Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

Published: October 27, 2017 doi: 10.3791/56187
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Endocrinology, Diabetes and Nutrition, Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מציג גישה לניתוח transcriptome כל מעוברים דג זברה, הזחלים, או תאים ממוינים. אנו כוללים בידוד של RNA, מסלול ניתוח של נתוני RNASeq, המבוססות על לרביעיית-PCR אימות של שינויים בביטוי הגנים.

Abstract

הניתוח של שינויים בביטוי הגנים העולמי הוא כלי חשוב לזיהוי הרומן משעולים שבבסיס פנוטיפים שנצפו. דג זברה היא דוגמנית מעולה עבור הערכה מהירה של כל transcriptome של אוכלוסיות תאים כל בעלי חיים או בודדים בשל הקלות של בידוד של RNA ממספרים גדולים של בעלי חיים. כאן מוצג פרוטוקול לניתוח ביטוי הגנים העולמי ב עוברי דג זברה באמצעות רצפי RNA (RNASeq). אנו מתארים הכנה של RNA כל העוברים, או אוכלוסיות תאים תוך שימוש בתא מיון בבעלי חיים מהונדס. אנו מתארים גם גישה לניתוח של RNASeq נתונים ראשוניים לזיהוי מועשר מסלולים ותנאים ג'ין אונטולוגיה (קדימה) ערכות נתונים של ביטוי גנים גלובלית. לבסוף, אנו מספקים פרוטוקול אימות של ג'ין ביטוי שינויים באמצעות כמותיים רוורס טרנסקריפטאז PCR (לרביעיית-PCR). פרוטוקולים אלה יכול לשמש עבור ניתוח השוואתי של שליטה וקבוצות ניסיוני של דג זברה כדי לזהות שינויים בביטוי הגנים הרומן, לספק תובנות פנוטיפים עניין מולקולרית.

Introduction

ניתוח השוואתי של ביטוי גנים העולמי הוא כלי חשוב לזיהוי גנים הרומן לתרום פנוטיפים שנצפו. ניתוחים כאלה בדרך כלל לסמוך על הערכה כמותית של שפע התעתיק בהשוואה בין ניסיוני ולשלוט דגימות. גישות יישוב, כגון לרביעיית-PCR הם יחסית מהיר ומדויק לחקירה של שינויים בביטוי גנטית יחיד. רצפי RNA (RNASeq) מציעה גישה רחבה, ללא השערות כדי לזהות שינויים משמעותיים בביטוי הגנים בין דגימות, שהופך אותו עכשיו התקן בחקירות אלה על-פני מערכות ניסויות.

דג זברה הופיעו כמודל בולטים על פני תחומים רבים של המחלה. פותח במקור עבור השירות שלהם בלימודי ביולוגיה התפתחותית, עקב שלהם פוריות גבוהה ועלות נמוכה יחסית של אחזקה, שימוש ניסיוני דג זברה התפתח לכלול מגוון רחב של פנוטיפים מ עובריים בשלבים למבוגרים כמו גם בתור מבחני מערך רחב של מולקולרית1,2,3. אכן, יתרונות אלה להפוך במחקרים מולקולריים מכניסטית מהירה, חסכונית בגלל הקלות של רכישת כמויות גדולות של חומר בשילוב עם הקלות של מניפולציה גנטית והן סביבתיים בכל שלבי החיים. יתר על כן, הטבע שקוף של דג זברה עוברי וזחלים להפוך אותו אידיאלי ליצירת קווים כתב מהונדס ספציפיים תאים או רקמות ומאפשר ויוו ויזואליזציה של אוכלוסיות תאים בדידים4. ניצול של קווים אלה מאפשר הכללית של הביטוי מפענוח סוגי תאים מבודדים ספציפיים המבוססים על ביטוי גנים כתב.

כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף לניתוח ביטוי גנים גלובלית באמצעות RNASeq אחרי תרבות של דג זברה עוברי. שינויים גנטיים ניסיוני, כולל מורפולינו (מו)-מבוסס גנים ארעי או גנום בתיווך CRISPR עריכה, הוצגו במקומות אחרים5,6,7. אנו לכן להתמקד פרוטוקול מפורט עבור בידוד של RNA מעוברים כל או מיון הטרנסגניים תאים המבטאים כתב ואחריו ניתוח חישובית פשוטה של תוצאות RNASeq באמצעות שביל כלים ותנאי אונטולוגיה (קדימה) הגן. לבסוף, כללנו אסטרטגיה עבור אימות של שינויים בביטוי הגנים מאת כמותיים רוורס טרנסקריפטאז PCR (לרביעיית-PCR). פרוטוקולים אלה חלים דג זברה העוברים חשופים למגוון רחב של תנאי הניסוי, כולל השוואה של מוטציות גנטיות או תנאים סביבתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים בעלי חיים המפורטות להלן הם לפי ואושרו על ידי אוניברסיטת מרילנד אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC).

1. הכנה העובר

  1. Generating עוברי דרך לטבעי להזדווגות
    1. תרבות עוברי עד 3 חודשים של גיל, הרבייה בגרות 5 , 8 .
    2. הפרדת דג זכר ונקבה למבוגרים בגלל הלחץ הרצוי לתוך מיכלי ההזדווגות מחולקת על ערב קודם העובר אוסף, ולהוסיף 2 זכרים ונקבות 3 טנק אחד.
      הערה: השימוש המתח כתב פלורסנט הטרנסגניים insulin2a:mCherry מותר הניתוח של תאי β בלבלב-.
    3. העברת דגים כדי הזדווגות מיכל עם מים טריים המערכת, הסרה של הקו המפריד מיד לאחר האורות נדלקים למחרת בבוקר.
    4. לאפשר את הדגים להזדווג באופן טבעי עד עוברי שנצפו במיכל התחתון. לאסוף את העוברים במרווחים של 30 דקות עד הכמות הרצויה נאסף. החנות כל הנאספים נקודת זמן נפרד פטרי בתקשורת העובר ב- 28.5 ° C.
    5. מופיע microinjection של חומר גנטי או השמה ניסיוני תרבות המדיה 6, אם רצונך בכך, ויש תרבות העוברים על האנק טריים ' s העובר בינוני 8 ב ס מ-10 צלחות פטרי-28.5 ° C.
      הערה: עבור ניתוח ביטוי גנטי מורפולינו (מו) מוזרק או חיות, שים לב כי כל מניפולציה יכול להיות השפעות נלווים על ביטוי גנים. מוטציות באפשרותך התערוכה פיצוי גנטי ברמה של שעתוק זה לא נצפית על ידי ג'ין מבוססת מו מיקוד 9.
  2. שלב עוברי
    1. תרבות העוברים בקבוצות של 50 – עוברי 75 לכל ס מ-10 פטרי כדי לקדם את התזמון התפתחותי עקבי של כל העוברים.
    2. לפקח על המורפולוגיה התפתחותית באמצעות מיקרוסקופ ויבתר בשלבים blastomere, epiboly ו- somite כדי להבטיח התקדמות התפתחותית 10.
      הערה: להסיר את כל העוברים הגוסס או פגומים כדי למנוע עיכוב התפתחותי בצלחת.
    3. להפריד את העוברים בהתאם לגיל ההתפתחותי. למדוד את גיל העובר באמצעות מספר somite לאחר פילוח (פוסט-gastrulation, 10.33 h פוסט הפריה (hpf)) עד כ 24 hpf. שלב עוברי וזחלים באמצעות אורך הגוף הכולל לאחר 24 hpf.
      הערה: somites הם בצורת שברון mesodermal הרקמה הנוכחי על החלק הגבי של העובר.
    4. למקם את העוברים מיון חממה 28.5 ° C ולאפשר פיתוח כדי להתקדם הגיל הרצויה.

2. תא בודד דיסוציאציה: כל העובר ואוכלוסיות מיון תא

  1. כל העובר הדיסוציאציה
    1. המתת חסד העוברים דג זברה בשלב הרצוי על-ידי הצבת הפטרי על קרח למשך 5-15 דקות עד אין תנועה נצפית .
    2. מאגר של עוברי 20 להעביר צינור microcentrifuge שכותרתו mL 1.5. להסיר את כל התקשורת עובר עודף מהצינור microcentrifuge.
      3. ריאגנט
    3. להוסיף 200 µL פירוק (ראה טבלה של חומרים) אל הצינור המכיל עוברי. Homogenize העוברים ב ריאגנט פירוק מכני באמצעות כבעלי. הוספת ריאגנט פירוק µL 800 כדי להביא את הנפח הכולל של 1 מ"ל. חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד החילוץ-RNA-
  2. תא ממוין זרימה בידוד 11
    1. להעביר את העוברים הפטרי לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL ולהסיר כמה שיותר בינוני העובר ככל האפשר.
      הערה: בהתאם לגיל העובר, דיסוציאציה מכני עשוי גם להידרש בשלב זה. עם עוברי > 48 hpf, אנו ממליצים על השימוש כבעלי לשבש תקינות העובר לפני שתמשיך.
    2. דגירה העוברים עם 1 מיליליטר דיסוציאציה מאגר 1 (ראה טבלה של חומרים) בצינור microcentrifuge 1.5 mL. תקופת דגירה של 15-30 דקות בטמפרטורת החדר. Triturate הפתרון על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה באמצעות טיפ P1000 לערבב כל 3-4 דקות במהלך שלב הדגירה. האם לא מערבולת.
    3. לאסוף את העוברים על ידי צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 300 x g ולהסיר את תגובת שיקוע. מחדש להשעות את העוברים במאגר דיסוציאציה 1 מ"ל 2 (ראה טבלה של חומרים). תקופת דגירה של 15-30 דקות בטמפרטורת החדר עם רגיל pipet trituration.
    4. להעריך את תהליך העיכול על ידי דילול µL 1-2 של השעיה בתוך תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) מאגר במיקרוסקופ.
      הערה: עיכול מלאה אירעה כאשר aliquot בחנו מראה תאים בודדים עם אשכולות תא מינימלי, חתיכות רקמה עוברית.
    5. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דק הסר תגובת שיקוע. מחדש להשעות את התאים לתוך מאגר 1 מ"ל FACS, ואת כוח המשיכה מסנן דרך מסננת תא 40 µm כדי להסיר רקמות מעוכל מן המדגם.
    6. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ו לדלל עם FACS המאגר כ עונה 1 פרק 10 6 תאים/מ ל שפופרת FACS.
      הערה: עבור סוגי תאים עם מספר קטן יחסית לכל העובר (פחות מ-5% מכלל), כגון תאי-β בלבלב, השתמש מינימום של 1000 מתאימים-שלב עוברי.
    7. לספק את FACS מיון מתקן עם צינורות FACS המכיל 1 מ"ל של התא ההשעיה דגימות, כמו גם FACS שפופרת המכילה רק פירוק ריאגנט או מאגר FACS. שער FACS הזרימה-בסדרן כדי לאסוף רק תאים בודדים שאת אקספרס הכתבת פלורסנט.
    8. לבצע FACS הזרימה-המיון עד שנאסף המספרים הרצויים תא.
      הערה: כדי לבצע RNASeq, יש מינימום RNA הכולל הנדרש. מצאנו כי תאים 3,000-5,000 מספיקים לבודד את ה-RNA באיכות גבוהה, גבוהה-ריכוז-
    9. לאחסן את התאים שנאספו על הקרח והמשך מיד הכנה רנ א.

3. הכנה RNA

  1. RNA לחלץ
    1. דגירה המדגם שנאספו (משלב 2) עם פירוק ריאגנט למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הוסף 0.2 מ של כלורופורם עבור כל אחד מ 1.0 ל ריאגנט פירוק והוא היפוך הצינורות בעבודת יד עבור Incubate ס' 15 למשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. Centrifuge את הדגימות ב g x 12,000 למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
    3. להעביר את שלב נפרדנו, מימית צינור טריים ומוסיפים 0.5 מ ל אלכוהול איזופרופיל עבור כל מ 1.0 ל ריאגנט פירוק בשימוש. תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. Centrifuge את הדגימות ב g x 12,000 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
    4. לשטוף עם 75% אתנול, centrifuge את הדגימות-7,500 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע וגם תאפשר אוויר יבש בטמפרטורת החדר. מחדש להשעות את הרנ א ב- 15-30 µL diethyl pyrocarbonate (DEPC)-מים מטופלים.
  2. Purify באיכות גבוהה RNA
    1. לשלב את המתלים RNA עם נפח 1/10 3 מ' סודיום אצטט (pH 5.5) ונפח 1 של אלכוהול איזופרופיל. תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר, centrifuge את הדגימות-12,500 g x עבור 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
    2. רוחצים בגדר עם אתנול 70% קר כקרח במים שטופלו DEPC את centrifuge את הדגימות-g 10,000 x עבור 5 דקות ב-4 ° C. חזור על השלב לשטוף פעם.
    3. להסיר את תגובת שיקוע ולאפשר לייבוש בטמפרטורת החדר. להשעות מחדש במים שטופלו DEPC.
    4. Assay את הרנ א שחולצו עבור ריכוז (ng/µL) וטוהר (260/230 יחס) באמצעות ספקטרומטר הקליטה. לוודא כי הערך 260/230 ~ 2.0 לפני שתמשיך עם RNASeq. לאחסן ב- 80 ° C עד אותנוe (עד 6 חודשים).
    5. לשלוח את הדגימות RNA הספק או הליבה עבור RNASeq ושנה ביטוי גנים ניתוח המבוסס על כימות של רצף פעולות הקריאה. התוצאות המוחזרות מהספק ניתנים בדרך כלל כרשימה של גנים מפגין קיפול-שינוי משמעותי התעתיק קריאות בין דגימות.
      הערה: עמודה יכול לשמש אם השיטה לעיל מניבה RNA באיכות ירודה. הסכום, לריכוז מספר שלמות RNA (RIN) עבור ה-RNA דגימות צריך להיות מאושרות עם הספק או הליבה. הספק או ליבה אחרים יעריכו גם בדרך כלל רין.

4. מסלול וניתוח המונח ללכת

הערה: ראו איור 1 לפלט נציג של ניתוח ביטוי גנים לאחר RNASeq שמספק את ליבה או ספק-

  1. מיון הביעה באופן שונה את הגנים
    1. השוואת תנאי הניסוי יחיד לעומת שליטה
      1. פתוח נתונים (תוצאות) ניהול בתכנת (ראה טבלה של חומרים ).
      2. בחר בחץ הנפתח לצד ' מיון ' לחצן ובחר " מיון מותאם אישית " בתוך הגיליון המכיל גנים ביטוי באופן שונה את ניסיוני לעומת תנאי הבקרה.
      3. בחר בתיבת תחת ' עמודה ' בחלון שעובר למעלה ולבחור למיין ' LFC ' עמודה. ודא ' ערכים ' נבחר ' מיין לפי ' עמודה. בחר באפשרות זו כדי למיין ' מהגדול ' ב ' סדר ' עמודה ולחץ על " אישור ".
        הערה: זה יפתור באופן שונה ביטוי הגנים כך אלה עם ביטוי מוגבר (LFC חיובי) יופיעו בחלק העליון של הרשימה בזמן אלה עם ירידה בביטוי (LFC שלילי) יופיעו בתחתית הרשימה.
    2. להשוות את התנאים ניסיוני מרובים על פקד יחיד כמפורט להלן.
      1. בחר התא הראשון בעמודה ריקה על ניסיוני 1 מול פקד הגיליון האלקטרוני כדי לקבוע באופן שונה הביע גנים נמצאו שני תנאים ניסיוני. סוג המשוואה הבאה לתוך התא:
        Equation
        הערה: המשוואה הזו היא שילוב של IF, ISERROR, ופונקציות התאמה. (i) הפונקציה MATCH, התאמה (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0), יחפש את הערך בתא A1 (מזהה ENSEMBL) בעמודה A (A:A) של הגיליון בשם Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control!). " 0 " מציין לחפש התאמה מדויקת, ו אם נמצאה התאמה מדויקת, הפונקציה תחזיר ערך של " 1 ", ואילו אם אין התאמה, הפונקציה תחזיר את שגיאה " מסוג ". (ii) התוצאה של הפונקציה MATCH ואז הוא קלט לתוך הפונקציה ISERROR, ISERROR (התאמה (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), איפה, אם הקלט הוא " 1 " המציין התאמה נמצאה, הוא יחזור " שווא ", ואם הקלט הוא " מסוג " המציין התאמה לא נמצאה, הוא יחזור " נכון ". (iii) " האמיתית " או " שווא " והתוצאה היא אז קלט לתוך הפונקציה IF, אם (ISERROR (התאמה (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), " ", " לשכפל "), איפה, אם הקלט הוא " האמיתי " המציין התאמה לא נמצאה, היא תחזיר את הערך בין הסט הראשון של מרכאות (" ") אשר הוא ריק, ולכן התא יהיו ריקים. אם הקלט הוא " שווא " המציין התאמה נמצאה, היא תחזיר את הערך בין הסט השני של מרכאות (" לשכפל "), התא יגידו " כפולים ".
      2. העיתונות " Enter " או " להחזיר " כדי להפעיל את המשוואה. בחר את התא המכיל את המשוואה, לחץ על התיבה בפינה הימנית התחתונה של התא. להשאיר את העכבר לחיצה וגרור את האזור הנבחר כל הדרך למטה העמודה עד הרגע האחרון ' תכונת ID ', כדי להעתיק את המשוואה לתוך כל תא בעמודה.
      3. בחר " מיון מותאם אישית " שוב, להוסיף רמה שניה של מיון על-ידי לחיצה " + " סמל בפינה השמאלית התחתונה. ברמה הראשונה, " למיין לפי ", תחת בחר עמודה " לשכפל ", תחת מיין לפי, בחר ' ערכים ', תחת בחר סדר ' ת-א '. ברמה השניה, " לאחר מכן, לפי ", תחת בחר עמודה ' LFC ', תחת מיין לפי, בחר ' ערכים ', תחת בחר סדר ' מהגדול ' ובחר " אישור ".
        הערה: זה למיין את הרשימה של גנים 4 קבוצות בהתבסס על כיוון של ביטוי שינוי. חשוב לבדוק את הגנים נמצאו שני התנאים ניסיוני כדי להבטיח כי השינוי בביטוי בכיוון זהה בשני המקרים או בכיוונים מנוגדים-
      4. להסיר את כל הסוגריים מן העמודה סמלים ג'ין, לפני שתמשיך או התוצאות לא ימצא במסדי הנתונים. בחר את העמודה כולה המכיל גנים סמלים. בחר " לערוך " ואז " להחליף " ב הנפתחת של ' קובץ ' בתפריט. סוג " (*) " בתוך " למצוא מה: " בר של חלון חיפוש והחלפה, ולהשאיר " להחליף: " בר ריק. בחר ' החלף הכל ' כדי להסיר את כל המופעים של סוגריים.
        הערה: * מייצג מספר כלשהו של תווים, על-ידי הצבת תו זה בין הסוגריים התוכנית, מתבקש למצוא את המופע כל התאים המסומנים כל מופע של סוגריים יוחלפו עם כלום, ובכך הסרתם.
  2. הקובע מועשר מסלולים
    1. עותק הסמלים גנים של ערכת עבור מי שרוצה לקבוע המסלולים מועשר ללוח. ללכת ConsensusPathDB 12. בחר " ג'ין לקבוע ניתוח " על הצד השמאלי של דף האינטרנט, ואחריו " ייצוג יתר ניתוח ".
    2. הדבק את הרשימה של גנים " הדבק רשימה של מזהי הגן/חלבון " התיבה. סמל הגן בחר " הגן/חלבון המזהה סוג " בתיבה ולחצו על " להמשיך ". בחר את התיבה שליד " מסלולים כפי שהוגדרו על ידי מסלול מסדי נתונים " תחת מבוסס על מסלול קובע סעיף.
      הערה: מספר אפשרויות לניתוח יופיעו כולל הרשימה של מסדי נתונים זמינים לחיפוש. אנו ממליצים מוציאים בכל מסדי הנתונים מלבד מסדי הנתונים קג, Reactome כפי שהם הכי הוקמה, מקיפים. גם ניתן לכוונן את החפיפה מינימלי עם הגדרות הקיצוץ קלט רשימה, ערך-p בהתבסס על הצרכים. אנו ממליצים להשאיר הגדרות אלה החפיפה המינימלי של ג'ין 2 ברירת מחדל, ערך-p 0.01 ניתוק.
    3. בחר " למצוא ערכות מועשר " כדי לקבל את רשימת מסלולים המכילים גנים ברשימת הקלט.
      הערה: הפלט יהיה בתבנית של טבלה כולל שם כל מסלול ולאחריו " להגדיר גודל " (המציין את מספר גנים הכולל מסלול), " מועמדים הכילה " (המציין את מספר גנים ברשימת הקלט הנמצאים במסלול הזה ), כמו גם ערך p ו- q-ערך (פד), מסד הנתונים שממנו השביל היה מזוהה.
  3. דור של מסלול רשתות
    1. לקבוע מסלולים מועשר כמתואר לעיל-
    2. בחר את כל המסלולים מועשר לדמיין מסלול ברשת על-ידי בחירת כל תיבת לצד שמות מסלול כדי ניתן לאבחן או על-ידי לחיצה על " כל " תחת " בחר " בכותרת העמודה לעיל תיבות בחירה, לאחר מכן בחר " לדמיין את ערכות שנבחרו ".
      הערה: מומלץ להמחיש כל המסלולים אם יש פחות מ-30; אם יש חזקים יותר 30 מסלולים מומלץ בחירת המסלולים המובילים ביותר מועשר 30 (אלה המכילים את המספר הגדול ביותר של גנים מתוך הרשימה קלט).
    3. התאם " חפיפה יחסית " ו " משותפים מועמדים " מסננים, על-ידי בחירת תיבת גם במרכז החלק העליון של הדף הזנת דיזראד אחוז יחסית חופפים או מספר מועמדים משותפת, להיות מחמירים יותר על מנת להפוך את יותר רלוונטי חופף בתוך הרשתות מסלול ברור יותר, בחר " החל ".
      הערה: אנו ממליצים על חפיפה יחסית המינימלי של 0.2, המציין של 20% ג'ין חפיפה בין 2 מסלולים לחבר אותם, מינימום של 2 מועמדים משותפת. האגדה הגרף ניתן לראות על ידי לחיצה על האגדה גרף בפינה השמאלית העליונה של העמוד-
  4. קביעת תנאי ללכת מועשר
    1. להעתיק ג'ין סמלי הקבוצה שעבורם אחד ורוצה לקבוע את ontologies ג'ין מועשר ללוח. ללכת ' כלי ניתוח העשרת קדימה ' ג'ין לקונסורציום 13. הדבק את הרשימה של ג'ין סימנים בתיבה בצד שמאל של הדף תחת " שלך. ג'ין מזהים … "
    2. בחר איזו קבוצה של קדימה התנאים לשימוש, מפורטים מתחת התיבה במזהים גן: תהליך ביולוגי, הפונקציה מולקולרי או רכיב הסלולר. לבחור (מומלץ) ' תהליך ביולוגי '. בחר ' rerio רזבורה ' מתחת ללכת תנאי בתיבה, לחץ על " שלח ".
      הערה: מומלץ להשתמש החיתוך p-ערך ברירת המחדל של 0.05-

5. אימות על ידי לרביעיית-PCR

הערה: גנים יחידניים מזוהה עם ג'ין משמעותי ביטוי לשינויים RNASeq צריך להיות אומתו לרביעיית יישוב-PCR בניסויים שכפל.

  1. cDNA סינתזה
    1. לחלץ את הרנ א מעוברים באמצעות השיטה המתוארת ב סעיף 3.1. החילוץ-RNA-
    2. µG 1 המר של RNA ל cDNA שימוש בהמרה cDNA קיט (ראה טבלה של חומרים). לשלב ה-RNA, dNTPs, האנזים רוורס טרנסקריפטאז. לבצע את התגובה thermocycler על פי היצרן ' מפרט s.
    3. לדלל cDNA 1:3 במים שטופלו DEPC. חנות ב 4 ° C עד 1-2 חודשים.
  2. אימות לרביעיית-PCR
    1. בחר גנים לאימות על ידי לרביעיית-PCR מתוצאות רצפי RNA. לזהות גנים עם קיפול גבוהה שינויים בביטוי. לקבוע אילו מן הגנים האלה מכילים גם ספירת קריאה גבוהה, כי זה מצביע על ביטוי בשפע.
    2. בחר 10-12 מטרות השינוי קיפול גבוהה, ספירת קריאה גבוהה רשימת גנים. עיצוב תחל כדי להגביר את הגנים היעד המתפרסים על גבול אקסון-אינטרון לפחות 1-
    3. להזין את הגן או את אזור של הגן qPCR תחל עיצוב האתר 14. בחר " עיצוב תחל qPCR 2 " וינחה את האתר כדי ליצור ערכת פריימר.
      הערה: הקפד לכלול תחל בקרה פנימית, כגון β-אקטין, לנרמל השוואות בין הדגימות. תחל β-אקטין הם f: 5 ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' ו- r: 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '.
    4. לשלב את cDNA פריימר לפנים, פריימר הפוכה, פולימראז. לבצע הגברה לרביעיית-PCR כדי לקבוע את הביטוי היחסי של הגנים 15.
    5. לנתח את הביטוי mRNA היחסי של הגנים של עניין על-ידי כימות היחסי נחישות 15.
    6. להשוות לרביעיית-PCR תוצאות RNASeq על מנת להבטיח כי הכיוון של ביטוי דיפרנציאלי עקבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מיון באופן שונה לידי ביטוי גנים:

כדי לזהות באופן שונה ביטוי הגנים בשלב הזחל של דג זברה מודלים של תסמונת Alström, תסמונת Bardet-Biedl (BBS), שסימנו או alms1 או bbs1 התמלילים באמצעות הזרקת בעבר מאומת splice חסימת-MOs לתוך עוברי פראי-סוג דג זברה16,17. ב- 5 ימים פוסט הפריה (dpf), משכפל שני של RNA חולצו מן בכל תנאי, וכן עוברי מוזרק עם שליטה מו, כמתואר בסעיף 3 לעיל. RNA של כל מדגם היה רציף עד לעומק של ~ 120 מיליון קורא עם ~ 107 מיליון קורא מיושר כדי הגנום דג זברה. בין 85-90% קריאות מיושר למפות אזורים exonic של הגנום.

גנים הכולל 1,348 שונו באופן משמעותי במודל Alström, גנים הכולל 471 שונו באופן משמעותי במודל BBS. המשותף שינויים בביטוי הגנים בין מודלים או שינויים ייחודיים לאחד המודלים אותרו כמתואר בסעיף 4.2. גנים הכולל 1,084 שונו באופן ייחודי במודל Alström, 612 מוסדר למעלה, 472 למטה מוסדר, ו 207 גנים שונו באופן ייחודי במודל BBS, 176 מוסדר למעלה, ולמטה מוסדר 31 (איור 2, טבלה S1ו- S2 טבלה). 264 גנים נמצאו להיות שונה באופן משמעותי בשני המודלים, 73 היו מוסדר למעלה, 182 היו למטה מוסדר, 9 הראו שינויים ההפוך בביטוי בין שני המודלים (איור 2 בטבלה S1, S2 טבלה (ראה Tables.xlsx משלים)). המספרים discrepant של גנים ביטוי באופן שונה בין שני המודלים מראים כי bbs1 , alms1 עשוי להשפיע שלבים שונים בהתפתחות.

מעניין, מספר רב של גנים באופן שונה ביטוי במודל Alström מציע שאת alms1 ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות בשלב 5 dpf, בעוד מספר קטן יותר של ג'ין שינויים במודל BBS מראים כי תפקידו של bbs1 לא יכול להיות כמו בולטים בנקודת זמן זו. לעומת זאת, ניתוחים קודמים transcriptomic-2 dpf הציע את הפוך18.

קביעת משעולים מועשר, ג'ין Ontologies דג זברה במודל של תסמונת Alström:

להבהיר בצורה ברורה יותר את הפרופיל המולקולרי של המודל Alström, אותרו משעולים, ג'ין ontologies מועשר בגנים ביטוי באופן שונה. מסלולים מועשר נקבעו על ידי תשאול של ConsensusPathDB, מועשר ג'ין Ontologies נקבעו על ידי תשאול לקונסורציום של ג'ין כפי שמתואר ב סעיפים 4.3-4.5. מועשר ביותר בין הגנים למעלה מוסדר ב Alström מודל, לפי מספר גנים או מקפלים העשרה, נותחו. מסלולים סה כ 31 היו למעלה מוסדר במודל Alström. מלבד הקיבוץ רחבה של "חילוף חומרים", המסלולים המושפע ביותר היו מערכת החיסון מולדים, גמישים עם 32 ו 20 גנים, בהתאמה (איור 3 א). קולטן תא β במורד הזרם איתות האירועים היו גם מועשר מציעה המערכת החיסונית למעלה-תקנה במודל זה. מספר איתות המסלולים היו גם מועשר בין הגנים מוסדר למעלה במודל Alström, בקנה אחד עם השיוך של תסמונת Alström תפקוד ריסי ראשי, מרכז איתות חשוב של התא (איור 3 א). בנוסף, שלושה מסלולים הקשורים הפרשת האינסולין היו מוסדר למעלה: חומצות שומן קשורה GPR40, חומצות שומן, אצטילכולין (איור 3 א). . זה תואם מאוד penetrant אינסולין ההתנגדות ואת סוג 2 סוכרת פנוטיפים בחולים Alström. תנאי ללכת שישה היו מועשר בין הגנים מוסדר למעלה במודל Alström, כולל בידול כדוריות דם אדומות, כדוריות דם אדומות הומאוסטזיס, התאים מיאלואידית הומאוסטזיס ותהליכים homeostatic (איור 3B). כדי להעריך ההדדי של המסלולים להמציא מוסדר, רשת מסלול Alström היה מודל מוסדר למעלה מסלולים שנוצר (איור 3C). הצומת העיקריים של מסלולים מחוברים חשף רמה גבוהה של קישוריות בין המסלולים הקשורים במערכת החיסונית, איתות, בעוד אחד מצמתי קטין נחשף קישוריות בין המסלולים רגולטוריות אינסולין שלוש. בסופו של דבר, נוכל לאמת את השינויים ביטוי הגן המזוהה על-ידי RNASeq מאת ובחינת 5 יעדים ג'ין, אשר היו גם למעלה או למטה-מוסדר במודל Alström. . הכיוון של שינויים בביטוי גנים לרביעיית-PCR במחלוקת, חוזרת, bmb, btr26, ו ifi35, יחסי שליטה, recapitulated זה נצפה ע י RNASeq (איור 4A–B).

Figure 1
איור 1. נציג הפלט של ניתוח ביטוי גנטי לאחר RNASeq שמספק את ליבה או ספק- תכונת מזהה מציין את המספר המזהה של ג'ין ENSEMBL. ספירת קריאה מציין את מספר הקריאות שליטה או ניסיוני והמדגמים המיושר את הגן הזה הגנום. קיפול השינוי ואת יומן הרישום של השינוי קיפול מצביעים על מידת שינוי בביטוי של הגן בין ניסיוני, שליטה לדוגמה באחת את החיובי (עלייה) בביטוי בכיוון מדגם ניסיוני, או שלילי (ירידה) בביטוי כיוון מדגם ניסיוני. ערך-p, רוזוולט הן בדיקות סטטיסטיות כדי לקבוע את המשמעות של תוצאות; לניסויים RNASeq, ערך רוזוולט מחמירים יותר של 0.05 משמש כדי לקבוע מובהקות. Gene_symbol מציין את מזהה ג'ין NCBI ולאחר gene_name את השם המלא של הגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. באופן שונה לידי ביטוי גנים במודלים BBS ו Alström. מספר גנים מוסדר למעלה (אדום) או למטה מוסדר (צהוב) alms1 מו (ירוק) מוזרק עוברי, bbs1 מו (כתום) מוזרק העוברים, או בשתי לעומת שליטה רגיל מו מוזרק עוברי. * מציין מספר גנים השתנה בשני המקרים אך נתקל מול שינויים בביטוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
Figure 3. Upregulated מסלולים ותנאים מועשר ללכת במודל Alström. (א) Upregulated מסלולים לפי מספר גנים. ללכת Upregulated (B) תנאי על ידי קיפול העשרה. (ג) מסלול קישוריות upregulated מסלולים במודל Alström. חיבורים שביל שנקבע על ידי מינימום של 20% משותפים גנים בין מסלולים, לפחות 2 גנים חופפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4. אימות לרביעיית-PCR של שינויים בביטוי הגנים. שינויים בביטוי הגנים המזוהה על-ידי RNASeq היו אישר בגיל - ועל לטיפול-מתאימים עוברי 5 dpf, מוזרק עם שליטה, alms1 או bbs1 משנה מו (A) של גנים מציג mRNA ביטוי של גנים באמצעות לרביעיית-PCR. נתוני שווי ערך (B) מציג קריאה מונה מ ערכת הנתונים RNASeq. כל הנתונים הם יחסי שליטה, לרביעיית-PCR היו מנורמל ל אקטין. במחלוקת, אסטרואיד homolog 1; חוזרת, גלוקוקינאז; bmb, brambleberry; btr26, ג'ין צמאי דם הקשורים במשפחה, בן 26; . ifi35, חלבון אינטרפרון-induced 35 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הגישה המתוארת בעלון פרוטוקול זה מציע אסטרטגיה יחסית מהירה וחסכונית עבור transcriptome ברמת ניתוח של כל בעלי חיים או אוכלוסיות תאים ממוינים מסוים. דג זברה מספק מודל יתרון עבור סוג זה של מחקר בשל נוחות במהירות על מנת לייצר כמויות גדולות של הפעלת חומר, להקל על יישום גנטי או תנאים סביבתיים ניסיוני, והזמינות של גדול ספקטרום קווי כתב מהונדס ומאפשר בידוד של אוכלוסיות ספציפיות, רקמות ספציפיות סוג התא.

אמנם לא מפורטות כאן, שיטה זו יכול להתאים בקלות מקטעי רקמת שנאסף דגים נער או מבוגר כחלופה FACs ואוסף. פיתחנו גם אסטרטגיה בסיסית ניתוח מעקב המסתמך רק על השימוש של פקודות בסיסיות של גיליון אלקטרוני ואת מסלול הקיימת מראש ללכת מסדי נתונים. היתרון העיקרי של גישה זו היא להקל על נגישות ללא צורך מומחיות ברמה גבוהה ביישום ניהול מחשב תכנות או מסד הנתונים. ככזה, אסטרטגיה זו ישימה עבור החוקרים הבאים מרקע שונה עבור ניתוח מקיף של ערכות נתונים של ביטוי גנים גדולים.

הגישה שלנו משלב דג זברה בסיסי העובר ותרבות זחל עם תקן טכניקות החילוץ של RNA, ואחריו RNASeq. RNASeq דורש כמות גדולה של חומר המוצא באיכות גבוהה; ספקים מסוימים דורשים 2 µg של RNA הכולל. כתוצאה מכך, סוגי תאים נדירים/נדירים או העובר בודדים ניתוח הוא מחוץ להישג יד. עם זאת, בחמש השנים האחרונות הראו שיפורים משמעותיים תפוקה נמוכה ניתוחים, datasets שנוצר דגימות קטנות יותר, והכמויות התחתון RNA, אנו מצפים כי יישומים אלה יהיה אפשרי בעתיד הקרוב. כדי להבטיח תוצאות מדויקות, התוספת של שני טכני משכפל, קרי, יצירת שתי ספריות ה-RNA של דוגמה אחת, ומשוכפלת ביולוגי, קרי, איסוף העוברים מן matings מרובים, הוא אידיאלי. שלבים אלה לאפשר את החוקרים שליטה וריאציה בדגימות, רצפים שזוהו כל דוגמאות נוטים יותר להיות תוצאות אמת, כאשר הסבירות מופחתת של חסר תוצאה לקריאה-ספירה נמוכה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.), T32DK098107 (T.L.H. ו- J.E.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Commercial Reagents
TriZol Thermo Scientific 15596026 lysis reagent
TrypLE Gibco 12604013 dissociation buffer 1
FACSMax Genlantis T200100 dissociation buffer 2
DEPC-treated water Sigma 95284
FirstStrand cDNA conversion Thermo Scientific K1621 cDNA conversion kit
2X SYBR Green Master Mix Roche 4707516001 qRT-PCR Master Mix
FACS buffer Fisher Scientific 50-105-9042
chloroform Sigma Aldrich 288306
sodium acetate Sigma Aldrich S2889
Name Company Catalog Number Comments
Zebrafish Strains
Tuebingen ZIRC ZL57
ins2a:mCherry ZIRC ZL1483
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
40 micron cell strainer Sigma CLS431750
FACS tube BD Falcon 352063
hemocytometer Sigma Z359629
Dissecting Microscope Zeiss
Inverted Microscope Zeiss
Nanodrop Thermo Scientific
Illumina HiSeq Illumina
LightCycler 480 Roche
Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set Aquaneering ZHCT100
FACS tube 5 mL polypropylene tube BD Falcon 352063
Name Company Catalog Number Comments
Software
Excel Microsoft
Consensus Path DB http://cpdb.molgen.mpg.de/
GO Enrichment Analysis http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
  2. Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
  3. Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
  4. Detrich, H. W. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , 3rd ed, Academic Press. (2011).
  5. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
  6. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  7. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  8. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  9. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  11. Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
  12. MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from: http://cpdb.molgen.mpg.de/ (2017).
  13. Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from: http://www.geneontology.org/ (2017).
  14. IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017).
  15. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
  16. Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
  17. Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
  18. Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).

Tags

גנטיקה גיליון 128 דג זברה RNAseq transcriptome ה-RNA רזבורה rerio ניתוח מסלול ג'ין אונטולוגיה תנאי זרימה מיון קרינה פלואורסצנטית מופעל מיון תא
הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hostelley, T. L., Nesmith, J. E.,… More

Hostelley, T. L., Nesmith, J. E., Zaghloul, N. A. Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish. J. Vis. Exp. (128), e56187, doi:10.3791/56187 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter