Summary
Здесь мы описываем иммунопреципитации chromatin (обломока) и чип seq библиотека подготовки протокола для создания глобального epigenomic профили из эмбриональных образцов куриного низким изобилие.
Abstract
Иммунопреципитации Chromatin (обломока) — это метод широко используется для сопоставления локализации post-translationally модифицированных гистонов, гистонов варианты, факторов транскрипции или chromatin изменения ферментов в данном локусе или геном масштабе. Сочетание чип анализов с следующего поколения последовательности (то есть чип-Seq) представляет собой мощный подход глобально раскрыть генных сетей регулирования и улучшения функционального Аннотация геномов, особенно некодирующих последовательностей регулирования. Протоколы обломока обычно требуют большого количества клеточным материалом, исключая, таким образом, применимость данного метода расследованию типы редких клеток или биопсии малых тканей. Для того, чтобы сделать пробирного чип совместим с количество биологического материала, которые обычно могут быть получены в естественных условиях в раннем эмбриогенезе позвоночных, опишем здесь упрощенный протокол чип, в котором количество шагов, необходимых для завершения пробы были сокращены свести к минимуму потери образца. Этот чип протокол успешно использовался для изучения различных гистона изменения в различных эмбриональные куриные и тканей взрослой мыши с помощью низкого числа средних клеток (5 х 104 - 5 x 105 клеток). Важно отметить, что этот протокол совместим с чип seq технологии с использованием методов подготовки стандартной библиотеки, обеспечивая тем самым глобальное epigenomic карты в весьма актуальным эмбриональных тканей.
Introduction
Столб-поступательные изменения гистона непосредственно участвуют в различных хроматина зависимых процессов, включая транскрипции и репликации ДНК ремонт1,2,3. Кроме того, различные гистона изменения показывают положительные (например, H3K4me3 и H3K27ac) или отрицательным (например, H3K9me3 и H3K27me3) корреляции с экспрессии генов и может быть широко определены как активация или репрессивных гистона метки, соответственно2,3. Следовательно глобальные гистона модификации карты, также упоминается как epigenomic карты, превратились в мощные и универсальные инструменты функционально аннотировать позвоночных геномов4,5. Например, дистальная регулирования последовательности такие как усилители могут быть определены основаны на наличие конкретных хроматина подписи (например, Активные расширители: H3K4me1 и H3K27ac), которые отличают их от проксимальных промоутер регионов (например, активных промоутеров: H3K4me3)6,,78. С другой стороны гены с крупных клеток личность регулирующих функций обычно встречаются с широким хроматина доменов, отмеченные H3K4me3 или H3K27me3, в зависимости от транскрипционно активным или неактивным статус основных генов, соответственно9 ,10. Аналогично выражение основных клеток идентификации генов кажется, часто контролироваться многочисленными и пространственно кластерного усилители (т.е., супер-усилители), которые могут быть определены как широкий H3K27ac-отмечен доменов11.
В настоящее время изменения гистона карты создаются с помощью чип seq технологию, которая по сравнению с предыдущих подходов, таких как чип микросхема (чип в сочетании с microarrays) обеспечивает более высокое разрешение, меньше артефактов, меньше шума, большего охвата и нижнего 12расходы. Тем не менее поколение epigenomic карт с помощью технологии ChIP-seq имеет свои присущие ограничения, главным образом связанные с успешно выполнять чип в образцах, представляющих интерес. Традиционные протоколы обломока обычно требуются миллионы клеток, который предел применимости этого метода в пробирке клеток линии или клетки, которые могут быть легко изолированных в естественных условиях (например, клетки крови). В последние несколько лет количество измененных протоколы обломока, совместимый с низкой сотовый номера были описаны13,14,,1516. Однако эти протоколы специально разработаны, чтобы быть в сочетании с следующего поколения последовательности (то есть чип seq), и они обычно используется Специальная библиотека подготовка методы13,14, 15 , 16.
Здесь, мы описали чип протокол, который может использоваться для расследования гистона модификации профилей с помощью числа низкой для промежуточных клеток (5 х 104 - 5 x 105 клеток) либо отдельных локусах (т.е., чип ПЦР) или глобально (т.е. Чип seq) (рис. 1). При сочетании технологию чип seq, наш чип протокол может использоваться вместе с методами подготовки стандартной библиотеки, таким образом делая его широко доступными для многих лаборатории10. Этот протокол был использован для изучения нескольких меток гистона (например, H3K4me3, H3K27me3 и H3K27ac) в различных курица эмбриональных тканях (например, спинного нервной трубки (СНТ), лобно протуберанцы и Эпибласт). Однако мы ожидаем, что он должен быть широко применим для других организмов, в которых биологически или клинически соответствующие образцы можно только получить в малых количествах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
согласно директивам немецкий ухода за животными, не институциональный уход за животными и использования Комитет (IACUC) одобрение было необходимо для выполнения экспериментов куриного эмбриона. По данным местных руководящих принципов только эксперименты с куриных эмбрионах (18 день) в HH44 и старше требуют утверждения IACUC. Однако, эмбрионы, используемые в данном исследовании были все в более ранних стадий эмбрионального развития (т.е., HH19 (72 ч.)).
Примечание: целью настоящего Протокола является предоставить подробное описание пробирного чип, так что он может эффективно сочетаться с ПЦР или секвенирование нового поколения (т.е., чип seq) расследовать изменения гистона в низкий изобилие эмбриональных образцов (начиная с 5 x 10-4-5 x 10 5 клетки для каждого чипа реакции) и типы различных тканей ( рис. 1). Протокол должен быть применим к расследованию профили связывания транскрипционных факторов и Сопредседатель возбудителей (например, p300). Однако, из-за более низких обилие этих регуляторных белков, большего числа клеток, вероятно, требуется (5 x 10 5 - 5 х 10 6 клеток для каждой реакции чип).
1. Подготовка яйца и Microdissection курица СНТ
Примечание: процедура microdissections технически отличается от ткани ткани и модели на животных в животной модели. В этом разделе описывается подробно рассечение протокол используется для получения плечевая СНТ секций от стадии HH19 куриных эмбрионах в качестве примера.
- Инкубировать плодородные белый леггорн куриные яйца, полученные от местного заводчика, в горизонтальной ориентации при 37 ° C и 80% влажности для 3 дней, чтобы получить этап HH19 куриных эмбрионах.
- Определить этапы согласно гамбургер и Гамильтон курица эмбрионального развития промежуточной системы 17.
- Выполняют все microdissections в холодных условиях; в противном случае, может быть нарушена целостность хроматина.
- Изолировать эмбрионов HH19.
- Чтобы сделать доступным эмбрионы, экстракт 3 мл альбумина с помощью 10-мл шприца с иглой (0,90 x 40 мм) для снижения бластодермы.
- Сделать небольшое отверстие в яйцо, с помощью тонкой ножницы и добавить 1 мл раствора Локк (см. Дополнительные материалы для рецепта) для облегчения удаления экстра зародышевых оболочек.
- Придать 10% индийских черные чернила/Локка раствор с помощью 1 мл шприц с иглой (2 0.55 x 25 мм) под бластодермы для облегчения визуализации эмбрионов.
- Отрезать экстра эмбриональных мембраны, которая окружает эмбриона, используя медицинские Ножницы хирургические штраф и пинцет.
- Для передачи эмбриона на 4,5 см Петри, содержащий 20 мл 1 x PBS решения используйте перфорированной ложкой.
- Вскрыть прочь, амнион и оставшиеся части экстра эмбриональных мембраны, с помощью тонкой ножниц и щипцы под стереомикроскопом.
- Вырезать поперечной СНТ сегмент на уровне плечевого эмбриона, расширяя каудально в область грудной клетки изолировать СНТ ( рис. 2).
- Удаление тканей, которые окружают боково/вентрально СНТ (например, боковой пластине мезодермы, эктодермы, Хорда и аорты) с помощью щипцов ( рис. 2).
- Погружать каждого цыпленка Анатомированное СНТ сегмента в 3,5 см Петри, содержащий 5 мл теплой (37 ° C) трипсина (трипсина/ЭДТА раствор 1: 250).
- Остановить лечение трипсина, когда отпускать не нервных тканей вокруг СНТ обнаружено под стереомикроскопом.
Примечание: Время trypsinization должны жестко контролироваться во избежание чрезмерной пищеварение и дисперсия нервной ткани и сохранить структурную целостность СНТ. - После лечения трипсина, удалите оставшиеся мезенхимальных и эктодермы ткани вручную подготовить чистый участок СНТ.
- Секция СНТ передачи в 1,5 мл трубку и флэш замораживания ее в жидком азоте. После достаточного СНТ секции накопленные (бассейн СНТ разделы от ~ 30 куриных эмбрионах один чип реакции), хранить на -80 ° C.
Примечание: Если достаточно эмбриональных тканей (т.е. 5 x 10 5-5 х 10 6 клеток) могут быть расчленены от одного или несколько куриных эмбрионах, затем замораживания не является необходимым и можно приступить непосредственно к выполнению следующих шагов. Пожалуйста, обратитесь к руководству Устранение неполадок в таблице 1.
Примечание: осторожно! Жидкий азот имеет крайне низкие температуры, носить соответствующую защиту.
2. Сшивки белки ДНК: 1 день
Примечание: выполнить все шаги на льду, если не указано иное.
- Добавить 500 мкл DMEM с 10% FBS и 10 мкл 1 M Na бутират непосредственно на замороженные ткани или, альтернативно, сразу к свежей Иссеченную ткань. Однородный клетки приостановив нежно заново с 1 мл пипетки.
Примечание: Добавление Na бутират необязательно, но рекомендуется если расследование ацетилирование гистонов. Вместо того чтобы FBS DMEM - 10% образцы можно высокомобильна в однократном ПБС с 0.1% BSA. Добавление FBS или BSA является необязательным, но оно облегчает гранулирование образцы в последующих центрифугирования шаги. - 13,5 мкл 37% формальдегида (1% формальдегида финал) и поместите его на вращателе 15 мин при комнатной температуре.
Примечание: осторожно! Формальдегид токсичных. - 25 мкл 2,5 метров глицина к трубе и поместите его на ротатор за 10 мин при комнатной температуре, чтобы утолить формальдегида.
- Спина трубки на 850 x g 5 мин при 4 ° C в центрифуге столешницы. Отбросить супернатант.
- Помыть лепешка однажды с 500 мкл холодной свежеприготовленные мыть буфера (см. Дополнительные материалы для рецепт), центрифуги на 850 x g и 4 ° C за 5 мин и отбросить супернатант.
3. Лизис и Sonication
- подготовить полный лизис буфера (LB) (см. Дополнительные материалы для рецепт) и холод на льду. По 1 мл, используйте 950 мкл LB, 40 мкл концентрированного препарата ингибитор протеазы (25 x) и 10 µL 100% PMSF.
- Ресуспензируйте гранулы в 300 мкл полного LB, закупорить и поместите его на качающейся платформе для 10 мин на 4 ° C.
- Sonicate образцы, используя следующие параметры: Temp = 4 ° C, общее время = 7 минут, “ на ” интервал = 30 s, “ у ” интервал = 30 с, амплитуда = 25%
Примечание: Sonication условия должны быть оптимизированы для каждой ткани и будет меняться в зависимости от используемых sonicator. Рекомендуется использовать низкие параметры sonication, которые приводят к стриженый ДНК, начиная от 200 до 600 bp в размер. Стрижка варьируется в зависимости от типа ткани, quantiты, sonication объем, сшивки условия и оборудование. Пожалуйста, обратитесь к руководству Устранение неполадок в таблице 1. - Спина sonicated образца на 16000 x g 10 мин при 4 ° C для пеллет сотовой мусора.
- Передать свежие 1,5 мл lysate (супернатант).
Примечание: Если исходный материал считается достаточным для двух экспериментов чип, затем 300 мкл полного LB могут быть добавлены к sonicated хроматина (то есть, окончательный объем: 600 мкл). - Добавить 30 мкл 10% octylphenol ethoxylate за каждые 300 мкл sonicated lysate (конечная концентрация: 1%) и перемешать, закупорить.
Примечание: осторожно! Octylphenol ethoxylate острой токсичностью (устный, кожных, ингаляции).
4. Антитело инкубации
- Алиготе 330 мкл sonicated lysate в две 1,5 мл трубы: 300 мкл для чипа и 30 мкл как элемент управления вводом (10% от исходного материала). Магазин " 30 мкл пример управления ввода " в -20 ° с.
Примечание: Если два чипа реакции выполняются из того же образца, а затем 660 мкл sonicated lysate могут быть распределены в три пробирки 1,5 мл (300 мкл чип #1, 300 мкл чип # 2 и 60 мкл как элемент управления вводом (20% от исходного материала каждого чипа) ). - Добавить 3-5 мкг антитела к 300 мкл sonicated хроматина аликвота и инвертировать смешивать.
Примечание: В этом исследовании, каждый чип реакция была выполнена с антител специфических для tri гистонов H3 метилированию на К4 (H3K4me3), гистонов H3 ди метилированию на К4 (H3K4me2), гистонов H3 tri метилированию на поезд K27 (H3K27me3) и ацетилирование гистонов H3 tri на поезд K27 (H3K27me3). Успех этого протокола полностью зависит от качества используемых антитела. Антитело должны быть конкретными и эффективными в иммунопреципитации определенного белка. Важно определить количество антител, который может использоваться для immunoprecipitate высокоструктурированные протеин дна комплекс. Кроме того специфичность антитела могут проверяться иммуноблоттинга обеспечить, что он обнаруживает правильный белка. Антитело, который обнаруживает несколько неспецифических полос не рекомендуется для чипа. - Место трубки на качающейся платформе при 4 ° C на ночь (12-16 h) для связывания антител к хроматина.
Примечание: Пожалуйста, обратитесь к руководству Устранение неполадок в таблице 1.
5. Подготовка магнитной бусины: день 2
- аликвота 50 - 100 мкл белок G/магнитный шарик навоза для каждого чипа реакции в 1,5 мл отцентрифугировать трубки на ДВС.
- Мыть магнитные шарики три раза с холодной блок решения (см. Дополнительные материалы для рецепта) (4 ° C). Добавьте 500 мкл холодного блока раствора и перемешивают, переворачивать или стряхивая. Положите трубку в магнитный держатель и ждать бус поселиться на стороне трубки. Слить прозрачная жидкость и повторить. После последнего вымыть, удалить все жидкие с кончиком гель загрузки.
6. Иммунопреципитации Chromatin
- 300 мкл антител прыгните хроматина промывают бисером и инвертировать смешивать.
- Повернуть вертикально на вращателе трубки на 4 ° C для по крайней мере 4 h для связывания антител к бисеру.
7. Вымойте, элюировать и обратить вспять сшивки
- Chill Буфер RIPA мыть (см. Дополнительные материалы для рецепта) на льду, установить водяной бане до 65 ° C и precool центрифугирования до 4 ° C.
- Мыть хроматина прыгните бусины четыре раза в 1 мл холодную РИПА мыть буфера и держать на льду. Чтобы сделать это, добавьте 1 mL холодной Буфер RIPA мыть и микс переворачивать или стряхивая. Положите трубку в магнитный держатель и ждать бус поселиться на стороне трубки. Слить прозрачная жидкость и повторите.
Примечание: Количество моек с мыть Буфер RIPA может потребоваться быть оптимизированы в зависимости от типа образца, обилие образцов и антитела используются. Увеличение количества стирок будет уменьшаться фон но также уменьшение общее количество восстановленных ДНК, которая может поставить под угрозу течению анализ ПЦР или чип след - Добавить 1 мл TE/50 мм NaCl в трубку и передать свежие отцентрифугировать 1,5 мл трубки хроматина прыгните бусины в TE/50 мм NaCl перед удалением жидкости с помощью магнитного держателя, как описано выше.
- Спина бусы на 900 g x 3 мин при температуре 4 ° C, установите трубку обратно в магнитный держатель и удалить все оставшиеся TE с наконечником гель загрузки.
- Добавить 210 мкл буфера (см. Дополнительные материалы для рецепт) при комнатной температуре и Ресуспензируйте, стряхивая.
- Elute 15 мин при температуре 65 ° C в блоке тепла при встряхивании.
- Спина бусы на 16000 x г за 1 мин при комнатной температуре и положите трубку в магнитный держатель.
- Передать свежие отцентрифугировать трубки супернатант (~ 200 мкл), после того как бусы поселились.
- Оттепель входные контрольные образцы (30 мкл) от-20 ° C до комнатной температуры (замороженная в шаге 4.1), добавить 3 тома Элюирующий буфер (90 мкл) и перемешать кратко vortexing.
- Проинкубируйте образцы чип и контроля при 65 ° C ночь (12-16 ч) в обратном сшивки.
8. Дайджест клеточных белков и РНК: день 3
- 8.1At комнатной температуре, добавить 1 объем буфера TE в трубку (для разбавления ИКБ) и инвертировать смешать: 120 мкл TE 120 мкл пример элемента управления и 200 мкл TE до 200 мкл пример чип.
- Добавить РНКазы A до конечной концентрации 0,2 мг/мл и инвертировать смешать: 2.4 мкл 20 мг/мл РНКазы A до 240 мкл пример элемента управления и 4 мкл 20 мг/мл РНКазы A до 400 мкл пример чип.
- Инкубировать трубы при 37 ° C на водяной бане 2 h переваривать РНК.
- Добавить протеиназы K до конечной концентрации 0,2 мг/мл и инвертировать смешать: 2.4 мкл 20 mg/ml протеиназы K до 240 мкл пример элемента управления и 4 мкл 20 mg/ml протеиназы K до 400 мкл пример чип.
- Инкубировать в 55 ° C на водяной бане 2 h переварить белок и очищают ДНК.
9. Чип ПЦР
Примечание: выполнять экстракции ДНК и очистки, как описано в Дополнительных материалах.
Примечание: Проверка эффективности sonication, как описано в Дополнительные материалы, чтобы подтвердить, что фрагменты ДНК 200-500-ВР получаются ( рис. 3).
Примечание: критический шаг заключается в определении, если чип на самом деле работали. Если известны геномные привязки сайтов для протеина интереса, грунты могут разрабатываться для количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения, если известные сайты специально обогащены в чип ДНК, по сравнению с отрицательным управления регионами не ожидается, что обязательность КандиДата белков. Например, эта работа показывает чип ПЦР результаты, полученные с чипами для H3K4me3 (активный пропагандист гистона Марк) и H3K27me3 (неактивные промоутер гистона Марк) в разделах СНТ, изолированных от HH14 куриных эмбрионов ( Рисунок 4A ).
- Mix каждой пары праймера (вперед и назад) в том же трубку и подготовить запасов концентрация на 20 мкм каждый с использованием dH 2 O (Таблица 2).
Примечание: перед чип ПЦР анализа следует оценивать эффективность каждой пары праймера. - Использовать чип и 20% управления вводом ДНК, полученный на шаге 8.5 для оптимизации ПЦР.
Примечание: Вход ДНК, обычно разбавляют 20 x (до 1% от исходного материала, используемых в реакциях чип) для анализа ПЦР. - Для каждого 10 мкл PCR, смесь следующие компоненты в ПЦР-пробирку: для ДНК mastermix, добавить 2 мкл dH2O, 2,5 мкл SYBR Зеленый микс и 1 мкл ДНК (от чип или ввода 1%); для mastermix с праймерами , 2,375 мкл dH2O, 2,5 мкл SYBR Зеленый микс и 0,125 мкл смеси прямого и обратного грунтовка.
- Смешать образцы по vortexing для 2 s и кратко центрифуги на 900 x g за 1 мин
- Выполнять ПЦР в реальном времени (пример грунтовки и Велоспорт условий, здесь можно найти в таблице 2 и таблице 3, соответственно).
Примечание: Чип ПЦР анализ данных: чип сигналы рассчитываются как процент ввода. Вкратце, однажды Ct значения получаются для каждой реакции ПЦР, коэффициент разбавления 100 или 6.644 циклов (log2 100) применяется к Ct значения, полученные для ввода ДНК реакций. Затем, для данного региона интереса (то есть, грунтовка пара), чип сигналы рассчитываются следующим:
скорректированы ввода = Ct (вход) - 6.644
чип сигнала = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)
10. чип seq библиотеки подготовка; Окончания ремонта: День 4
- разбавлять до 100 нг чип-ДНК в 60 мкл буфера (см. материалы в таблице).
- Добавить 40 мкл окончания ремонта микс и Пипетка нежно 10 раз.
- Инкубировать на 30 ° C в течение 30 мин на тепловой cycler.
- Вихревые магнитные бусы и добавить 160 мкл трубка, содержащая конце ремонта микс. Тщательно перемешать, закупорить 10 раз. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
- Установите трубку в магнитный держатель и ждать бусины поселиться на стороне трубки...
- Слейте прозрачная жидкость.
- При сохранении трубки на магнитный держатель, добавить 200 мкл свежеприготовленные 80% EtOH.
- Инкубировать при комнатной температуре за 30 s и удалить супернатант. Повторить один раз..
- Держите трубку для 15 мин на магнитный держатель при комнатной температуре. После того, как гранулы сухого, снять трубку с магнитным держателем.
- Ресуспензируйте гранулы в 20 мкл буфера ресуспендирования. Аккуратно Пипетка 10 раз перемешать тщательно.
- Инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре.
- Положите трубку в магнитный держатель и ждать бус поселиться на стороне трубки. Передать новой трубки 17,5 мкл супернатант.
11. Чип seq библиотеки подготовка; Adenylate 3 ' заканчивается
- мкл добавить 12,5 A-хвостохранилища смеси к новой трубки и перемешать тщательно, нежно закупорить вверх и вниз по 10 раз. Трубку на тепловая велосипедист и инкубировать по следующей программе: 37 ° C за 30 мин., 70 ° C за 5 мин и удерживайте на 4 ° C
12. Чип seq библиотеки подготовка; Перевязать адаптеры
- Добавить 2,5 мкл ресуспендирования буфера, 2.5 мкл лигирование смеси и 2,5 мкл соответствующего индекса адаптера РНК. Смесь тщательно, нежно закупорить вверх и вниз по 10 раз.
- Инкубировать на тепловой cycler для 10 мин при 30 ° с.
- Добавить 5 мкл стоп лигирование буфера и микс от тщательно закупорить 10 раз.
- Вихревые магнитные бусы и добавить 42,5 мкл пример. Тщательно перемешать, закупорить 10 раз. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
- Поместите трубку в магнитный держатель и ждать бусины урегулировать на стороне трубки и слить прозрачная жидкость
- При сохранении трубки на магнитный держатель, добавить 200 мкл свежеприготовленные 80% EtOH.
- Инкубировать при комнатной температуре за 30 s и удалить супернатант. Повторить один раз.
- Держите трубку на магнитный держатель и, пусть образец просушите на 15 мин.
- Снять трубку из магнитного держателя и Ресуспензируйте гранулы в 52,5 мкл буфера ресуспендирования. Тщательно перемешать, закупорить 10 раз. Инкубации при комнатной температуре на 2 мин, положите трубку в магнитный держатель и ждать бус поселиться на стороне трубки. Передача 50 мкл ясно супернатант к новой пробке.
- Вихревые магнитные бусы и добавьте 50 мкл пример. Тщательно перемешать, закупорить 10 раз. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
- Положите трубку в магнитный держатель и ждать бусины урегулировать на стороне трубки и слить прозрачная жидкость.
- При сохранении трубки на магнитный держатель, добавить 200 мкл свежеприготовленные 80% EtOH.
- Инкубировать при комнатной температуре за 30 s и удалить супернатант. Повторить один раз.
- Держите трубку на магнитный держатель и, пусть образец воздух сухой в течение 15 мин.
- Снять трубку из магнитного держателя и Ресуспензируйте гранулы в 27,5 мкл буфера ресуспендирования. Смесь тщательно по 10 раз для пипетирования.
- Инкубировать при комнатной температуре на 2 мин, положите трубку в магнитный держатель и ждать бус поселиться на стороне трубки. Передать новой трубки 25 мкл ясно супернатант.
13. Чип seq библиотеки подготовка; Амплификация фрагментов ДНК
трубка- место 12,5 мкл шаблона в 0.2 мл ПЦР. Добавьте 2,5 мкл PCR праймер коктейль, 10 мкл расширенной ПЦР mix. смесь тщательно закупорить вверх и вниз по 10 раз. Установите трубку на тепловая велосипедист и использовать условия, описанные в таблице 4.
- Вихревые магнитные бусы и добавить 25 мкл пример. Тщательно перемешать, закупорить 10 раз. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
- Положите трубку в магнитный держатель, подождите бусины урегулировать на стороне трубки и слить прозрачная жидкость,.
- При сохранении трубки на магнитный держатель, добавить 200 мкл свежеприготовленные 80% EtOH. Инкубации при комнатной температуре за 30 s и удалить супернатант. Повторить один раз.
- Держите трубку на магнитный держатель и, пусть образец воздуха сухая на 15 мин снять трубку из магнитного держателя и Ресуспензируйте гранулы в 32,5 мкл буфера ресуспендирования. Смесь тщательно по 10 раз для пипетирования. Инкубировать
- ПЦР трубка/плита на 2 мин при комнатной температуре. Трубка/пластину ПЦР на магнитные стоять при комнатной температуре, ждать бусины поселиться на стороне трубки и передать новой трубки 30 мкл супернатант.
14. Чип seq библиотеки подготовка; Библиотека проверки
Примечание: Проверка библиотеки выполняется с помощью системы контроля качества ДНК и РНК. Подготовка по лестнице: аликвота 1 мкл геномной ДНК лестницы в первом трубка/Ну и 3 мкл пример буфера.
- Подготовка образца: Смешайте 1 мкл пример библиотеки (10-100 нг/мкл) с 3 мкл пример буфера в трубку. Спин вниз, а затем вихря на максимальной скорости для 5 s. спин вниз положение образца в нижней части трубки.
- Загрузить образцы в системе управления качеством.
- После запуска, анализировать результаты, установив контраст максимальное значение, чтобы убедиться, не Димеры праймера присутствуют в образце ( рис. 5); Димеры праймера должно соответствовать на диапазон около 135 bp. Если присутствует даже слабые группы, перейти к второй очистки путем добавления Элюирующий буфер (см. Таблицу материалы) до 50 мкл тома и 47.5 мкл смешанных магнитной бусины. Если концентрация образца является слишком низким (< 2 Нм), перейдите к запустите ПЦР (шаг 13.1), используя 18 циклов вместо 15, с объемом 12,5 мкл пример слева от шага 12.16.
- Количественно библиотек индивидуально по ПЦР, используя имеющиеся наборы.
Примечание: Бассейны библиотеки можно упорядочивать с помощью программы sequencer с одного чтения 1 x 50 nt протокол, направленный на 30 М читает/образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проиллюстрировать производительность нашей чип протокола, мы провели эксперименты с использованием пула СНТ разделы из HH19 куриных эмбрионах, верхнечелюстной протуберанцев HH22 куриные эмбрионы и этап HH3 куриных эмбрионах расследовать привязки профили чип seq различные модификации гистонов (т.е., H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 и H3K27me3). После того, как были получены чип ННО, sonication эффективность оценивалась электрофорезом геля агарозы соответствующего входного ННО (рис. 3). Затем чип и ввода ННУ были использованы для чип ПЦР анализа для измерения сосредоточения на локусов, ожидается быть привязан или несвязанные исследованы гистона изменения (рис. 4A). В примере, показанном на рисунке 4A, H3K27me3 и H3K4me3 обогащения уровней в HH19 СНТ разделы были оценены чип ПЦР вокруг области промоутер SOX17 и SOX2, два генов, которые являются неактивными и активным в СНТ, соответственно. Как и ожидалось, промоутер SOX2 сильно отмечалась H3K4me3 но не H3K27me3, в то время как промоутер SOX17 показал Противоположная схема (рис. 4A). Путем оценки нескольких локусов, можно оценить качество чип без потери много материала ДНК для течению чип seq анализа. После того, как было подтверждено качество фишки, чип seq библиотеки были подготовлены и виртуализации. Представитель локусов отображаются для каждого из исследуемых курица эмбриональных тканей: (i) профили для H3K27me3 и H3K4me3 в СНТ HH19 куриных эмбрионов вокруг PAX7 (рис. 4B); (ii) профили для H3K4me2 и H3K27ac в верхнечелюстной протуберанцы HH22 куриных эмбрионах вокруг SNAI1 (рис. 4 c); и (iii) профиль для H3K27me3 в HH3-этап куриных эмбрионах вокруг TBX3/TBX5 локус (рис. 4 d). Эти эксперименты чип seq четко показывают, что наш чип протокол может использоваться для создания профилей epigenomic из ограниченного количества биологического материала в широком диапазоне эмбриональных тканей.
Рисунок 1: схема Обзор протокола чип для Low изобилие эмбриональных образцов, изолированных от куриных эмбрионах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: краткий обзор протокола Microdissection СНТ. Поперечной сегмент СНТ отрезается на уровне плечевого HH19 куриного эмбриона. После лечения трипсина не нервной ткани удаляется механически с помощью щипцов. Не хорда; СНТ, спинного нервной трубки; и так, Сомит. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: пример оптимальной Sonication. Куриные HH19 СНТ образец был sonicated для 11 циклов, с 30 на s и 45 s OFF импульсов на «высокий» амплитуды, с помощью sonicator. Сшивки были отменены и очищенная ДНК была решена на 1,5% агарозном геле. Размер оптимальный фрагментов наблюдается после 11 циклов, начиная от 200-500 bp. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель примеры анализа чип, чип ПЦР или чип след (A) H3K27me3 (слева) и H3K4me3 (справа) в указанных регионах были измерены по чип ПЦР анализа, выполняемого с помощью СНТ секций, изолированных от HH19 куриных эмбрионов. В регионе промоутер SOX2 активен в СНТ и таким образом отмечены H3K4me3 но не H3K27me3; SOX17 промоутер региона является бездействующим в СНТ и поэтому обогащается в H3K27me3, но не в H3K4me3; Chr6 Neg представляет intergenic региона в курица хромосома 6 и выступает в качестве отрицательного контроля. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от трех технических реплицирует. (B) чип seq (H3K27me3 в пурпурный, H3K4me3 в голубом и вход в красном) показаны профили из куриных эмбрионов СНЦ HH14 вокруг PAX7 Локус. (C) чип seq (H3K4me2 в оранжевый, H3K27ac в зеленый и вход в красном) показаны профили из верхнечелюстной протуберанцы HH22 куриных эмбрионов вокруг SNAI1 Локус. (D) чип seq (H3K27me3 в пурпурный) и ввода в красном профилей из HH3 куриных эмбрионов отображаются вокруг TBX3/TBX5 Локус. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: пример чип seq библиотеки проверки с помощью автоматизированной системы управления качеством РНК. Те же чип seq библиотеки были проанализированы с автоматизированной системой управления качеством РНК до (A) и после очистки димера праймера (B). Димеры праймера можно рассматривать как слабое группа bp ~ 135 в (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Шаги | Проблема | Возможная причина | Решение |
| 1,2,3,4 5 и 11 | Чип низкий сигнал шум соотношения согласно чип ПЦР или чип seq | Качество ткани под угрозой. | Выполните микро Анатомирование в холодных условиях; в противном случае может быть нарушена целостность хроматина. |
| Пример потери после центрифугирования высокоструктурированные образцов. | Использование среде DMEM с 10-20% сыворотки или повторить центрифугирования шаг и увеличить время до 10 мин. | ||
| Сшивки продолжительность. | Оптимизируйте время сшивки. Увеличение сшивки раз может облегчить обнаружение некоторых белков, таких как совместное активаторы и Сопредседатель подавляющего, которые не связываются с ДНК непосредственно. | ||
| Пример потери из-за нескольких стирок в PBS. | Уменьшить количество моек; Центрифугирование шаги может повторяться в 1500 x g. | ||
| Неоптимальный sonication, что приводит к ДНК размеров слишком длинным или слишком коротким. | Выполните времени курс эксперимента по оптимизации условий sonication. Оптимальное фрагмент размеров, начиная от 200 до 500 bp | ||
| Антитела не подходит для чипа. | Используйте различные антитела против эндогенного белка или антитело против тег добавляется экзогенно выраженной белков (например флаг, HA). | ||
| 12 | Низкий или нет сигналов в ПЦР, даже для ввода ДНК | Неоптимальный праймеры | Проверить эффективность грунтовка и специфики; Дизайн новой грунтовки. |
| Недостаточное количество ДНК | Не хватает исходного материала. Увеличьте количество ДНК используется в ПЦР-реакции. |
| Праймеры | Последовательность |
| SOX2-F | CCTTGCTGGGAGTACGACAT |
| SOX2-R | GCCCTGCAGTACAACTCCAT |
| SOX17-F | CCCTGAACTGTCATGTGTGG |
| SOX17-R | CAAACAGTTGCCTTTGAGCA |
| Chr6-neg-F | CCGTCAATCTCTGCTTGTGA |
| Chr6-neg-R | TGGAATCTGCTTGTCACTGC |
Таблица 2: Грунтовка последовательности для чип ПЦР.
| Preincubation | ||
| Температура | Время | |
| 95 ° C | 5 мин | |
| Усилители | ||
| Температура | Время | |
| 95 ° C | 10 s | |
| 60 ° C | 10 s | 45 |
| 72 ° C | 10 s | Циклы |
| Кривую плавления | ||
| Температура | Время | |
| 95 ° C | 5 s | |
| 65 ° C | 1 мин | |
| Охлаждение | ||
| 40 ° C | 30 s | |
Таблица 3: Условия PCR для чип ПЦР.
| Первоначальный денатурации | ||
| Температура | Время | |
| 95 ° C | 3 мин | |
| Усилители | ||
| Температура | Время | |
| 98 ° C | 20 s | |
| 60 ° C | 15 s | 15 |
| 72 ° C | 30 s | Циклы |
| Окончательное расширение | ||
| Температура | Время | |
| 72 ° C | 5 s | |
| Охлаждение | ||
| 4 ° C | удерживайте | |
Таблица 4: Условия PCR для амплификации ДНК фрагментов во время чип seq библиотека подготовки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epigenomic профилирования гистона модификации с помощью чип seq могут использоваться для улучшения функциональной заметки позвоночных геномов различных клеточных контекстах4,5,18. Эти профили epigenomic может использоваться, среди прочего, для выявления элементов, усилитель, для определения государственного регулирования усилители (т.е., активные, загрунтовать, или готовы) и для определения основных ячеек самобытности регуляторы в различных биологических или патологических условиях (например, широкий H3K4me3 промоутер доменов и супер усилители)6,7,9,10,11,19. Однако из-за ограничение, свойственное assay чип, который обычно требует миллионы клеток, большинство изменения гистона профили была сгенерирована в vitro клеточных линий и мобильных типы, которые могут быть отсортированы в естественных условиях в больших количествах 4. совсем недавно, описано несколько чип seq протоколы, которые совместимы с число крайне низкой клеток, таким образом значительно расширяет спектр типов клеток и тканей, в котором epigenomic профили могут в принципе, быть создан13 ,14,,1516. Новая эти чип seq протоколы полагаются на конкретных специальных методы подготовки библиотеки, которые, по крайней мере в некоторых случаях требуют нестандартного оборудования и реагентов14,,1516.
Здесь мы описываем чип протокол, который работает с низким числа промежуточных клеток (5 х 104 - 5 x 105 клеток) и получил в естественных условиях от10различных эмбриональных тканей. Для повышения чувствительности нашей чип анализов, мы устранили ряд шагов, обычно используется во время чип, например последовательных ячеек и ядерных lysis, который может привести к постепенной потере ценных материалов. Таким образом после сшивки, образцы относятся с одной литического буфера и впоследствии sonicated свести к минимуму потери образца. Важно отметить, что наш чип протокол совместим с ПЦР анализа, таким образом позволяя epigenomic анализ отдельных локусах интерес. Кроме того наш чип протокол могут быть объединены со стандартными методами подготовки библиотека чип seq, таким образом, потенциально полезных для большинства лаборатории с доступом к технологии секвенирование нового поколения.
Чип и чип seq протоколы могут использоваться не только для расследования привязки профили изменения гистона, но и раскрыть сайтов связывания других важных транскрипционный анализ регуляторов, например факторов транскрипции и Сопредседатель активаторы (например, P300 и УТПО)20. Как правило чипов (и чип seq) факторы транскрипции и Сопредседатель активаторы, которых не так много как гистоны, требуют значительно больше исходного материала чем микросхемы для меток гистона. Таким образом, описанные протокол не может обязательно работать для большинства факторов транскрипции или совместного активаторы, если количество начиная клеток является значительно увеличилось (например, 5 x 105 - 5 х 106 клеток) и/или весьма конкретные и имеются эффективные антитела. Тем не менее с дальнейшей оптимизации и постоянно совершенствуется подготовка методы библиотеки, мы ожидаем, что чип seq из ограниченных клеточного материала станет возможным для большинства регуляторные белки.
Хотя наш чип и чип seq протоколы были широко проверены для различных модификаций гистона и эмбриональных тканей, мы хотели бы подчеркнуть некоторые важные шаги, которые мы считаем важным для создания высокого качества epigenomic профилей. Во-первых эмбриональных образцов должны быть свеже изолированы в условиях, которые не нарушают целостность хроматина. К ним относятся выполнение вскрытия в холодных условиях или флэш замораживания проб имелось до тех пор, пока накоплен достаточный материал. Другим важным шагом является sonication, который должен быть точно оптимизированы для выполнения высокого качества фишек. Оптимальное sonication условия часто варьируются в зависимости от типа ткани, количество ткани, или sonicator используется. Последнее, но не менее важно успешно чип в конечном счете зависит от наличия конкретных и чип совместимых антител против протеинов интереса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют каких-либо конкурирующих финансовых интересов должны быть раскрыты.
Acknowledgments
Авторы благодарят Ян Аппель за его прекрасную техническую помощь при создании этого протокола. Работа в лаборатории рада-Иглесиас поддерживается CMMC очных финансирования, DFG исследовательских грантов (RA 2547/1-1, РА 2547/2-1 и TE 1007/3-1), Грант и Грант CECAD УПЦ передовых исследователь группы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH 8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1 Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100 - 1,000 µL Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2 - 20 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2 - 200 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5 - 10 µL Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10 mL) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Kouzarides, T.
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K.
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
- Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
- Ho, J. W. K., et al.
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
