Summary
Nous décrivons ici une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et le protocole de préparation de bibliothèque de ChIP-seq pour générer des profils épigénomique global d’échantillons embryonnaires de poulet de faible abondance.
Abstract
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une technique largement utilisée pour cartographier la localisation des histones modifiées post-traductionnellement, variants d’histones, facteurs de transcription ou des enzymes modifiant la chromatine à un locus donné ou sur une échelle de tout le génome. La combinaison de tests de puce avec génération de séquençage (c.-à-d., ChIP-Seq) est une approche puissante pour découvrir dans le monde des réseaux de régulation génique et améliorer l’annotation fonctionnelle des génomes, en particulier des séquences régulatrices non codantes. Puce protocoles nécessitent généralement de grandes quantités de matériel cellulaire, ce qui annule l’applicabilité de cette méthode à une enquête sur les types de cellules rares ou des biopsies tissulaires petit. Afin de rendre l’analyse de puce compatible avec la quantité de matières biologiques qui en général peuvent être obtenus in vivo au cours de l’embryogenèse précoce de vertébrés, les auteurs décrivent ici un protocole simplifié de puce dans lequel le nombre d’étapes nécessaires pour terminer le test ont été réduits pour minimiser la perte de l’échantillon. Ce protocole ChIP a été utilisé avec succès pour enquêter sur des modifications d’histone différentes dans différents poulet embryonnaire et les tissus de souris adulte moyen faible pour un nombre moyen de cellules (5 x 104 - 5 x 105 cellules). Surtout, ce protocole est compatible avec la technologie ChIP-seq, à l’aide de méthodes de préparation de la bibliothèque standard, fournissant ainsi l’épigénomique global cartes dans les tissus embryonnaires très pertinents.
Introduction
Modifications post-traductionnelles des histones sont directement impliquées dans divers processus dépendants de chromatine, y compris la transcription, de réplication et de réparation de l’ADN pour1,2,3. En outre, les modifications d’histone différents montrent positifs (par exemple, H3K4me3 et H3K27ac) ou négatif (par exemple, H3K9me3 et H3K27me3) corrélations avec l’expression du gène et peuvent être définis de façon large comme marque d’histone activant ou répressive, respectivement2,3. Par conséquent, cartes de modification globale histone, également appelées cartes épigénomique, sont apparus comme des outils puissants et universels d’annoter fonctionnellement des génomes de vertébrés4,5. Par exemple, les séquences régulatrices distales comme exhausteurs peuvent être identifiés basé sur des signatures spécifiques de chromatine (p. ex., active exhausteurs : H3K4me1 et H3K27ac), qui les distinguent des régions promotrices proximal (par exemple, promoteurs actifs : H3K4me3)6,7,8. En revanche, gènes avec fonctions réglementaires d’identité cellulaire majeur se trouvent généralement avec les domaines de la chromatine large marquées avec H3K4me3 ou H3K27me3, suivant l’État transcriptionnellement actif ou inactif des gènes sous-jacent, respectivement9 ,,10. De même, l’expression des gènes d’identité cellulaire majeure semble être fréquemment contrôlée par de multiples et dans l’espace en cluster exhausteurs (c.-à-d., les exhausteurs de Super), qui peuvent être identifiés comme grands domaines marqués H3K27ac11.
Actuellement, modification des histones cartes sont générées en utilisant la technologie ChIP-seq, qui, par rapport aux approches précédentes telles que ChIP-chip (puce couplée à des puces à ADN), offre une résolution plus élevée, moins d’artefacts, moins de bruit, la couverture supérieure et inférieure frais12. Néanmoins, la génération de cartes épigénomique utilisant la technologie ChIP-seq a ses limites inhérentes, surtout associés à la capacité de réaliser avec succès la puce dans les échantillons d’intérêt. Protocoles de puce traditionnels généralement requis des millions de cellules, qui limite l’applicabilité de cette méthode pour cellulaire in vitro des lignes ou des cellules qui peut facilement être isolés en vivo (par exemple, les cellules sanguines). Dans ces dernières années, un certain nombre de mis à jour le protocoles de puce compatibles avec un nombre faible de cellules ont été décrits13,14,15,16. Toutefois, ces protocoles sont spécifiquement conçus pour être couplé avec la nouvelle génération séquençage (c.-à-d., ChIP-seq), et ils utilisent généralement ad hoc bibliothèque préparation méthodes13,14, 15 , 16.
Ici, nous avons décrit un protocole de puce qui peut être utilisé pour étudier les profils de modification d’histone en utilisant le nombre de cellules faible à intermédiaire (5 x 104 - 5 x 105 cellules) locus soit sélectionné (c'est-à-dire, ChIP-qPCR) ou dans le monde (par exemple, ChIP-seq) (Figure 1). Lorsqu’il est couplé à la technologie ChIP-seq, notre protocole de puce peut être utilisé ainsi que les méthodes de préparation de bibliothèque standard, ce qui le rend largement accessible à de nombreux laboratoires10. Ce protocole a été utilisé pour étudier plusieurs marques d’histone (par exemple, H3K4me3, H3K27me3 et H3K27ac) dans les tissus embryonnaires de poulet différentes (par exemple, la colonne vertébrale du tube neural (SNT), fronto proéminences et épiblaste). Cependant, nous pensons qu’il devrait être largement applicable à d’autres organismes qui échantillons biologique et/ou cliniquement pertinentes peuvent être obtenus seulement en faibles quantités.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
selon les directives allemandes de protection des animaux, aucune approbation institutionnelle animalerie et utilisation Comité (IACUC) n’était nécessaire pour réaliser les expériences d’embryon de poulet. Selon les directives locales, seules des expériences avec des embryons de poulet CM44 (18 jours) et plus âgés nécessitent l’approbation IACUC. Cependant, les embryons utilisés dans cette étude étaient tous dans les premiers stades du développement embryonnaire (c.-à-d. CM19 (72 h)).
Remarque : ce protocole vise à fournir une description détaillée de l’analyse de la puce, donc il peut être réuni avec qPCR ou séquençage de prochaine génération (c.-à-d., ChIP-seq) d’enquêter sur des modifications d’histone dans des échantillons de faible abondance embryonnaires (allant de 5 x 10, 4-5 x 10 5 cellules pour chaque réaction de puce) et types de tissus différents ( Figure 1). Le protocole devrait être applicable à une enquête sur les profils de liaison des facteurs de transcription et co activateurs (p. ex., p300). Toutefois, en raison de la plus faible abondance de ces protéines régulatrices, les plus grands nombres de cellules sont susceptibles d’être requis (5 x 10 5 - 5 x 10 6 cellules pour chaque réaction de puce).
1. préparation d’oeufs et Microdissection de la SNT poulet
Remarque : la procédure de microdissections techniquement diffère de tissus tissus et de modèle animal pour le modèle animal. Cette section décrit en détail le protocole de dissection utilisé pour obtenir brachiale SNT sections du stade-CM19 des embryons de poulet par exemple.
- Incuber des oeufs de poules leghorn blanche fertile, obtenus chez un éleveur local, en position horizontale à 37 ° C et 80 % d’humidité pendant 3 jours pour obtenir le stade-CM19 des embryons de poulet.
- Déterminer les étapes selon le Hamburger et Hamilton de poulet embryonnaire du développement sur le système intermédiaire 17.
- Effectuer des microdissections tous dans des conditions froides ; dans le cas contraire, l’intégrité de la chromatine est compromise.
- Isoler les embryons CM19.
- Pour les embryons de la rendre accessible, extrait de 3 mL d’albumine à l’aide d’une seringue de 10 mL avec une aiguille (0,90 x 40 mm) pour abaisser le blastoderme.
- Faire une petite ouverture dans le œuf à l’aide des ciseaux et ajouter 1 mL de solution de Locke (voir les Documents complémentaires pour la recette) pour faciliter l’enlèvement des membranes extra embryonnaires.
- Injecter 10 % indien noir d’encre/Locke solution en utilisant une seringue de 1 mL avec une aiguille (0,55 x 25 mm 2) sous le blastoderme pour faciliter la visualisation des embryons.
- Couper la membrane extra embryonnaire qui entoure l’embryon à l’aide des ciseaux fins médicaux chirurgicaux et forceps.
- Une cuillère perforée permet de transférer l’embryon d’une boîte de Pétri contenant 20 mL de solution de PBS 1 x 4. 5 cm.
- Disséquer loin l’amnios et le reste de la membrane extra embryonnaire à l’aide de ciseaux fine et forceps sous un stéréomicroscope.
- Couper le segment SNT transversal au niveau brachial de l’embryon, s’étendant en direction caudale vers la région thoracique pour isoler la SNT ( Figure 2).
- Enlever les tissus qui entourent latéralement/ventralement la SNT (p. ex., plaque latérale mésoderme, ectoderme, notochorde et aorte) à l’aide de pinces ( Figure 2).
- Plonger chaque segment SNT poulet découpé dans une boîte de Pétri contenant 5 mL de trypsine tiède (37 ° C) (1/250 de solution de trypsine/EDTA) de 3,5 cm.
- Arrêter le traitement par la trypsine lorsqu’un relâchement des tissus non-neurale autour de la SNT est détecté sous un stéréomicroscope.
NOTE : Le temps de la trypsinisation doit être étroitement contrôlé afin d’éviter la digestion excessive et la dispersion du tissu neural et de conserver l’intégrité structurale de la SNT. - Après traitement par la trypsine, supprimer les autres tissus mésenchymateux et ectodermiques manuellement pour préparer la section propre de la SNT.
- Transférer la section SNT dans un tube de 1,5 mL et flash-congélation dans l’azote liquide. Une fois suffisamment SNT sections sont accumulée (piscine le SNT des sections d’embryons de poulet de ~ 30 pour une réaction de puce), à stocker à -80 ° C.
Remarque : Si des tissus embryonnaires suffisante (c.-à-d. 5 x 10 5-5 x 10 6 cellules) peut être disséqué d’une seule ou quelques embryons de poulet, puis gel n’est pas nécessaire et il est possible de procéder directement à l’étape suivante. Veuillez vous référer au guide de dépannage dans le tableau 1.
Remarque : attention ! Azote liquide a une température extrêmement basse, de porter une protection appropriée.
2. Protéines de réticulation à l’ADN : jour 1
Remarque : Exécutez toutes les étapes sur la glace, sauf indication contraire.
- Ajouter 500 µL de DMEM avec 10 % FBS et 10 µL de 1 M Na-butyrate directement sur les tissus congelés ou, alternativement, immédiatement au tissu fraîchement disséqué. Homogénéiser les cellules en re-suspension doucement avec une pipette de 1 mL.
Remarque : L’ajout de Na-butyrate est facultative mais recommandée si l’acétylation des histones. Au lieu de FBS DMEM - 10 %, les échantillons peuvent être charriés dans du PBS 1 x avec 0,1 % de BSA. L’ajout de FBS ou BSA est facultative, mais elle facilite les échantillons dans les étapes ultérieures de centrifugation de la granulation. - Ajouter 13,5 µL de 37 % de formaldéhyde (1 % formaldéhyde final) et le placer sur un agitateur à température ambiante pendant 15 minutes.
Remarque : attention ! Le formaldéhyde est toxique. - Ajouter 25 µL de glycine de 2,5 M dans le tube et le placer sur un agitateur pendant 10 min à température ambiante pour étancher la formaldéhyde.
- Tourner le tube à 850 x g pendant 5 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de table-top. Jeter le surnageant.
- Laver le culot avec 500 µL de froid lavage fraîchement préparée (voir les Documents complémentaires pour la recette), centrifugeuse de la mémoire tampon à 850 x g et 4 ° C pendant 5 min et éliminer le surnageant.
3. Lyse et Sonication
- Prepare lyse complète tampon (LB) (voir les Documents complémentaires pour la recette) et froid sur la glace. 1 ml, utilisez 950 µL de LB et 40 µL de concentré d’inhibiteur de protéase (x 25) 10 µL de 100 % PMSF.
- Resuspendre le culot dans 300 µL de LB complet de pipetage et posez-le sur une plate-forme bascule pendant 10 min à 4 ° C.
- Laisser agir les échantillons en utilisant les paramètres suivants : Temp = 4 ° C, temps Total = 7 minutes, “ sur ” intervalle = 30 s, “ hors ” intervalle = 30 s, amplitude = 25 %
NOTE : Les conditions de Sonication doivent être optimisées pour chaque tissu et varieront selon le sonicateur utilisé. Il est recommandé d’utiliser les paramètres de sonication plus bas qui donnent lieu à ADN cisaillé allant de 200 à 600 bp en taille. Cisaillement varie considérablement selon le type de tissu, quantiTy, le volume de la sonication, conditions de réticulation et équipement. Veuillez vous référer au guide de dépannage dans le tableau 1. - Faites tourner l’échantillon aux ultrasons à 16 000 x g pendant 10 min à 4 ° C pour granuler les débris cellulaires.
- Transférer le lysat (surnageant) dans un nouveau tube de 1,5 mL.
Remarque : Si le produit de départ est jugé suffisant pour deux expériences de puce, puis 300 µL de LB complète peut être ajouté à la chromatine aux ultrasons (c'est-à-dire le volume final : 600 µL). - Ajouter 30 µL de 10 % octylphénol éthoxylé pour chaque 300 µL de sonication lysat (concentration finale : 1 %) et de la composition de pipetage.
Remarque : attention ! Octylphénol éthoxylé présente une toxicité aiguë (par voie orale, cutanée, inhalation).
4. Incubation des anticorps
- partie aliquote les 330 µL de sonication lysat dans deux tubes de 1,5 mL : 300 µL pour puce et 30 µL sous le contrôle d’entrée (10 % des matières premières). Magasin la " 30 µL d’échantillon contrôle d’entrée " à -20 ° C.
Remarque : Si les deux réactions de puce sont effectuées à partir du même échantillon, puis les 660 µL de sonication lysat peuvent être distribuées dans trois tubes de 1,5 mL (300 µL pour puce #1 300 µL pour puce #2 et 60 µL dans le contrôle d’entrée (20 % de la matière première de chaque puce) ). - Ajouter 3-5 µg d’anticorps à la 300 µL de chromatine aux ultrasons aliquote et inverti mélanger.
Remarque : Dans cette étude, chaque réaction de puce a été réalisée avec un anticorps spécifique pour le tri d’Histone H3 méthylée à K4 (H3K4me3), di Histone H3 méthylée à K4 (H3K4me2), tri d’Histone H3 méthylée à K27 (H3K27me3) et l’acétylation tri Histone H3 à K27 (H3K27me3). Le succès de ce protocole est entièrement dépendant de la qualité de l’anticorps utilisé. L’anticorps doit être spécifique et efficace à l’immunoprécipitation d’une protéine spécifique. Il est important de déterminer la quantité d’anticorps qui peut être utilisé pour l’immunoprécipitation l’ADN-protéine réticulé complexes. En outre, la spécificité de l’anticorps peut être vérifiée par Western blot pour s’assurer qu’il détecte la protéine correcte. Un anticorps qui détecte plusieurs bandes non spécifiques n’est pas recommandé pour puce. - Placer le tube sur une plate-forme bascule à 4 ° C durant la nuit (12-16 h) pour lier les anticorps à la chromatine.
Remarque : Veuillez vous référer au guide de dépannage dans le tableau 1.
5. Préparation des billes magnétiques : jour 2
- Aliquot 50 - 100 µL de protéine G/magnétique coulis perle pour chaque réaction de puce dans un microtubes de 1,5 mL de tube sur glace.
- Laver les billes magnétiques trois fois avec une solution froide de bloc (voir les Documents complémentaires pour la recette) (4 ° C). Ajouter 500 µL de solution de bloc froid et mélanger par inversion ou pichenette. Mettre le tube dans un support magnétique et attendre que les perles de s’installer sur les bords du tube. Décanter le liquide clair et répéter. Après le dernier lavage, évacuer tout le liquide avec une pointe de gel-chargement.
6. Immunoprécipitation de la chromatine
- Ajouter les 300 µL de chromatine lié aux talons lavées puis retournez pour mélanger.
- Faire pivoter verticalement sur une coiffe de tube à 4 ° C pendant au moins 4 h pour lier les anticorps aux talons.
7. Laver, éluer et inversez les croisements
- RIPA de Chill, tampon de lavage (voir les Documents complémentaires pour la recette) sur la glace, mettre au bain-marie à 65 ° C et refroidir le centrifuger à 4 ° C.
- Laver les perles de la chromatine lié aux quatre fois dans 1 mL de tampon de lavage froid RIPA et rester sur la glace. Pour ce faire, ajouter 1 mL de froid tampon de lavage RIPA et mélanger par inversion ou pichenette. Placer le tube dans le support magnétique et attendre que les perles de s’installer sur les bords du tube. Décanter le liquide clair et répétez.
Remarque : Le nombre de lavages avec tampon de lavage RIPA devrez peut-être être optimisée selon le type d’échantillon, l’abondance de l’échantillon et anticorps étant utilisé. Un augmentation du nombre de lavages permettra diminuer le fond mais aussi diminution de la quantité totale d’ADN récupéré, ce qui peut compromettre l’analyse en aval de qPCR ou ChIP-Seq. - Ajouter 1 mL de NaCl TE/50 mM dans le tube et transférer les perles de la chromatine-bondissent en TE/50 mM NaCl dans un tube de frais microtubes de 1,5 mL avant de retirer le liquide en utilisant le support magnétique, tel que décrit ci-dessus.
- Tourner les talons à 900 x g pendant 3 min à 4 ° C, placer le tube dans le support magnétique et supprimer tous les autres TE avec une pointe de gel-chargement.
- Ajouter 210 µL de tampon d’élution (voir les Documents complémentaires pour la recette) à température ambiante et remettre par pichenette.
- Élution pendant 15 min à 65 ° C dans un bloc chauffant et en agitant.
- Tourner les talons à 16 000 x g pendant 1 min à température ambiante et placer le tube dans MagNet holder.
- Transférer le surnageant (~ 200 µL) dans un tube à centrifuger frais une fois que les perles sont sont installés.
- Décongeler les échantillons de contrôle d’entrée (30 µL) de-20 ° C à température ambiante (congelés à l’étape 4.1), ajouter les 3 volumes du tampon d’élution (90 µL) et mélanger brièvement vortexer.
- Incuber les échantillons à puce et contrôle à 65 ° C pendant la nuit (12-16 h) pour inverser les croisements.
8. ARN et des protéines cellulaires Digest : jour 3
- 8.1At la température ambiante, ajouter 1 volume de tampon TE par tube (pour diluer le SDS) et inverser pour mélanger : ajouter 120 µL de TE à 120 µL de l’échantillon témoin et 200 µL de TE dans 200 µL de l’échantillon de ChIP.
- Ajouter RNase A à une concentration finale de 0,2 mg/mL et l’inverser pour mélanger : ajouter 2,4 µL de 20 mg/mL RNase A à 240 µL de l’échantillon témoin et 4 µL de 20 mg/mL RNase A à 400 µL de l’échantillon de la puce.
- Incuber les tubes à 37 ° C dans un bain-marie pendant 2 h digérer l’ARN.
- Ajouter protéinase K à une concentration finale de 0,2 mg/mL et inverti pour mélanger : ajouter 2,4 µL de 20 mg/mL de protéinase K 240 µL de l’échantillon témoin et 4 µL de 20 mg/mL de protéinase K à 400 µL de l’échantillon de la puce.
- Incuber à 55 ° C au bain-marie pendant 2 h pour digérer les protéines et purifier l’ADN.
9. Puce-qPCR
Remarque : effectuez l’extraction d’ADN et de purification, comme décrit dans les Documents complémentaires.
Remarque : vérifier l’efficacité de la sonication, tel que décrit dans les Documents complémentaires pour confirmer que les fragments d’ADN de 200 à 500-PB sont obtenues ( Figure 3).
Remarque : une étape cruciale consiste à déterminer si la puce effectivement travaillées. S’il sont connus des sites de liaison génomique pour la protéine d’intérêt, des amorces peuvent être conçus pour PCR quantitative (qPCR) pour déterminer si les sites connus sont spécifiquement enrichis dans l’ADN de la puce, par rapport aux régions de contrôle négatif ne devrait ne pas être lié par le candiprotéines de date. Ainsi, ce travail montre les résultats de ChIP-qPCR obtenus avec jetons pour H3K4me3 (marque d’histone promoteur actif) et H3K27me3 (marque d’histone promoteur inactif) dans les sections SNT isolées des embryons de poulets CM14 ( Figure 4 a ).
- Mélanger chaque paire d’amorces (avant et arrière) dans le même tube et préparer une concentration stock à 20 µM à chaque utilisation dH 2 O (tableau 2).
Remarque : l’efficacité de chaque paire d’amorces devrait être évaluée avant l’analyse par puce-qPCR. - Utiliser le contrôle d’entrée ChIP et 20 % ADN obtenu à l’étape 8,5 pour l’optimisation de qPCR.
NOTE : L’entrée de l’ADN est généralement dilué 20 x (à 1 % de la matière première utilisée dans les réactions de la puce) pour l’analyse de qPCR. - Pour chaque 10 µL de PCR, mélanger les composants suivants dans un tube PCR : pour ADN mastermix, ajouter 2 µL de dH2O 2,5 µL du mélange SYBR green et 1 µL d’ADN (à partir de puce ou un apport de 1 %) ; pour mastermix avec des amorces , ajouter 2.375 µL de 0,125 µL du mélange de l’apprêt avant et arrière, 2,5 µL du mélange SYBR green et dH2O.
- Mélanger les échantillons au Vortex pendant 2 s et brièvement la centrifugeuse à 900 x g pendant 1 min.
- Effectuer des PCR en temps réel (exemple des amorces et des conditions vélo utilisées ici se trouvent dans le tableau 2 et tableau 3, respectivement).
NOTE : Analyse des données ChIP-qPCR : signaux de puce sont calculés comme le pourcentage de l’apport. Brièvement, une fois les valeurs de Ct sont obtenues pour chaque réaction de qPCR, un facteur de dilution de 100 ou 6.644 cycles (log2 100) est appliqué aux valeurs Ct obtenues pour les réactions d’entrée de l’ADN. Puis, pour une région donnée d’intérêt (c.-à-d., paire d’amorces), les signaux de la puce sont calculées comme suit :
ajusté entrée = Ct (entrée) - 6.644
signal de puce = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)
10. préparation de chIP-seq de bibliothèque ; Réparation de fin : Jour 4
- diluer jusqu'à 100 ng d’ADN-ChIP dans 60 µL de tampon d’élution (voir le tableau sur les matières).
- Ajouter 40 μL de fin mélange de réparation et Pipeter doucement 10 fois.
- Incuber à 30 ° C pendant 30 min sur un thermocycleur.
- Vortex magnétique perles et ajouter 160 μl dans le tube contenant le mélange de réparation de fin. Bien mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber 15 min à température ambiante.
- Placer le tube dans le support magnétique et attendre pour les perles de s’installer sur le côté du tube...
- Décanter le liquide clair.
- Tout en gardant le tube sur le support magnétique, ajouter 200 μl de fraîchement préparée 80 % EtOH.
- Incuber à température ambiante pendant 30 s et jeter le surnageant. Répétez une fois..
- Maintenir le tube pendant 15 min sur le support magnétique à température ambiante. Une fois que la pastille est sec, retirez le tube du Magnet holder.
- Resuspendre le culot dans 20 μL de tampon de resuspension. Pipetez doucement 10 fois pour homogénéiser.
- Laisser incuber pendant 2 min à température ambiante.
- Placer le tube dans le support magnétique et attendre que les perles de s’installer sur les bords du tube. Transférer 17,5 μL de surnageant dans un nouveau tube.
11. Préparation de chIP-seq de bibliothèque ; 3 l’adénylate ' se termine
- Ajouter 12,5 μL d’A-tailing mix sur le nouveau tube et mélanger soigneusement par pipetage doucement et descendre de 10 fois. Placer le tube sur un thermocycleur et incuber selon le programme suivant : 37 ° C pendant 30 min, 70 ° C pendant 5 min et maintenez à 4 ° C
12. Préparation de chIP-seq de bibliothèque ; Ligaturer les adaptateurs
- Ajouter 2,5 μL de resuspension tampon, 2,5 μl du mélange de ligation et 2,5 μL de l’indice d’adaptateur RNA approprié. Mélanger soigneusement par pipetage doucement et descendre de 10 fois.
- Incuber sur un thermocycleur pendant 10 min à 30 °.
- Ajouter 5 μL de tampon de butée ligature et mélanger soigneusement en pipettant également 10 fois.
- Vortex magnétique perles et ajouter 42,5 μL à l’échantillon. Bien mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber 15 min à température ambiante.
- Placer le tube dans le support magnétique et d’attendre les perles s’installer sur le côté du tube et décanter le liquide clair
- Tout en gardant le tube sur le support magnétique, ajouter 200 μl de fraîchement préparée 80 % EtOH.
- Incuber à température ambiante pendant 30 s et jeter le surnageant. Répéter une fois.
- Maintenir le tube sur le support magnétique et, l’échantillon a laissé sécher à l’air pendant 15 min.
- Retirer le tube du porte magnétique et Resuspendre le culot dans 52,5 μL de tampon de resuspension. Bien mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber à température ambiante pendant 2 min, placer le tube dans le support magnétique et attendre pour les perles de s’installer sur les bords du tube. Transférer 50 μL de surnageant clair dans un nouveau tube. Perles de
- vortex magnétique et ajouter 50 μl de l’échantillon. Bien mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber 15 min à température ambiante.
- Placer le tube dans le support magnétique et d’attendre les perles s’installer sur le côté du tube et décanter le liquide clair.
- Tout en gardant le tube sur le support magnétique, ajouter 200 μl de fraîchement préparée 80 % EtOH.
- Incuber à température ambiante pendant 30 s et jeter le surnageant. Répéter une fois.
- Maintenir le tube sur le support magnétique et laissez l’air échantillon sécher pendant 15 min.
- Retirer le tube du porte magnétique et Resuspendre le culot dans 27,5 μL de tampon de resuspension. Mélanger soigneusement en pipettant également 10 fois.
- Incuber à température ambiante pendant 2 min, placer le tube dans le support magnétique et attendre que les perles de s’installer sur les bords du tube. Transférer 25 μL de surnageant clair dans un nouveau tube.
13. Préparation de chIP-seq de bibliothèque ; Amplification de Fragments d’ADN
- Place 12,5 µL du modèle dans un PCR de 0,2 mL de tube. Ajouter 2,5 μL d’amorce PCR cocktail, 10 μL de mélange PCR améliorée. Mix soigneusement en pipettant également monter et descendre de 10 fois. Placer le tube sur un thermocycleur et utiliser les conditions décrites dans le tableau 4.
- Vortex magnétique perles et ajouter 25 μL de l’échantillon. Bien mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber 15 min à température ambiante.
- Placer le tube dans le support magnétique, attendez que les perles s’installer sur le côté du tube et décanter le liquide clair.
- Tout en gardant le tube sur le support magnétique, ajouter 200 μl de fraîchement préparée 80 % EtOH. Incuber à température ambiante pendant 30 s et jeter le surnageant. Répéter une fois.
- Garder le tube sur le support magnétique et, laissez l’air de l’échantillon sec pendant 15 min. Retirer le tube du porte magnétique et Resuspendre le culot dans 32,5 μL de tampon de resuspension. Mélanger soigneusement en pipettant également 10 fois. Incuber les
- la PCR/plaque tubulaire pendant 2 min à température ambiante. Placer la tube/plaque PCR sur le support magnétique à température ambiante, attendez que les perles s’installer sur le côté du tube et transférer 30 μL de surnageant dans un nouveau tube.
14. Préparation de chIP-seq de bibliothèque ; Validation de la bibliothèque
Remarque : la validation de la bibliothèque est effectuée à l’aide d’un système de contrôle de la qualité d’ADN et ARN. Préparation de l’échelle : aliquote 1 µL d’échelle d’ADN génomique dans le premier tube/puits et ajouter 3 µL de tampon de.
- Préparation de l’échantillon : mélanger 1 µL de l’échantillon de la bibliothèque (10 à 100 ng/µL) avec 3 µL de tampon d’échantillon dans un tube. Rotation vers le bas, puis vortex sur la vitesse maximale pour 5 s. vitesse de rotation vers le bas pour positionner l’échantillon au fond du tube.
- Charger les échantillons dans le système de contrôle de la qualité.
- Une fois que la série est terminée, analyser les résultats en définissant le contraste à la valeur maximale pour s’assurer qu’aucun dimères d’amorce ne sont présents dans l’échantillon ( Figure 5) ; dimères d’amorce doivent correspondre à une bande d’environ 135 bp. S’il présente encore une faible bande, procéder à un deuxième nettoyage en ajoutant le tampon d’élution (voir la Table des matières) jusqu'à un volume de 50 µL et ajouter 47,5 µL de billes magnétiques mixtes. Si la concentration de l’échantillon est trop faible (< 2 nM), continuez à exécuter le PCR (étape 13,1), à l’aide de 18 cycles au lieu de 15, avec le volume de 12,5 µL de l’échantillon à gauche de l’étape 12.16.
- Quantifier les bibliothèques individuellement en utilisant des kits disponibles dans le commerce de qPCR.
NOTE : Piscines de bibliothèques peuvent être séquencés à l’aide d’un séquenceur avec un simple lecture du protocole de nt 1 x 50 visant à 30 M lectures/échantillon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pour illustrer la performance de notre protocole de puce, nous avons effectué des ChIP-seq expériences utilisant des sections SNT mise en commun des embryons de poulet CM19, maxillaires proéminences de HH22 poulet embryons et les embryons de poulet stade-HH3 pour enquêter sur les profils de liaison de modifications d’histone différents (c.-à-d., H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 et H3K27me3). Une fois la puce ADN ont été obtenues, l’efficacité de la sonication a été évaluée par électrophorèse sur gel d’agarose de l’ADN d’entrée correspondantes (Figure 3). Ensuite, la puce et l’entrée DNAs servaient pour puce-qPCR analyse pour mesurer les enrichissements au locus devraient être soit lié ou non lié par les modifications d’histone étudiés (Figure 4 a). Dans l’exemple illustré à la Figure 4 a, H3K27me3 et H3K4me3 d’enrichissement des niveaux dans les sections CM19 SNT ont été évalués par ChIP-qPCR autour des régions promotrices de SOX17 et SOX2, deux gènes qui sont inactifs et actives dans la SNT, respectivement. Comme prévu, le promoteur SOX2 est fortement marqué par H3K4me3 mais pas de H3K27me3, tandis que le promoteur SOX17 a montré le modèle opposé (Figure 4 a). En évaluant quelques locus, il est possible d’estimer la qualité de la puce sans perdre beaucoup de matériel ADN pour l’analyse en aval de ChIP-seq. Une fois que la qualité des copeaux a été confirmée, ChIP-seq bibliothèques ont été préparés et séquencés. Locus représentatifs sont indiqués pour chacun des tissus embryonnaires poulet enquête : (i) les profils pour H3K27me3 et H3K4me3 chez les embryons de poussins SNT de CM19 autour PAX7 (Figure 4 b) ; (ii) les profils pour H3K4me2 et H3K27ac dans les maxillaires proéminences des embryons de poulet de HH22 près de SNAI1 (Figure 4) ; et (iii) profil pour H3K27me3 dans des embryons de poulet HH3-étape autour du locus TBX3/TBX5 (Figure 4). Ces expériences de ChIP-seq illustrent clairement que notre protocole de puce peut être utilisé pour générer des profils épigénomique de quantités limitées de matières biologiques dans un large éventail de tissus embryonnaires.
Figure 1 : vue d’ensemble schématique du protocole ChIP pour faible abondance embryonnaires échantillons isolés des embryons de poulet. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : bref aperçu du protocole SNT Microdissection. Le segment SNT transversal est coupé au niveau d’un embryon de poulet CM19 brachial. Après traitement par la trypsine, le tissu non neural est enlevé mécaniquement à l’aide de pinces. Non, la notochorde ; SNT, la colonne vertébrale du tube neural ; et oui, somite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : exemple de la Sonication optimale. Un échantillon de poulet SNT CM19 était sonication pour 11 cycles, avec 30 s et 45 s OFF PULSE à amplitude « élevé » en utilisant un sonicateur. Les croisements ont été renversées et l’ADN purifié a été résolu sur un gel d’agarose de 1,5 %. La taille optimale de fragment est observée après 11 cycles, allant de 200 à 500 BP. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : exemples d’analyse de la puce par ChIP-qPCR ou ChIP-Seq. (A) H3K27me3 (à gauche) et H3K4me3 (à droite) niveaux dans les régions indiquées ont été mesurées par ChIP-qPCR analyse effectuée à l’aide de sections SNT isolées des embryons de poulets CM19. La région promotrice de SOX2 est active dans la SNT et est ainsi marquée par H3K4me3 mais pas de H3K27me3 ; la région promotrice de SOX17 est inactive dans la SNT et est donc enrichie en H3K27me3 mais pas en H3K4me3 ; Chr6 Neg représente une région intergénique chromosome poulet 6 et sert de témoin négatif. Barres d’erreur représentent l’écart de trois répétitions techniques. (B) ChIP-seq (H3K27me3 en magenta, H3K4me3 en bleu et entrée en rouge) des profils à partir des embryons de poulets programme de CM14 apparaissent autour du locus PAX7. (C) ChIP-seq (H3K4me2 orange, H3K27ac en vert et entrée en rouge) des profils des maxillaires proéminences des embryons de poulet HH22 apparaissent autour du locus SNAI1. (D) ChIP-seq (H3K27me3 en magenta) et entrée en rouge des profils d’embryons de poulets HH3 apparaissent autour du locus TBX3/TBX5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : exemple de ChIP-seq bibliothèque Validation utilisant le système de contrôle de la qualité de RNA Automated. Les bibliothèques de ChIP-seq mêmes ont été analysées avec le système automatisé de contrôle de la qualité des RNA avant (A) et après (B) nettoyage d’amorce dimère. Dimères d’amorce peuvent être considérées comme une faible bande de bp ~ 135 (a). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Mesures | Problème | Raisons possibles | Solution |
| 1,2,3,4 5 et 11 | Puce de bas rapports signal sur bruit selon ChIP-qPCR ou ChIP-seq | Tissu de qualité en souffre. | Effectuer des micro-dissections par temps froid ; dans le cas contraire l’intégrité de la chromatine est compromise. |
| Perte d’échantillon après centrifugation des échantillons réticulé. | Utiliser le milieu DMEM avec 10-20 % de sérum ou étape de centrifugation répéter et augmenter le temps de 10 min. | ||
| Durée de réticulation. | Optimisez le temps de réticulation. Temps de réticulation accrue peuvent faciliter la détection de certaines protéines, telles que les activateurs de co et co répresseurs qui ne lient pas à l’ADN directement. | ||
| Perte d’échantillon due à multiples lavages en PBS. | Réduire le nombre de lavages ; étapes de centrifugation peuvent être répétées à 1 500 g. | ||
| Sous-optimale sonication résultant en tailles d’ADN soit trop longues ou trop courtes. | Réaliser une expérience de cours de temps pour optimiser les conditions de la sonication. Taille de fragment optimale allant de 200 à 500 bp | ||
| Anticorps ne convient pas pour la puce. | Utilisez un autre anticorps contre la protéine endogène ou un anticorps dirigé contre une balise ajouté à une protéines exogènes exprimées (par ex. drapeau, HA). | ||
| 12 | Peu ou pas de signaux en qPCR, même pour l’entrée ADN | Amorces sous-optimale | Vérifier l’efficacité de l’apprêt et la spécificité ; concevoir de nouvelles amorces. |
| Quantité insuffisante de l’ADN | Pas assez produit de départ. Augmenter la quantité d’ADN utilisé par réaction de qPCR. |
| Amorces | Séquence |
| SOX2-F | CCTTGCTGGGAGTACGACAT |
| SOX2-R | GCCCTGCAGTACAACTCCAT |
| SOX17-F | CCCTGAACTGTCATGTGTGG |
| SOX17-R | CAAACAGTTGCCTTTGAGCA |
| Chr6-neg-F | CCGTCAATCTCTGCTTGTGA |
| Chr6-neg-R | TGGAATCTGCTTGTCACTGC |
Tableau 2 : Séquences d’amorces pour puce-qPCR.
| Préincubation | ||
| Température | Temps | |
| 95 ° C | 5 min | |
| Amplification | ||
| Température | Temps | |
| 95 ° C | 10 s | |
| 60 ° C | 10 s | 45 |
| 72 ° C | 10 s | Cycles |
| Courbe de fusion | ||
| Température | Temps | |
| 95 ° C | 5 s | |
| 65 ° C | 1 min | |
| De refroidissement | ||
| 40 ° C | 30 s | |
Tableau 3 : Les Conditions PCR pour puce-qPCR.
| Dénaturation initiale | ||
| Température | Temps | |
| 95 ° C | 3 min | |
| Amplification | ||
| Température | Temps | |
| 98 ° C | 20 s | |
| 60 ° C | 15 s | 15 |
| 72 ° C | 30 s | Cycles |
| Extension finale | ||
| Température | Temps | |
| 72 ° C | 5 s | |
| De refroidissement | ||
| 4 ° C | Maintenez | |
Tableau 4 : Les Conditions PCR pour l’Amplification de Fragments d’ADN lors de la préparation de bibliothèque de ChIP-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Épigénomique profilage de modification d’histone à l’aide de ChIP-seq peut être utilisé pour améliorer l’annotation fonctionnelle des génomes de vertébrés dans différents contextes cellulaire4,5,18. Ces profils épigénomique peuvent être utilisés, entre autres, d’identifier les éléments d’enhancer, pour définir l’État réglementaire des activateurs (c'est-à-dire actif, apprêtée, ou sur le point) et de définir des régulateurs d’identité cellulaire majeur dans différent biologique ou contextes pathologiques (par exemple, grands domaines de promoteur H3K4me3 et super-exhausteurs)6,7,9,10,11,19. Toutefois, en raison de la limitation inhérente de l’analyse de la puce, qui nécessite généralement des millions de cellules, la plupart modification d’histone profils ont été générés dans les lignées de cellules in vitro et cellules de types qui peuvent être triés en vivo en grande quantité 4. plus récemment, plusieurs protocoles de ChIP-seq ont été décrites qui sont compatibles avec le nombre de cellules extrêmement faible, élargissant ainsi considérablement l’éventail des types de cellules et tissus dans lequel épigénomique profils peuvent, en principe, être généré13 ,14,15,16. Ces nouveaux protocoles de ChIP-seq chaque s’appuient sur des méthodes de préparation bibliothèque spécifiques ad hoc qui, au moins dans certains cas, exigent un équipement non standard et/ou réactifs14,15,16.
Nous décrivons ici un protocole de puce qui fonctionne à faible ou nombre de cellules intermédiaires (5 x 104 - 5 x 105 cellules) provenant de différents tissus embryonnaires10 in vivo . Pour augmenter la sensibilité de nos tests de puce, nous avons éliminé plusieurs étapes normalement utilisés au cours de la puce, telles que la cellule séquentielle et lyse nucléaire, ce qui peut entraîner une perte progressive de la matière précieuse. Ainsi, après réticulation, les échantillons sont traités avec un tampon de lyse unique et sont par la suite sonication pour minimiser la perte de l’échantillon. Important, notre protocole de puce est compatible avec l’analyse qPCR, permettant ainsi l’analyse épigénomique du locus choisis d’intérêt. En outre, notre protocole de puce est cumulable avec les méthodes standards de ChIP-seq bibliothèque préparation, ce qui en fait potentiellement utiles à la plupart des laboratoires avec accès à la technologie de séquençage de prochaine génération.
ChIP et ChIP-seq protocoles peuvent être utilisés non seulement pour enquêter sur les profils de liaison des modifications des histones, mais aussi pour découvrir les sites de liaison des autres régulateurs transcriptionnels importants, tels que les facteurs de transcription et co activateurs (p. ex., P300 et CBP)20. Puces (et ChIP-seq) facteurs de transcription et activateurs de co, qui ne sont pas aussi abondantes que les histones, exigent généralement, beaucoup plus des matériaux que les puces pour histone marks. Ainsi, le protocole décrit ne pourrait pas nécessairement fonctionner pour la plupart des facteurs de transcription ou activateurs Co à moins que le nombre de départ cellules est considérablement accru (p. ex., 5 x 105 - 5 x 106 cellules) ou très spécifiques et les anticorps efficaces sont disponibles. Néanmoins, avec l’optimisation supplémentaire ainsi que les méthodes de préparation de bibliothèque en constante amélioration, nous prévoyons que ChIP-seq du matériel cellulaire limité deviendra possible pour la plupart des protéines régulatrices.
Bien que nos protocoles de ChIP et ChIP-seq ont été largement validées pour une variété de modifications d’histone et tissus embryonnaires, nous aimerions mettre en évidence certaines étapes critiques que nous considérons comme essentiels pour générer des profils de qualité épigénomique. Tout d’abord, les échantillons embryonnaires doivent être fraîchement isolés dans des conditions qui ne compromettent pas l’intégrité de la chromatine. Ceux-ci incluent effectuant des dissections dans des conditions froides ou flash-congélation des échantillons jusqu'à ce que suffisamment de matière s’accumule. Une autre étape critique est la sonication, qui doit être optimisée avec précision pour réaliser des copeaux de haute qualité. Des conditions optimales de sonication fréquemment varient en fonction du type de tissu, la quantité de tissu, ou le sonicateur utilisé. Dernier point mais non le moindre, une puce réussie s’appuie finalement sur la disponibilité de spécifique et compatible avec puce anticorps dirigés contre les protéines d’intérêt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont pas tout intérêt financier concurrentes doivent être divulgués.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Jan Appel pour son excellente assistance technique lors de la mise en place du présent protocole. Travail dans le laboratoire de Rada-Iglesias est pris en charge par CMMC intra-muros financement, subventions de recherche du DFG (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 et TE 1007/3-1), le chercheur avancé UoC groupe Grant et l’octroi de CECAD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH 8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1 Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100 - 1,000 µL Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2 - 20 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2 - 200 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5 - 10 µL Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10 mL) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Kouzarides, T.
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K.
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
- Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
- Ho, J. W. K., et al.
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
