga w/w).
2. procedimiento de limpieza para cupones
- Planteamiento inicial
- Limpiar los cupones por lavado y limpieza de la superficie de 10-15 s dos veces con agua y dos veces con metanol para eliminar cualquier depósito residual. Realizar este proceso en la campana como el metanol es tóxico y altamente volátiles.
- Enfoque avanzado
- Utilizando las soluciones de limpieza en el lugar
- Establecer el sonicador a temperatura ambiente. El sonicador no tiene ningún ajuste de la configuración de energía, por lo tanto, el tiempo se ajusta para dar resultados de limpieza adecuados.
- Introducir los cupones en agua de calidad de alto rendimiento de la cromatografía líquida (HPLC) y someter a ultrasonidos durante 2 min.
- Introducir los cupones en la solución de detergente alcalina 0.1% en agua de calidad HPLC y someter a ultrasonidos durante 2 minutos.
- Introducir los cupones en agua HPLC y someter a ultrasonidos durante 2 minutos.
- Introducir los cupones en 0.1% de solución de detergente ácido en agua HPLC y someter a ultrasonidos durante 2 min.
- Introducir los cupones en agua HPLC y someter a ultrasonidos durante 2 minutos.
- Utilizando peróxido de ácido-base
Nota: Este es un método alternativo incluido con ácido, base y peróxido en lugar de detergentes alcalinos y ácidos.- Establecer el sonicador a temperatura ambiente. El sonicador no tiene ningún ajuste de la configuración de energía, por lo tanto, el tiempo se ajusta para dar resultados de limpieza adecuados.
- Introducir los cupones en agua y someter a ultrasonidos durante 2 min.
- Introducir los cupones en hidróxido de sodio de 0,1 M y someter a ultrasonidos durante 2 min.
- Introducir los cupones en agua y someter a ultrasonidos durante 2 min.
- Introducir los cupones en ácido clorhídrico de 0,1 M y someter a ultrasonidos durante 2 minutos.
- Introducir los cupones en agua y someter a ultrasonidos durante 2 min.
- Introducir los cupones en 0,1 mg/mL de NaNo2 y someter a ultrasonidos durante 2 minutos.
- Introducir los cupones en agua y someter a ultrasonidos durante 2 min.
- Utilizando las soluciones de limpieza en el lugar
3. procedimiento de vajillas
- Monte los cupones de acero inoxidable en la parte inferior de un vaso de plástico de 250 mL (o 500 mL) usando una cinta de doble cara.
- Sostener el vaso para hacer spiking y vajillas procesos fácil. Esto también minimiza algunos accidentes indeseables como pasarse la esquina al aplicador.
- Infundir un volumen a una concentración específica y formulación (por ejemplo, 200 μL de 12 μg/mL en la carga de droga w/w A 2,5%) en un patrón whirly en la superficie del cupón utilizando una pipeta volumétrica.
- Espere hasta que se seque la superficie del cupón (~ 3-10 minutos dependiendo de la volatilidad de la muestra).
- Sumerja un hisopo seco en un vial con 2 mL de diluyente (metanol: ácido fórmico 100:0.2 volumen/volumen).
- Quitar el disolvente sobrante presionando el hisopo contra la parte interior del frasco.
- Firmemente, limpie la superficie del cupón con movimientos de lado a lado incluso se solapen hasta la zona de pruebas2 total 50 cm se limpia con un lado de una esponja húmeda.
- Repita el proceso de limpieza (paso 3.7) utilizando el mismo lado de la esponja.
- Limpiar dos veces los cuatro bordes de cupón.
- Girar el hisopo hacia el otro lado y gire el cupón de 90°, hacia la derecha o hacia la izquierda; así, girando la dirección de vajillas por 90°.
- Repita el desmoldante como se detalla en los pasos 3.7-3.9. Después del muestreo de la superficie, cortar la cabeza de la esponja con unas tijeras en el vial de disolvente.
- Repita el proceso desmoldante con un segundo hisopo girando el cupón 90° hacia la misma dirección elegida antes.
- Someter a ultrasonidos el frasco que contiene dos cabezas de hisopo durante 5 minutos, luego vortex por 10 s.
- Transferir la solución a un frasco HPLC y etiqueta como solución de trabajo.
4. cálculo de recuperación
- Recuperación de la muestra
- Mezcla 200 μL del cupón clavar soluciones con 1.800 μl de diluyente para preparar las soluciones de control.
- Haga funcionar el sistema de la cromatografía según las condiciones indicadas en la tabla 1.
- Calcular la recuperación de la solución de trabajo de hisopo en el área relativa bajo pico de las soluciones de trabajo base (AW) y la solución de control (C).
- Repita el proceso en tres cupones y calcular la recuperación media y desviación estándar relativa (Srel).
Nota: Todos los métodos analíticos usados aquí fueron validados según las directrices de la ICH Q2(R1). Las condiciones de la cromatografía se enumeran en la sección material.
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Representative Results
Resultados representativos de los intentos iniciales para la limpieza de verificación de droga son resumidos en la tabla 2. Antes de que los cupones fueron limpiados según el procedimiento detallado en la sección experimental, resultados inconsistentes fueron obtenidos en niveles diferentes del punto, para diferentes proporciones de API/excipiente, diferentes analistas e incluso para el analista mismo en días diferentes. La variabilidad observada en las recuperaciones debía abordarse, ya que algunos de los resultados no los requisitos de validación (60% < recuperación < 150%), tales como la recuperación de la droga 60% carga límites en limpieza.
El primer tipo de variabilidad observada en la tabla 2 es la variabilidad en la precisión como puede verse en la alta Srel asociadas con la mayoría de los resultados de la recuperación (números que aparecen entre paréntesis). Además a la variabilidad de Analista a Analista esperada (datos mostrados en la referencia 13), variabilidad día a día también se observa para un analista con el resto de las condiciones no cambiada, como se ve en los dos primeros experimentos en la tabla 2 (en la carga de la droga del 2,5%). Recuperaciones inconsistentes fueron observados en los niveles de diferentes punto de 50%, 100% y 150% del límite de limpieza (Srel hasta 16% para la droga de 60% de la carga al 150% límite de limpieza), independientemente de la carga de drogas o el analista haciendo el experimento. In addition, hubo variabilidad incluso en diversos cocientes de la API/excipiente, en 2,5% y el 60% de carga de fármaco (tabla 2) y en carga de droga 50% reportado en la referencia 13). La formulación baja dio la mayor recuperación en promedio, lo que sugiere que el excipiente mejora la recuperación de la droga de la cupón. Posiblemente 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), un agente tensioactivo, blindado el medicamento orgánico compuesto de interacción de quelación metálica y mejora la eliminación de la droga de la superficie del cupón cuando la relación droga/excipiente era más baja.
Según los tipos de variabilidad que hemos comentado anteriormente, el planteamiento inicial para mejorar la recuperación era volver a desarrollar el método de extracción y las condiciones experimentales para obtener recuperaciones consistentes y de altas. Ajustar parámetros incluye: aplicador de la técnica, el diluyente (disolventes diferentes, diferentes relación orgánico/acuoso, diferentes ácidos y concentración de ácido), el spiking solvente, el pH de la espiga y el diluyente, la técnica de spiking y la técnica de extracción de droga de la esponja. Las recuperaciones promedio en cuatro cupones diferentes junto con la desviación estándar relativa se muestran en la figura 1 para algunos experimentos. La principal conclusión fue que ninguno de los mencionados cambios eliminan la variabilidad observada previamente en la tabla 2. Independientemente del factor experimental que se ha cambiado, la variabilidad en la recuperación (Srel) de un cupón a otro era evidente y en algunos casos se > 20%. Dentro de error experimental, casi todos estos experimentos no eran considerados estadísticamente diferentes. La diferencia entre la recuperación individual en cada superficie de cupón y la recuperación media (ΔRecovery) se muestran en la figura 2. Está claro que la recuperación promedio es diferente de la superficie de un cupón a otro. Por lo tanto, se espera que la superficie del cupón sea una importante contribución a la variabilidad observada.
Había una alta probabilidad que la variabilidad observada previamente en recuperación debido a la variabilidad de cupón-cupón. Los experimentos de verificación limpieza de carga 60% drogas se repitieron seis veces, con cada formulación tacon en cuatro cupones de idéntico material y acabado superficial, desde el mismo proveedor. Estaba claro desde los resultados mostrados en la figura 3 que la recuperación para la formulación del 60% no es muy reproducible de un ensayo a otro, con una tendencia general a recuperaciones más bajas como los experimentos progresaban. Por otra parte, se observaron algunas diferencias entre cupones en esta formulación (figura 2). La variabilidad observada sugiere que la superficie de los distintos cupones no era idéntico e interactuado diferentemente con la matriz.
El primer enfoque para reducir al mínimo la diferencia entre los cupones fue limpiar las superficies de los cupones. Cupones utilizados para obtener la recuperación de la figura 3 se limpian según el procedimiento presentado en la sección experimental. En la figura 3se presentan los resultados de recuperación después de la limpieza de los cupones. Está claro que la recuperación es prácticamente reproducible de un ensayo a otro y que se minimice la diferencia en recuperación entre cupones.
La tabla 2 muestra una comparación de los resultados de la recuperación antes y después de la limpieza de los cupones en las mismas condiciones experimentales. Pueden extraerse las siguientes conclusiones: 1) todas las recuperaciones eran altas (90-100%); 2) los valores de Srel en cada nivel spiking fueron aceptables y mucho menor que los resultados previamente divulgados cupones, 3) la variabilidad en la recuperación del nivel de un punto a otro se minimizó, 4) la diferencia en la formulación no afectó la recuperación.
Cupones de limpiar con CIP soluciones entonces fueron utilizadas para la limpieza de verificación de compuestos B (otra molécula pequeña) C y D (moléculas grandes, es decir, productos biológicos) en formulaciones diferentes y punto. Las misma conclusiones de experimentos de drogas A eran aplicables para la droga B, C y D (resultados detallados se muestra en la referencia 13). Alta recuperaciones se obtuvieron a través de tamaño molecular y las propiedades fisicoquímicas mediante la aplicación de un enfoque sistemático de limpieza de los cupones.
Figura 1 . Promedio de recuperación de cuatro cupones. Barras de error representan la desviación estándar relativa de cuatro ensayos de cuatro cupones. Experimento número: 1) punto normal, 2) ácido fórmico al 10%, 3) no ácido fórmico, 4) no hay agua en la solución de spike, 5) porcentaje de placebo alta (97%), 6) sin placebo, 7) exprimir el hisopo con espátula, 8) agregar un paso de centrifugación, y 9) 0.1% HCL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Diferencia en recuperación (ΔRecovery) de cuatro cupones. ΔRecovery es la diferencia entre la recuperación en el cupón y la recuperación promedio de los cuatro cupones. Experimento número: 1) punto normal, 2) ácido fórmico al 10%, 3) no ácido fórmico, 4) no hay agua en la solución de spike, 5) porcentaje de placebo alta (97%), 6) sin placebo, 7) exprimir el hisopo con espátula, 8) agregar un paso de centrifugación, y 9) 0.1% HCL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Variabilidad en la recuperación de la droga A en 2.5% drogas/excipiente relación antes y después de la limpieza. Triángulos sólidos corresponden a valores de recuperación antes de limpiar los cupones, mientras que el open símbolos corresponden a los valores de recuperación después de la limpieza de los cupones. Barras de error representan la desviación estándar relativa de cuatro ensayos de cuatro cupones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Condiciones de cromatografía.
Tabla 2. Con recuperaciones para carga de fármaco diferente antes y después de limpiar los cupones según el procedimiento en la sección Experimental.
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Discussion
Principal contribuyente a recuperaciones bajo y variable de residuos de la API de cupones de acero inoxidable fue remontado a la falta de un procedimiento bien definido para la limpieza de las superficies de cupón. Limpiar la superficie de los cupones resultó en recuperación con picos consistente, precisos y resultados reproducibles. Con la demostración de altas recuperaciones de cupones de acero inoxidable, los limpieza verificación los resultados reales obtenidos de los equipos de fabricación utilizando métodos validados deben ser exacta y precisa, refleja el nivel de residuos en el equipo con mínimo riesgo de falsos negativos por contaminación cruzada de un producto a otro que podría poner en peligro la seguridad del paciente.
El planteamiento inicial seguido por el analista para solucionar problemas de la recuperación bajo e inconsistente era mediante la modificación de las condiciones experimentales tales como: porcentaje de materia orgánica en el diluyente, la clavaba, el tipo y fuerza de ácido utilizado en la solución de spiking, etcetera. Este enfoque no solucionó el problema de recuperación bajo e inconsistente. Sin embargo, este problema ya mencionado fue totalmente solucionado cuando el acero inoxidable se limpia adecuadamente usando solución de limpieza en el lugar. Este logro resulta aumentar enormemente las posibilidades de que el exitoso paso de verificación de la fabricación de equipos de limpieza. Es importante tener en cuenta que las soluciones CIP utilizadas aquí se limitan a la industria farmacéutica y así soluciones CIP deben seleccionarse para otros tipos de industrias (alimentos procesados, productos lácteos, cosméticos, etc.). La elección de soluciones CIP y el proceso de limpieza son pasos críticos para el éxito de este proceso. El protocolo presentado aquí ayudará a los analistas en la industria farmacéutica, así como otras industrias para mejorar el diseño y ejecutar exitosa verificación de limpieza. El trabajo también ayudará a minimizar el lote a lote o producto de la contaminación cruzada que puede afectar la salud humana.
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Disclosures
No existir intereses financieros o conflicto de intereses.
Acknowledgments
No agencias financiadoras apoyó este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| stainless steel coupons | GlobePharma (New Brunswick, NJ ). | SS316-20RA-50cm2 | |
| Clean in place solutions (CIP100 and CIP200) | were obtained from Steris Corporation (Mentor, OH) | 1D10BG | Alkaline detergent and acid detergent, respectively |
| Positive displacement pipettes | Gilson (Middleton, WI). | ||
| HPLC grade water | Millipore Milli-Q Advantage Water Purification System (Darmstadt, Germany) or from Honeywell Burdick & Jackson (Muskegon, Michigan) | 7732-18-5 | |
| HPLC grade Methanol | EMD | MX0475-1 | |
| glacial acetic acid | EMD | MAX0073P5 | |
| HPLC grade Acetonitrile | J.T. Baker (Avantor Performance Materials, Center Valley, PA) | 75-05-8 | |
| Trifluoroacetic acid | J.T. Baker (Avantor Performance Materials, Center Valley, PA) | 75-05-8 | |
| Chromatography column Zorbax Eclipse | XDB-C18, 4.6 x 100 mm, 3.5 µm HPLC column | UNSPSC – 41115709 | |
| Vanquish UHPLC system | Thermo Fisher Scientific, Germering, Germany | ||
| Branson B8510 Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Danbury, CT, USA) | model (8510-D7H) |
References
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