Viele Vision-bedrohlichen okuläre Erkrankungen gehen einher mit dysfunktionalen retinalen mikrogefäßen. Daher ist die Messung der retinalen arteriola Antworten wichtig, die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für Maus retinalen arteriola Isolation und Vorbereitung zur Bewertung der Auswirkungen von vasoaktive Substanzen auf vaskuläre Durchmesser.
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Methodenartikel
Vorbereitende Schritte für die Messung der Reaktivität in Maus retinalen Arteriolen Ex Vivo
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Vaskuläre Insuffizienz und Veränderungen in der normalen retinalen Durchblutung gehören zu den Hauptfaktoren für die Pathogenese der verschiedenen Anblick-bedrohlichen okuläre Erkrankungen wie Diabetische Retinopathie, Hypertensive Retinopathie und Glaukom. Netzhaut mikrovaskuläre Vorbereitungen sind daher entscheidende Instrumente zur physiologischen und pharmakologischen Studien, die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen abzugrenzen und zu Design-Therapien für Krankheiten. Trotz der breiten Verwendung von Mausmodellen in Augenheilkunde sind Studien über die Netzhaut vaskuläre Reaktivität knapp in dieser Spezies. Ein wesentlicher Grund für diese Diskrepanz ist die anspruchsvolle Isolierungsmaßnahmen aufgrund der geringen Größe der diese Netzhautgefäße, die ~ ≤ 30 µm luminalen Durchmesser. Um das Problem der direkten Isolation dieser Netzhaut mikrogefäßen für funktionelle Studien zu umgehen, haben wir eine Isolation und Vorbereitung Technik, die ex-Vivo -Studien der retinalen Vasoactivity Maus in der Nähe von physiologischen Bedingungen ermöglicht . Obwohl die vorliegenden experimentellen Vorbereitungen speziell auf die Maus retinalen Arteriolen beziehen werden, kann diese Methode leicht zu mikrogefäßen von Ratten eingesetzt werden.
Einleitung
Störungen im retinalen Durchblutung haben in der Pathogenese der verschiedenen augenfälligen Krankheiten, z. B. Diabetische Retinopathie und Hypertensive Retinopathie Glaukom1,2,3verwickelt. So Studien zur Messung der vaskulären Reaktivität in der Netzhaut sind wichtig, um die Pathophysiologie dieser Krankheiten zu verstehen und entwickeln neue Behandlung nähert.
Durch die Möglichkeit der Genmanipulation im murinen Genom ist die Maus eine weit verbreitete Tiermodell für Studien des Herz-Kreislauf-System4geworden. Jedoch wegen der geringen Größe der Netzhautgefäße (≤ 30 µm) ist Messung der vaskulären Reaktivität in der Maus Netzhaut anspruchsvoll. Z. B. stereomicroscopic Techniken zur in Vivo Messung sind in ihrer optischen Auflösung begrenzt und erlauben daher nur zum Erkennen von Änderungen im Durchmesser oder Blut fließen in kleinen Blut von weniger als ≤ 30 µm Durchmesser bei der Ausstattung mit genau Weitere anspruchsvolle Geräte wie ein confocal Mikroskop mit Fluoreszenzfarbstoffen oder die Adaptive Optik Scannen Licht Ophthalmoskop5,6. Darüber hinaus ändert sich die Interpretation der in Vivo Messungen zur Ermittlung lokaler signalisieren, dass Mechanismen in retinalen Blutgefäßen durch Anästhetika, verwechselt werden können in systemischen Blutdruck und der Einfluss des retrobulbären Blutgefäße.
Daher entwickelten wir eine Methode zur Messung der Reaktionen der Netzhautgefäße Maus mit hochauflösenden optischen ex Vivo. Die enthaltenen erlaubt Visualisierung der retinalen Arteriolen über übertragen Lichtmikroskopie. Diese Methode, die auch bei Ratten verwendet werden kann, bietet Zugriff auf die Vorteile der Gene targeting-Technologie in okulären Gefäßforschung.
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Protokoll
Die experimentellen Verfahren dieser Studie wurden durch die Animal Care Ausschuss des Landes Rheinland-Pfalz, Deutschland genehmigt. Tierbetreuung entsprach der institutionellen Richtlinien and The Association Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augenheilkunde und Vision Forschung. Nach der EU-Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche wurden die Tiere behandelt. Männliche C57BL/6J Mäuse (The Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME, USA) im Alter von 3 bis 4 Monate waren für die Experimente verwendet. Tiere waren unter Standardbedingungen (Temperatur 23 ± 2 ° C, Luftfeuchtigkeit Bereich 55 ± 10 % und 12 h hell/dunkel-Zyklen) untergebracht und hatten Zugang zu standard-Maus Chow und Wasser Ad Libitum.
1. Isolierung der Maus Retina
- Legen Sie die Dissektion Instrumente auf dem Vorbereitungstisch und prüfen Sie, ob alle Instrumente ermöglichen eine schnelle Zubereitung abgeschlossen sind.
- Die Maus durch CO2 Inhalation zu opfern.
- Enthaupte die Maus mit Stahl Schere, Schädel-Sagitally in zwei Hälften, die mit der gleichen Schere schneiden und entfernen Sie die Haut und das Gehirn mit Auge Schere (Abbildung 1).
- Die Schädelknochen lassen nur den augenhöhlenknochen mithilfe Auge Schere abgeschnitten.
- Übertragen Sie die Umlaufbahn in eine Dissektion Schale mit eiskalten Krebs-Henseleit-Puffer.
- Halten Sie die Dissektion Gericht auf Eis oder ändern Sie den Puffer alle 10 Minuten.
- Schneiden Sie die augenhöhlenknochen mit Auge Schere und entfernen Sie vorsichtig die Augapfels zusammen mit dem orbital Gewebe mit Typ 4 Präzision Pinzetten und Student Vannas Frühjahr Scheren (Abbildung 2).
- Entfernen Sie vorsichtig die Harderian Drüse, Bindegewebe und die extraokularen Muskeln mit Typ 5 Präzisions-Pinzetten und Vannas kapsulotomie Scheren, kümmert sich nicht um die Hauptniederlassung der Augenarterie beschädigen.
- Verbinden Sie orbital Zweige von der Augenarterie und schließlich das proximale Ende der wichtigste Zweig der Augenarterie mit 10: 0 Nylon Fäden (Abbildung 3).
- Übertragen des Augapfels in eine Petrischale mit 70 % igem Ethanol für 10 s mit 4 Präzisions-Pinzette geben. Setzen Sie des Augapfels wieder in die Dissektion Gericht und ersetzen Sie den Puffer mit frischen Krebs-Lösung zu. Die Hornhaut wird nach Ethanol Exposition weißlich erscheinen.
- Punktieren Sie die periphere Hornhaut mit einem 30 Gauge-Nadel und sezieren Sie die Hornhaut mit einer Schere Vannas kapsulotomie. Schonend Iris Gewebe geschnitten Sie ab, legen Sie eine scharfe Spitze der Vannas kapsulotomie Schere zwischen der Aderhaut und der Netzhaut und der Aderhaut und Lederhaut abgeschnitten. Lassen Sie einige skleralen Gewebe rund um den Sehnerv (Abbildung 4).
2. Montage der Netzhaut in der Perfusion Kammer
Hinweis: Die Perfusion Kammer zur Netzhaut arteriola Experimente ist hausgemacht. Es besteht aus einem transparent Reservoir mit einem ein- und Abfluss Rohr (Abbildung 5). Einem Ende ein Silikonschlauch wird auf den Boden der Kammer mit Klebstoff Histoacryl und das andere Ende an ein Dreiwege Hahn befestigt geklebt. Schließen Sie eine Spritze mit frischen Krebs-Puffer, der drei-Wege-Hahn und füllen Sie das Rohr mit Puffer.
- Nehmen Sie ein Glas Mikropipette mit einem Nadelhalter und schieben Sie es in das Ende des Rohres an der Unterseite der Perfusion Kammer. Dann brechen Sie die Spitze der Mikropipette mit Typ 4 Scheren, ein Trinkgeld von 100 µm Durchmesser zu erhalten.
- An der Spitze der Mikropipette konzentrieren Sie und spülen Sie es über die Spritze mit dem Schlauch verbunden. Darauf achten Sie, dass die Kapillare nicht durch Trümmer verdeckt ist. Im Falle einer Okklusion entfernen Sie, spülen Sie den Schlauch und fügen Sie ein weiteres Mikropipette.
- Füllen Sie die Perfusion Kammer mit kalten Krebs Puffer und setzen Sie die Kammer unter dem Stereo-Mikroskop.
- Legen Sie eine transparente Kunststoff-Plattform in der Perfusion Kammer. Diese Plattform hat eine Einrückung von 1,8 mm Breite für den Sehnerv und der Augenarterie und befindet sich an zwei Stahlseilen von 1,6 mm Durchmesser. Legen Sie dann einen Edelstahl-Ring von 2,8 mm Innendurchmesser und 4,0 mm Außendurchmesser auf die Plattform.
- Übertragen der Netzhaut mit dem Sehnerv und angehängten Augenarterie aus der Dissektion Kammer in die Perfusion Kammer äußerst vorsichtig mit einem Löffel. Dieser Schritt ist wichtig zur Vermeidung Dehnung des Gewebes, wie es möglicherweise nachteilig auf das Experiment.
- Der genähten Teil das proximale Ende der Augenarterie abgeschnitten, legen Sie zwei vorgeformte Schleifen von 10-0-Nylon-Naht auf der Mikropipette und cannulate der Augenarterie mit der Mikropipette. Binden Sie die Arterie, die Mikropipette (Abbildung 6) und platzieren Sie die Netzhaut auf die transparente Plattform Pinzette fein-Punkt.
- Schonend reißen Sie der vorderen Linse Capsula mit zwei feinen Spitze Pinzette auf, ziehen Sie die Linse heraus und schneiden Sie die ganze Linse Capsula mit Microscissors.
- Anschließend stellen Sie vier radiale Einschnitte in die Netzhaut Hälfte der Strecke von der Pars Plana des Sehnervs und legen Sie einen Edelstahl-Ring auf die Netzhaut, es unten zu befestigen. Die Netzhaut ist nun bereit für das Experiment (Abbildung 7).
3. Vorbereitung der retinalen Arteriolen für das Experiment
- Ort der Perfusion Kammer unter einem Lichtmikroskop. Das Ziel ist eine 100 X Eintauchen in Wasser Objektiv.
- Verbinden Sie die beiden Schläuche für in - und out - flow mit einer pericyclic Pumpe und zirkulieren Sie die Kammer mit Krebs-Puffer mit 95 % O2 Sauerstoff und Kohlensäure mit 5 % CO2 bei 37 ° C. Verwenden Sie einen Durchfluss zwischen 100 und 120 mL/min.
- Schließen Sie den Silikonschlauch, welche an die Mikropipette angeschlossen ist, an ein Reservoir Silikon Schlauch über ein drei-Wege-Hahn. Dann füllen Sie den Tank mit Krebs Puffer bis zu einer Höhe 50 mm Hg entspricht aber noch nicht die drei-Wege-Absperrhahn geöffnet.
- Schauen Sie durch die Ziele des Mikroskops und Fokus auf der retinalen Oberfläche. Suche nach Blutgefäßen oder roten Blutkörperchen. Es ist möglich, dass die Blutgefäße vollständig manchmal nur einige rote Blutkörperchen sichtbar sind zusammengebrochen sind.
- Wenn ein Blutgefäß gefunden wird, darauf konzentrieren und die drei-Wege-Hahn öffnen. Der Durchmesser des Gefäßes sollte sofort erhöhen und die roten Blutkörperchen bewegen entweder Zentrifugal, ob es eine arteriola, oder centripetally im Falle einer Venole. Die Arteriolen sind kleiner im Durchmesser im Vergleich zu Venolen der gleichen Größenordnung.
- Wenn ein Blutgefäß mit einem gut sichtbaren Wand gefunden ist, kann es für Experimente, die nach einer gasgleichgewichtherstellung von 30 min (Abbildung 8) eingesetzt werden. Zur Zeit der Gleichgewichtherstellung entwickeln die Arteriolen nur schwach inneren Ton, was zu weniger als 10 % der luminalen durchmesserreduzierung.
4. Durchführung des Experiments
- Testen Sie die Tragfähigkeit der Schiffe mit der Thromboxan mimetischen 9,11-Dideoxy-9α, 11α-Methanoepoxy Prostaglandin F2α (U46619), indem es zu den Bad-Lösung. Dieser Agent verengt Maus retinalen Arteriolen um ca. 50 % von Ruhestellung Durchmesser bei Konzentrationen von ≥ 10-6 M.
- Sobald das Schiff tragfähige bestätigt wird, waschen Sie die Agonisten aus dem Bad durch die Umwälzpumpe und liefern Sie frische Krebs Puffer in die Wanne.
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Ergebnisse
U-46619 produziert Konzentration abhängig Vasokonstriktor Antworten in retinalen Arteriolen von Wildtyp Mäusen C57Bl/6J Hintergrund. Bei einer Konzentration von 10-6 M war die Reduktion der luminalen Durchmesser ≈50 % aus ruhenden Durchmesser. Abbildung 9A zeigt eine repräsentative Konzentration-Wirkungs-Kurve von einem retinalen arteriola. In Arteriolen mit U46619 preconstricted evozierte kumulative Gabe von Acetylcholin Konzentration abhängig Erh...
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Diskussion
Die Messung der vaskulären Antworten in der Maus Netzhaut ist schwierig, aufgrund der geringen Größe der Netzhautgefäße. Mit der vorgestellten Technik sind retinale Arteriolen durch übertragbare Lichtmikroskopie visualisiert. Dies ist möglich, weil die isolierte Netzhaut lichtdurchlässig ist. Der Vorteil des Verfahrens ist die hohe optische Auflösung. Die berechnete räumliche Auflösung beträgt 11 px/µm. Allerdings ist die echte Auflösung für das optische System, das weißes Licht verwendet, zwischen 200 und 300 nm, die du...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Ernst Und Berta Grimmke Stiftung und die Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (DOG) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Stahlschere | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Augenschere | Geuder | G-19390 | 1x gerade, 10,5 cm |
| Präzisionspinzette, gerade mit feinen | Spitzen Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x Typ 4 |
| Präzisionspinzette, gerade mit extra feinen Spitzen | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x Typ 5 |
| Vannas Kapsulotomieschere | Geuder | 19760 | 1x gerade, 77 mm |
| Student Vannas Federschere | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x gebogen, |
| Barraquer Nadelhalter | Geuder | G-17500 | 1x gebogen, 120 mm |
| Nadel | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 g |
| Glaskapillaren (zur Herstellung von Mikropipetten) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1,2 x 0,8 mm; Außen-/Innendurchmesser) |
| Nylon Nahtmaterial | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon Zellkulturschale | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm Durchmesser |
| Nunclon Zellkulturschale | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm Durchmesser |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl selbstklebend | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
| Ausrüstung | |||
| Perizyklische Pumpe (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertikaler Pipettenabzieher Modell 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Mikroskop (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Wasserimmersionsobjektiv LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digitalkamera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusionskammer | Eigenbau | 1x | |
| Name | <>Unternehmen | Katalognummer< | strong>Kommentare |
| Arzneimittel und Lösungen | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kaliumchlorid (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesiumsulfat (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glukosemonohydrat | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-Dideoxy-9α,11α-Methanoepoxyprostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholinchlorid | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
Referenzen
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
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- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
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Nachdrucke und Genehmigungen
