Dieses Protokoll beschreibt den Workflow eines CRISPR/Cas9-basierte Gens editing-System für die Reparatur von Punktmutationen in Säugetierzellen. Hier verwenden wir einen kombinatorischen Ansatz zur gen Bearbeitung mit einer detaillierten Follow-on experimentelle Strategie zur Messung von Indel Bildung an die Ziel-Site-Analyse im Wesentlichen vor-Ort-Mutagenese.
Kombinatorische gen Bearbeitung CRISPR/Cas9 mit einsträngiger Oligonukleotide ist eine wirksame Strategie für die Korrektur von Single-Base Punktmutationen, die oft für eine Vielzahl von menschlichen Erbkrankheiten verantwortlich sind. Mit einer etablierten zellbasierte Modellsystem, wurde die Punktmutation eines mutierten eGFP Single Copy-Gens integriert HCT116 Zellen repariert mit diesem kombinatorische Ansatz. Die Analyse der Zellen korrigiert und unkorrigiert zeigt die Präzision des Gens zu bearbeiten und die Entwicklung der genetischen Veränderungen, wenn Indels unkorrigierte Zellen in der DNA-Sequenz, die rund um die Ziel-Site erstellt werden. Hier ist die spezifische Methodik dieser kombinatorische Ansatz für die gen-Bearbeitung von einer Punktmutation, gepaart mit einer detaillierten experimentelle Strategie zur Messung Indel Bildung an die Ziel-Site zu analysieren skizziert. Dieses Protokoll beschreibt einen grundlegenden Ansatz und Workflow für Untersuchungen zur Entwicklung von CRISPR/Cas9-basierte gen Bearbeitung für menschliche Therapie. Der Abschluss dieser Arbeit ist, dass dieser vor-Ort-Mutagenese während des Prozesses der Punktmutation Reparatur infolge CRISPR/Cas9 Aktivität stattfindet. Diese Arbeit richtet eine standardisierte Methodik, um den Grad der Mutagenese, zu identifizieren, die einen wichtigen und entscheidenden Aspekt jeder Ansatz für die klinische Umsetzung bestimmt werden sollte.
Wegweisende Studien von Mandecki (1986) zeigten dauerhafte Änderungen in der Plasmid-DNA mit Oligonukleotiden Bakterien1, während Walder umgewandelt und Walder (1986) ähnliche Studien in Hefe2durchgeführt. Kurz darauf veröffentlichte Sherman und Kollegen eine Reihe von Dokumenten, bei denen einzelsträngige Oligonukleotide in Hefezellen vererbbare Gene3Änderungen eingebracht wurden. Aufbauend auf der bahnbrechenden Arbeit in mikrobiellen Zellen, begann Kmiec und Kollegen einzigartige Single-Agent-Oligonukleotide zu entwickeln, die einzelne base Instandsetzung in Säugerzellen4gerichtet. Dieses Konzept basierte auf biochemische Daten, die zeigten, dass mehr fest an den Zielstandort als die völlig bestehend aus DNA-Basen mit RNA Moleküle binden. Zwar gab es zahlreiche Berichte von gen-Bearbeitung Erfolg mit Chimären Oligonukleotiden5,6,7, blieb die Bearbeitung Ebenen sehr variabel zwischen Experimenten und über verschiedene Zielzelle Kombinationen.
Einsträngige Spender DNA ist vorgezogen, Spender doppelsträngige DNA, weil es weniger wahrscheinlich, nach dem Zufallsprinzip Websites innerhalb der Genom-8zu integrieren ist. Exogen eingeführten einsträngige Oligonukleotide sind jedoch anfällig für schnelle Abbau von zellulären Nukleasen. Verschiedene Strategien, die Termini der Oligonukleotide vor Abbau zu schützen sind eingesetzt worden. Eine Exonuclease geschützt, einzelsträngigen DNA mit der gewünschten Reihenfolge war ausreichend, um erhalten eine Bearbeitung Effizienz in 0,1-1 % Bereich6. Verbessert und konsequentere Transfection Techniken, gepaart mit phänotypischen Auslesen erlaubt für konsistentere Bearbeitung durch mehrere Forschung Gruppen8,9,10,11, 12,13.
In den letzten 10 Jahren gab es erhebliche Anstrengungen zu Zielzellen besser geeignet, um gen zu bearbeiten. Eine Strategie beschäftigt die Modulation des Zellzyklus14,15,16. Während Bearbeitung Frequenzen unter normalen Reaktionsbedingungen mit einsträngiger Oligonukleotide (SsODNs) eingeführt schwebte kultivierte Säugerzellen zwischen 0,1 % und 1 %, die Frequenzen des Gens erhöhte 3 bis 5 fache bei Bearbeitung der Oligonukleotide in Zellen worden beim Übergang durch die S-Phase eingeführt. In eine separate Reihe von Experimenten demonstriert Brachman und Kmiec (2005), dass relativ hohe präzise gen bearbeiten (3-5 %) erzielt wurden, wenn in den Zellen für 24 h vor der Zugabe des Oligonukleotids17 2’3 ‘ Dideoxycytosine (DdC) inkubiert wurde . DdC reduziert die Rate der DNA-Replikation Gabel Bewegung, was darauf hindeutet, dass gen Bearbeitung von SsODNs in die Zellen wahrscheinlich Replikation die Einbeziehung von ODNs in Regionen aktive Replikation11,18 beinhaltet. Zusammen genommen, diese Studien führten zu dem Konzept, dass eine wachsende Wiederholunggabel als Bestandteil der wahre Wirkmechanismus von gen bearbeiten, Spender-DNA eingebaut wird unabhängig von ob eine doppelsträngige Pause vorhanden ist oder nicht19. Somit erfolgt die Korrektur einer Punktmutation oder den Ersatz eines Segments von DNA in das Chromosom über eine DNA-Paarung und Einzel-Strang Assimilation Weg.
Induzierende zufällige doppelsträngigen DNA-Brüchen in wachsenden Zellen mit kleinen Molekül-Agenten schafft ein Umfeld, in dem DNA-Replikationsereignisse ins Stocken geraten sind als die Zelle versucht, den Schaden20,21zu reparieren. Diese vorübergehende Verlangsamung der Replikation Gabeln ermöglicht eine effizientere Durchdringung der Chromatinstruktur durch einsträngige Bearbeitung Oligonukleotide, Ziel Barrierefreiheit15zu verbessern. Die Schaffung von Double-Stranded DNA bricht durch Medikamente wie VP16, Bleomycin, oder Camptothecin22,23, hat gezeigt, dass gen Bearbeiten von Ebenen durch fast 10-fache stimulieren bis zu 6-8 %. Allerdings sind zufällige doppelsträngigen DNA-Brüchen in einer therapeutischen Einstellung unerwünscht.
Gen, die Bearbeitung mit programmierbaren Nukleasen und Oligonukleotide wird auch angeregt während der Zellteilung24,25. Wenn Nukleinsäure-basierte Lieferung verwendet wurde, um unter der Regie von Homologie Reparatur in synchronisierten HCT-116 Zellen durchzuführen, Rivera-Torres und Kollegen zeigte die gleiche Erhöhung bei der Ausrichtung der Tätigkeit bei der Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) Beschäftigte mit einsträngiger Oligonukleotiden, beide in einem reproduzierenden Zelle Bevölkerung26,27 eingeführt. In jüngerer Zeit, Bialk und Kollegen zeigten, dass die Reparatur der einzelnen base Mutationen mit einsträngiger Oligonukleotide und eine Reihe von regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen Cas9 gruppierten (CRISPR/Cas9) Moleküle erfolgt mit höheren Wirksamkeit Wann ist die Zellpopulation S Phase28durchqueren. Das CRISPR-Molekül besteht aus RNA und Funktionen, um die Region innerhalb des Ziels DNA-Sequenz zu identifizieren, die für Dekolleté bezeichnet wird. Cas9 ist eine bakterielle Enzym, dessen Aufgabe ist es, doppelsträngige DNA in einer Nucleolytic-Austausch-Reaktion zu Spalten. So CRISPR Positionen des Komplexes auf der genomischen Ziel und Cas9 Nuklease führt der Doppelstrang-Pause. Lin Et al. (2014) zeigt auch die Bedeutung des Zellzyklus zur Erreichung der hohen Frequenzen des Gens bearbeiten, mit einem modifizierten CRISPR/Cas9 Ribonulceoprotien (RNP) Komplex-vermittelte Lieferung System in primären neonatale Fibroblasten, humane embryonale Stammzellen, und andere Zelle Linien24. So ist die Beziehung zwischen gen bearbeiten und Zellzyklus Progression für die Bearbeitung von Single-Agent-gen für kombinatorische gen mit programmierbaren Nukleasen und Spender DNA-Vorlagen bearbeiten. Während der kombinatorische Ansatz zur Bearbeitung von gen eine Vielzahl von Partnern mit der Spender-DNA-Vorlage zusammengebracht hat, verwenden die meisten Mitarbeiter im Außendienst CRISPR/Cas9, die Doppelstrang-Pause Funktion. Diese Entscheidung gründet sich auf die Benutzerfreundlichkeit dieses bestimmten genetischen Tools und die Flexibilität, mit der es Genfunktion zu deaktivieren oder eine ausländische Stück DNA in einem bestimmten Standort einzuführen eingesetzt werden kann. Die Generation von einem Knockout ist technisch einfacher gen Ersatz, im Vergleich zu wo die Einbeziehung der “richtige” oder normale Kopien eines Gens in der Krankheit-Website mit Präzision durchgeführt werden muss. Eine Reihe von Forschern identifizieren und untersuchen den Einsatz von bestimmten Medikamenten und Reagenzien, die es die Korrektur der mutierten Basen und die Einfügung von normalen genetischen Sequenzen in der richtigen Position um erhöhte Frequenzen29 ermöglichen.
Vor kurzem, Rivera-Torres Et al. 30 verwendet kombinatorische gen bearbeiten, unter Ausnutzung der Doppelstrang-Pause Aktivität eines speziell entwickelten CRISPR/Cas9-Systems und der genetischen Information zur Verfügung gestellt durch eine einsträngige Oligonukleotid Spender DNA-Vorlage zu reparieren ein Punktmutation in einemeinzelne Kopie des Gens verbesserte grün fluoreszierendes Protein (eGFP) in HCT116 Zellen integriert. Die Autoren nutzten diese gut charakterisierten Modell Zelllinie, die Spezifität der Spaltung, die rund um die Ziel-Site zu bewerten. Die Daten zeigen, dass Heterogenität an der Ziel-Site, vor allem in den Zellen vorhanden ist, die keine korrigierten Punktmutation enthalten. In dieser Handschrift die, wir ausführlich und konzentrieren sich auf die Methodik dieser Arbeitnehmer um zu prüfen, vor-Ort-mutagenen Heterogenität von CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung erstellt.
Gen, die Bearbeitung entstanden als Mainstream-wissenschaftliche Disziplin vor allem wegen der Entstehung der CRISPR/Cas9-System. Dieser bemerkenswerten Weg, die Adoptiveltern Immunität in Bakterienzellen erleichtert, hat als molekulare Werkzeug zur genomischen Veränderung im menschlichen Chromosomen ermöglichen zweckentfremdet worden. Die natürliche Funktion der CRISPR/Cas9 ist, virale DNA zu deaktivieren, durch die Einführung von doppelsträngigen DNA-Brüchen führt zu Fragmentierung30,31. Diese Aktivität führt zur Zerstörung des eindringenden exogenen DNS und führt zu prokaryotischen Immunität, die nachfolgende Infektion durch die gleichen Viruspartikel unterdrückt. Erstaunlich, weist dieses System Lungenpest Verhalten auf, dass es bestimmte CRISPR gRNA erstellt durch vorherige Infektionsereignisse zu reaktivieren.
Die Effizienz und Genauigkeit des Gens Störung katalysiert durch CRISPR/Cas9 wird in zahlreichen eukaryotischen genetischen Systeme wo war das Ziel, ein funktionierendes gen32,33zu deaktivieren. Wenn auf der basalen Ebene reduziert, besteht der Prozess aus zwei grundlegende Schritte. Die erste ist eine doppelsträngige zu brechen, während die zweite stützt sich auf die inhärenten Prozess der nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) zur Vervollständigung den Knockout. In den meisten Fällen die Doppelstrang-Pause-Ergebnisse bei der Erstellung von Blunt beendet, ausgekuppelten chromosomalen Segmente und an NHEJ beteiligten Enzyme der chromosomalen Pause reagieren und handeln, um den gebrochenen Enden verbinden. Dieser Prozess kann manchmal den Verlust einzelner Nukleotide auf dem abgetrennten Gelände beinhalten. Der Verlust sogar ein paar Grundlagen kann dazu führen, dass eine Frameshift und funktionaler Ausdruck hört auf. Die Verwendung von CRISPR/Cas9 um genetische Ko zu erstellen, durch die Gewinnung des natürlichen Prozess der NHEJ revolutioniert eukaryotischen Genetik; der Verlust der DNA an der Ziel-Site ist vorhersehbar und erwarteten.
Im Gegensatz zu gen Knockout wurden eine Reihe von Forschern bei dem Versuch, umleiten und Wiederverwendung von CRISPR/Cas9 Aktivität auf den Prozess der Homologie gerichtete Reparatur beauftragt. Ziel der Studien ist gen-Korrektur. Bei dieser Strategie wird CRISPR/Cas9 mit einer Spender-DNA-Vorlage kombiniert, die die genetische Information, einen angeborene Fehler zu reparieren oder gesunde Gene Mutationen einfügen bereitstellt. Frühe Berichte, die die bemerkenswerte Fähigkeit der CRISPR/Cas9, unter der Regie von Homologie Reparatur katalysieren Hervorhebung angezeigt (direkt oder indirekt), dass der Prozess in eine hochpräzise Mode24,34aufgetreten. Unser Labor hat unter der Regie von Homologie Reparatur oder gen-Korrektur mit einsträngiger Oligonukleotide in einem Versuch um zu definieren, den Mechanismus und die regulatorischen Schaltung, die es umgibt,15,17,18 studiert ,23. Wir konzentrierten sich in erster Linie auf das Gen einzelne Punktmutationen, bearbeiten, da dies die grundlegende genetische Mutation bekannt für viele Erbkrankheiten verantwortlich ist. Unsere grundlegende Kenntnisse der gen Bearbeitung führte uns die Präzision der CRISPR/Cas9 Aktivität in diesen Reaktionen seit der CRISPR/Cas9 Funktion in gen Knockout führt zur Bildung der Indels in Frage zu stellen. Wir verwendet eine wohldefinierte Modellsystem, anstatt ein Gen nicht auswählbar, aber klinisch relevant, um vor-Ort-Mutagenese in eine dezidiert reduktionistischen Mode zu studieren. Mithilfe einer einfachen Zielgen, auf welche gen Korrektur auf die genotypischen und phänotypischen Ebenen gemessen werden kann begründete wir, dass Heterogenität auftreten an der Ziel-Site in eine zuverlässige und robuste Art und Weise identifiziert werden konnten.
Unsere Daten bestätigen, dass die etablierten gen editing-System, bestehend aus einem mutierten eGFP gen integriert HCT116 Zellen können liefern grundlegende Informationen in Bezug auf die Erzeugung von genetischen Veränderungen und der Prozess der vor-Ort-Mutagenese. CRISPR/Cas9 und einsträngige Oligonukleotid Spender DNA-Moleküle im Tandem arbeiten können auf die genaue Reparatur die Punktmutation im gen eGFP führen. Wir schlagen ein neues Modell für die Reparatur von Punktmutationen, einen molekularen Weg, in denen die Spender-DNA fungiert als Kopiervorlage Replikation für die Reparatur der mutierten Basis, einen Prozess haben wir exakt30bezeichnet. Die gezielte Bevölkerung nicht ausstellen des korrigierten Phänotyps zeigt eine Vielzahl von Zellen enthält heterogene und weit reichende DNA Indels rund um die Ziel-Site. In etwa die Hälfte die Klone isoliert aus der unkorrigierte Bevölkerung wurde an der Ziel-Site Löschung Mutagenese beobachtet. Da keine vorherigen Bericht angegeben hat, dass einsträngige Oligonukleotide als Single-Agent-gen-editing-Tools Indels an die Ziel-Site induzieren können, wir schließen, dass CRISPR/Cas9 Aktivität für diese Mutationen verantwortlich ist.
In diesem Manuskript bieten wir eine detaillierte Methode, so dass genetische Heterogenität an der Ziel-Site in eine zuverlässige und robuste Art und Weise gemessen werden kann. Während der Analyse eine enorme Menge an Aufmerksamkeit geschenkt und Kartierung von Off-Site-Mutagenese, es wahrscheinlich ist, dass eine heterogene Mutation an die Ziel-Site erstellt haben einen größeren Einfluss auf den Erfolg oder Misserfolg des Gens im klinischen Bereich bearbeiten. Zusätzliche Technologien oder modifizierte Cas9 Proteine möglicherweise erforderlich, um die Genauigkeit der Homologie gerichtete Reparatur von angeborenen Fehlern in Säugerzellen35zu verbessern. Einige dieser Technologien umfassen die Verwendung von Hilfs Oligonukleotide als eine Brücke, die chromosomalen enden zusammenzuhalten und die Vermeidung von der zerstörerischen Wirkung des NHEJ handeln. Definieren den Grad der Heterogenität an der Ziel-Site durch Bearbeiten von Gen-Aktivität ist und ein wichtiger Bestandteil jedes Protokoll für eine therapeutische Intervention entwickelt werden muss.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
McCoy’s 5A Modified medium | ATCC | 30-2007 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
L-glutamine | ATCC | 30-2214 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | ATCC | 30-2300 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ATCC | 30-2200 | No Calcium or magnesium |
Trypsin EDTA Solution | ATCC | 30-2101 | |
Aphidicolin 1mg | Thermo Fisher | AC611970010 | |
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol | IDT | No catalog number since its made to your specific gene target. | |
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol | IDT | 1072533 | |
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg | IDT | 1074182 | |
IDTE Buffer | IDT | 11-01-03-01 | |
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm | VWR | 10497-474 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems | BioRad | 1652660 | |
Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE) |
Sigma | 05470-1G | |
EDTA (0.5 M), pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | AM9260G | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69581 | |
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates | VWR | 10062-892 | |
Petri Dishes | Fisher | 12-565-90 | |
Conical Tubes (15 mL) (racked) | Thermo Fisher | AM12500 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |