Methodenartikel
Quantitative Bewertung des Bakterienwachstums unbedingt mikrobielle Physiologie als Systemebene Phänomen zu verstehen. Ein Protokoll für experimentelle Manipulation und ein analytischer Ansatz eingeführt, ermöglicht präzise, Hochdurchsatz-Analyse der bakteriellen Wachstum, das ist ein zentrales Thema des Interesses in der Systembiologie.
Bakterielles Wachstum ist ein zentrales Konzept in der Entwicklung der modernen mikrobielle Physiologie, sowie bei der Untersuchung der zelluläre Dynamik auf der Systemebene. Jüngste Studien haben Zusammenhänge zwischen Bakterienwachstum und genomweite Ereignisse, z. B. Genom Reduktion und Transkriptom Reorganisation berichtet. Richtig analysieren Bakterienwachstum ist entscheidend für das Verständnis der Wachstum-abhängige Koordination von Genfunktionen und zellulären Komponenten. Dementsprechend ist die präzise quantitative Auswertung des Bakterienwachstums in gewissem Sinne Hochdurchsatz-erforderlich. Neue technologische Entwicklungen bieten neue experimentelle Tools, die Updates über die Methoden zur Untersuchung von Bakterienwachstum zu ermöglichen. Die hier vorgestellte Protokoll beschäftigt einen Mikrotestplatte Leser mit einem hochoptimierten experimentelle Verfahren für die präzise und reproduzierbare Auswertung des Bakterienwachstums. Dieses Protokoll wurde verwendet, um das Wachstum von mehreren Werten zuvor beschriebenen Escherichia-coli -Stämme. Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind wie folgt: die Vorbereitung einer großen Anzahl der Zelle Bestände in kleinen Fläschchen für wiederholte Prüfungen mit reproduzierbaren Ergebnissen, die Verwendung von 96-Well Platten für Hochdurchsatz-Wachstum-Bewertung und die manuelle Berechnung von zwei großen Parameter (d.h. maximale Wachstum Rate und Bevölkerung Dichte) repräsentieren die Wachstumsdynamik. Im Vergleich zu den traditionellen koloniebildenden Einheit (KBE) Assay, der die Zellen, die in Glasröhren im Laufe der Zeit auf Agarplatten kultiviert werden zählt, die vorliegende Methode ist effizienter und bietet detailliertere zeitliche Aufzeichnungen über Wachstum Veränderungen, aber hat eine strengere Nachweisgrenze bei niedrigen Bevölkerungsdichte. Zusammenfassend ist das beschriebene Verfahren vorteilhaft für die präzise und reproduzierbare Hochdurchsatz-Analyse des bakteriellen Wachstums, der konzeptionellen Schlussfolgerungen ziehen oder theoretische Bemerkungen verwendet werden kann.
Mikrobiologische Untersuchungen beginnen oft mit der Kultur der Bakterienzellen und der Bewertung der Bakterienwachstum Kurven, die ein grundlegendes Phänomen der bakteriellen Physiologie1,2,3darstellen. Grundlegende Kultur Prinzipien sind weit verbreitet in der veröffentlichten Literatur und Lehrbücher, weil Bakterienkultur eine grundlegende Methodik ist. Die Ebene der Bank erhebliche Aufmerksamkeit hat traditionell auf die Optimierung Wachstumsmedien und Kultivierung Bedingungen, sondern steuern die Wachstumsrate, die wahrscheinlich noch größeres Verständnis für mikrobielle....
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1. Vorbereitung das Wachstumsmedium
Hinweis: die chemische Zusammensetzung der minimale mittlere M63 lautet wie folgt: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4 1,8 µM FeSO 4, 15 µM Thiamin-HCl, 0,2 mM MgSO 4 und 22 mM Glukose. M63 erfolgt durch das Mischen von drei Stammlösungen: 5 X Lösung, 20 % Glukose und MgSO 4 Thiamin-Lösung. Speichern Sie alle Lösungen bei 4 ° c
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Das beschriebene Verfahren bietet die Möglichkeit, dynamische Wachstum von Bakterien in einer kontinuierlichen, Hochdurchsatz-Weise durch den Einsatz eines 96-Well-Format-Reader, der mehrere optische Dichtemessungen in verschiedenen Zeitabständen (von Minuten bis Stunden bis Tage) nimmt zu erfassen. Die Wachstumskurven aus einer Zusammenstellung von E. Coli -Stämme, die mit dem Ausdruck verschiedener Genome können genau in einem einzigen Experiment (Abbildung.......
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Wichtige Schritte im Protokoll sind die Vorbereitung einer Stammaktie der exponentiell wachsenden Zellen und die Replikation der gleichen Proben in mehreren Brunnen an verschiedenen Positionen auf die Mikrotestplatte. Zuvor, Mikrobiologen die Kultur angefangen eine Übernachtung Vorkultur. Während diese Methode die Verzögerungszeit des Bakterienwachstums verringern kann, ist es schwierig, reproduzierbare Wachstumskurven zu erreichen. Wie in Abbildung 2dargestellt, führte die unabhängigen Mess.......
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Wir danken für die Bereitstellung der KBE-Assay-Beispiel Kohei Tsuchiya. Diese Arbeit wurde teilweise finanziell durch eine Beihilfe für wissenschaftliche Forschung (C) Nr. 26506003 (zu BWY) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie, Japan unterstützt.
Die Autoren haben nichts preisgeben.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamin-HCl | Wako | 201-00852 | |
| Glukose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Zentrifugenröhrchen (50 mL, sterilisiert) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipettenspitzen, 200 & Mikro; L | WATSON | 110-705Y | |
| Pipettenspitzen, 1.000 & Mikro; L | WATSON | 110-8040 | |
| Mikroröhrchen (1,5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 Mehrkanal-Pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA RÜHRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glaszylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Präzisions-pH-Mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Serolocische Einwegpipetten (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Serolocische Einwegpipetten (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Mikroröhrchenständer | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-Well-Mikroplatte mit Deckel (flacher Boden, klar) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar Reagenzreservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0,22 & Mikro; M) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Entsorgungszelle (1,5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spektralphotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014- EP2-002 / EPOCH2T | |
| Becher (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO Clean Bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glasröhren | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silikonkautschuk-Stopfen | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bakterienstämme | Organisation der Stammbank; Nationales Bioressourcenprojekt (NBRP) in Japan |
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