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Methodenartikel

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

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DOI:

10.3791/56213

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31. Januar 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschreiben, wie Laser Microirradiation verwenden, um verschiedene Arten von DNA-Schäden, einschließlich der relativ einfachen Strangbrüche und komplexen Schäden an DNA-Schäden Signal- und Reparatur Faktor Montage an Schaden Standorten in-vivo Studie zu induzieren .

Zusammenfassung

DNA-Schädigung induziert spezifische Signal- und Reparatur Reaktionen in der Zelle, die entscheidend für den Schutz der Integrität des Genoms ist. Laser Microirradiation wurde eine wertvolle experimentelles Werkzeug, das DNA-Schäden Antwort (DDR) in Vivozu untersuchen. Es ermöglicht hochauflösende einzellige Echtzeitanalyse von makromolekularen Dynamik in Reaktion auf Laser-induzierten Schäden beschränkt sich auf eine Submikrometer-Region im Zellkern. Jedoch wurden verschiedene Laser Bedingungen ohne Anerkennung der Unterschiede in der Art der Schäden induzierte verwendet. Infolgedessen ist die Art des Schadens oft nicht gut gekennzeichnet oder kontrolliert werden, verursacht die scheinbaren Widersprüche in der Einstellung oder Änderung Profile. Wir zeigten, dass verschiedene Bestrahlungsbedingungen (d.h., verschiedene Wellenlängen sowie verschiedene Eingabe Kräfte (Bestrahlungsstärke) eines Femtosekunden (fs) Nah-Infrarot (NIR) Lasers) verschiedene DDR und Reparatur Protein Baugruppen induziert. Dies spiegelt die Art von DNA-Schäden produziert. Dieses Protokoll beschreibt wie Titration der Eingangsleistung Laser ermöglicht Induktion unterschiedliche Mengen und Komplexität von DNA-Schäden, die durch den Nachweis von Base und Vernetzung Schäden, differenzielle Poly (ADP-Ribose) (PAR) Signalisierung, leicht überwacht werden kann und Bahn-spezifische Reparatur Faktor Baugruppen an Schaden Standorten. Nachdem die Schäden Bedingungen ermittelt wurden, ist es möglich, die Auswirkungen der verschiedenen Schäden Komplexität und Differenzial Schaden Signalisierung sowie Erschöpfung der vorgelagerten wird auf jeder Faktor von Interesse zu untersuchen.

Einleitung

In Vivo DNA-Schäden-Signalisierung ist nicht gut verstanden
In Vivo, ist DNA komplexiert mit Histone und andere Faktoren in Form Chromatin Fasern. Regulierung der Chromatinstruktur ist von größter Bedeutung für die DNA-Stoffwechsel. Beispielsweise ist die Histon-Variante H2AX phosphoryliert durch Ataxie-Teleangiektasie mutiert (ATM) und anderen Kinasen folgende Doppel-Strang bricht (DSB) Induktion, und ist wichtig für DSB Schaden Signalverstärkung sowie eine Docking-Website für andere Faktoren. Verbreitung von Schäden Signal- und Reparatur Weg Wahl scheinen kritisch von lokalen Chromatinstruktur bei Schäden Seiten1beeinflusst werden. Eine Reihe von Chromatin umgestalten Faktoren, Histon Chaperone und Histon ändern Enzyme sind in der Tat rekrutiert, um Websites zu beschädigen und sind wichtig für effiziente DNA-Reparatur, die Bedeutung der Chromatin-Verordnung in der DDR und Reparatur2 , 3 , 4. Darüber hinaus Schäden Website clustering oder Neupositionierung wurde beobachtet in Hefe und Drosophila5,6,7,8, erinnert an Relokalisierung der gen-Loci in der subnukleare Fach gen Verordnung9,10zugeordnet. Neuere Studien in Maus und menschlichen Zellen gezeigt auch Mobilisierung der DSB-Seiten, welche Einflüsse Treue und Weg Wahl11,12reparieren. Dies wirft die Möglichkeit, dass die DDR/Reparatur auch eng mit nuklearen Architektur, höherer Ordnung Chromatin Organisation und Chromosom Dynamik im Zellkern verbunden werden kann. Daher ist es wichtig, entwickeln hochauflösende Methoden, die DDR zu studieren und Reparaturprozesse in der endogenen nuklearen Umfeld in einer live Zelle um kurz- und langfristigen Folgen von DNA-Schäden zu verstehen.

Entscheidende Rolle der PAR Polymerase (PARP) bei der Messung das Ausmaß und die Art des Schadens und Regulierung Protein Montage am Standort Schaden
PARP1 ist ein DNA-Nick-Sensor schnell aktiviert durch DNA-Schäden, die in DNA Reparatur13eine entscheidende Rolle spielt. PARP1 wurde ursprünglich gedacht, um zusammen mit x-ray reparieren Cross Ergänzung 1 (XRCC1) base Excision Repair (BER) zu erleichtern, aber neuere Studien zeigen seine Rolle in anderen DNA-Reparatur Bahnen, darunter DSB-Reparatur-14. Aktiviert PARP1 Verwendungen Nicotinamid Adenin Dinucleotide (NAD+) als Substrat zu ADP-Ribosylate mehrere Zielproteine, einschließlich sich selbst. Dieses Enzym und andere Familienmitglieder haben viel Aufmerksamkeit in den letzten Jahren angezogen, wie PARP-Inhibitoren als viel versprechende Medikamente gegen Krebs entstanden sind. Obwohl PARP-Inhibitoren zunächst fand bei Brustkrebs-Gen (BRCA) wirksam-Brustkrebs-Zellen, mutiert es gibt jetzt eine Fülle von Beweisen für ihre Wirkungen in Mono- und Kombination Therapien zusammen mit DNA Beschädigung Agenten/Bestrahlung gegen ein breites Spektrum an Krebserkrankungen mit Mutationen nicht beschränkt auf BRCA15,16,17,18,19,20.

Auf der molekularen Ebene zeigte PARP Aktivierung spielen wichtige Rollen bei der Organisation der lokalen Chromatinstruktur Standorten Schaden. PAR-abhängigen Rekrutierung von Chromatin Modifikation Enzyme erleichtert die DSB-Reparatur und Diktat reparieren Weg Möglichkeiten, was die wichtige Gerüst Rolle PAR Modifikation an Schaden Standorten. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 , wir haben vor kurzem gezeigt, den Ausschluss von p53-bindendes Protein 1 (53BP1) vor Schäden durch PAR 32, bietet eine alternative Erklärung für 53BP1-abhängige Überaktivierung des nicht-homologe Endjoining (Seiten NHEJ) durch PARP-Inhibitor und Hervorhebung der Bedeutung von PARP in DSB reparieren Weg Wahl33,34. PARP1 Faktoren direkt PARylates und wirkt sich auf die Aktivität von mehreren DNA Reparatur auch14.

Mit Laser Microirradiation als Werkzeug zur DDR/Reparatur In Vivo Studie
Laser Microirradiation, Sub-Mikrometer-Änderungen auf den einzelnen Chromosomen zu produzieren wurde zuerst 196935 beschrieben und detailliert in 198136geprüft. Einige Jahrzehnte später, Laser Microirradiation wurde gezeigt, dass DNA-Schäden an einer definierten Submikrometer-Region im Zellkern zu induzieren, und erwies sich als eine wertvolle Technik, Einstellung oder Modifikationen verschiedener Faktoren zu DNA-Läsionen in Vivo zu studieren 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. diese Methode ermöglicht die Erkennung von jene Faktoren, die keine ausgeprägte Bestrahlung-induzierte Brennpunkte (IRIF) bilden, um Schäden Seiten39,42. Es ist auch möglich, die räumlich-zeitliche Dynamik des Chromatin Strukturveränderungen an Schaden Standorten und in den Rest des Kerns zu untersuchen. Wir sorgfältig verglichen die DDRs induziert durch verschiedene Lasersysteme und Befugnisse, die Beziehung zwischen der Art von DNA-Schäden und die Microirradiation Bedingungen32,43,44, zu bewerten 45. Die aberrante Einstellungsmuster der 53BP1 und telomeric wiederholen Bindungsfaktor 2 (TRF2) beobachtet in den vorherigen Laser Schaden Studien, die die Grundlage für die wiederkehrende Sorge um die "physiologisch" Art der Laser-induzierten Schäden46 ,47,48,49. Wir fanden, dass jetzt diese wesentlichen Unterschiede erklärt werden könnte, durch differenzierte PARP Signalisierung, die Menge und Komplexität der induzierten Schäden32Lehren. Wir bestätigen, dass: 1) Laser-Microirradiated Zellen (auch nach hoher Eingangsleistung Bestrahlung) sind in einer Beschädigung Prüfpunkt Kontrolle-abhängigen Weise in Interphase verhaftet und lebensfähig bleiben (mindestens bis zu 48 h)32,50; und 2) Reparatur Faktor Rekrutierung/Modifikationen treu rekapitulieren die Behandlung mit herkömmlichen DNA-schädigenden Agenzien und DSB Induktion von Endonucleases32,39,42, beobachtet 44,50,51,52. Diese Ergebnisse unterstützen nachdrücklich die physiologische Relevanz Laser Schaden-induzierte zelluläre Reaktionen zu studieren.

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Protokoll

1. grundlegende Zelle Vorbereitung

Hinweis: Dieser Schritt ist für standard Immunfluoreszenz Erkennung des endogenen Protein Einstellung oder Änderung und für die Verwendung einer Zelllinie stabil ein Eindringmittel tagged rekombinantes Protein zum Ausdruck zu bringen. Zum Beispiel studieren Potorustridactylus (PtK2) Beuteltiere Niere Epithelzellen stabil mit dem Ausdruck EGFP-53BP11220-1711 oder TRF2-YFP in unserem früheren verwendet wurden (Abbildung 1)32. Im ersten Fall, den Fokus bilden Region von 53BP1 (Aminosäure 1220-1711), enthält die Oligomerisierung Domäne, der Tudor-Domäne und das Motiv Ubiquitylation-abhängigen Rekrutierung (UDR), verbesserte GFP (EGFP-53BP11220-1711) verschmolzen wurde. Dieses Schmelzverfahren Protein rekapituliert die Schäden Website Rekrutierung des abendfüllenden 53BP153,54,55. In HeLa-Zellen müssen Eindringmittel tagged Untereinheiten der Cohesin (z.B.hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52und GFP-SA2 51) stabil um effiziente Einbindung in die Anlage zu gewährleisten und zu rekapitulieren ausgedrückt werden die S/G2 Zellzyklus phasenspezifische Schaden Website Rekrutierung von endogenen Cohesin51.

  1. Samen Sie adhärente Zelltypen jeglicher Art auf einer 35 mm Gewebe Kulturschale mit einem gerasterten Deckgläschen, um einzelne Zelle Identifikation zu ermöglichen. Passen Sie die erste Zelle um 60 % Konfluenz in 36-48 h basierend auf die Proliferationsrate der besonderen Zelllinie zu erreichen an. Zum Beispiel:
    1. Für PtK2 Beuteltiere Niere Epithelzellen (Wildtyp oder diejenigen stabil EGFP-53BP11220-1711 oder TRF2-YFP auszudrücken): Platte 2.0 x 104 Zellen in 2 mL Advanced Minimum wesentliches Medium (MEM) mit 2 mM L-Glutamin, 4 % fetalen Rindern ergänzt Serum (FBS) und Antibiotika (100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin) und Inkubation bei 37 ° C mit 7 % CO2.
    2. Für HeLa Zellen mit mit dem Ausdruck stabil Eindringmittel Verschlagwortet mit rekombinante Proteinen GFP-SA2: Samen 1.0 x 105 Zellen in 2 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt und Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2. Anderen HeLa-Zellen können auch verwendet werden, einschließlich der nicht modifizierten Zellen oder Zellen mit dem Ausdruck hSMC1-GFP.
  2. Zellen zu halten und vermehren sich für 36-48 h vor DNA-Schäden Induktion am Zusammenfluss von 30-60 % (ermöglicht Visualisierung der Raster-Zahl) zu ermöglichen. Fahren Sie mit Abschnitt 4.

(2) transiente Transfektion

Hinweis: Manchmal gute Antikörper sind nicht zur Verfügung, um die körpereigene Proteine erkennen. Wenn Zelllinien stabil Markerproteine ausdrücken nicht zur Verfügung stehen, führen Sie transiente Transfektionen Eindringmittel markierte Proteine für live Cell Analysen zu überwachen.

  1. Samen Sie für HeLa-Zellen, an Tag 1 6-8 x 104 Zellen in 0,5 mL Kulturmedien in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie in einem 100 % befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und mit 5 % CO2. Siehe Schritt 1.1 für Kulturmedien Bedingungen.
  2. Tag2, Gebrauch ein Säugetier Expressionsplasmid Codierung Eindringmittel tagged DNA Reparatur Faktor (z. B.GFP-NTH1 oder GLP-OGG1 für Grundschaden32,44,56, GFP-Ku für hohe Dosis DSB57, GFP-53BP1 32 für relativ einfache DSB oder andere Proteine des Interesses mit fluoreszierenden Tag verschmolzen), Liposomen-vermittelte DNA Transfektion durchzuführen. Verdünnen Sie 0,3 µg Plasmid DNA in 25 µL serumfreien Kulturmedien in einem 1,5 mL-Tube.
  3. Verdünnen Sie in einem anderen 1,5 mL-Tube 1 µL Liposomen-basierte DNA Transfection Reagens in 25 µL Serum-freie Kultur, Medien und mischen Sie vorsichtig.
  4. Den verwässerte DNA und Transfektion Agent mischen und 10 min bei Raumtemperatur (RT) Form DNA-Lipid komplexe inkubieren.
  5. Zellen mit 0,5 mL Nährmedien einmal spülen, entfernen Sie das Medium und die Zellen (wie in Schritt 1.1) 0,5 mL frische Kulturmedien hinzufügen.
  6. Die Zellen die DNA-Lipid komplexe hinzufügen. Mischen Sie durch Schaukeln der Plattenrandes ein paar mal vorsichtig. Setzen Sie die Zellen wieder in den Inkubator wie in Schritt 2.1.
  7. Nach ca. 4-6 h, die Nährmedien aus den Zellen zu entfernen, und fügen 300 µL 0,05 % Trypsin-EDTA. Entfernen Sie sie, fügen Sie 200 µL Trypsin-EDTA und im Inkubator für 3-4 min 37 ° C inkubieren.
  8. Fügen Sie nachdem Sie bestätigt haben, dass die Zellen getrennt sind 800 µL Nährmedien und Aufschwemmen der Zellen durch sanft um die Zelle Klumpen brechen pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf einer 35 mm-Kulturschale mit einem gerasterten Deckgläschen, und fügen Sie Nährmedien zu einem Endvolumen von 2 mL.
  9. Inkubieren Sie Zellen in den Inkubator wie in Schritt 2.1 für 48 h, dann gehen Sie zu Abschnitt 4.
    Hinweis: Wenn der Ausdruck des rekombinanten Proteins giftig ist (transfizierte Zellen zeigen Runde oder unregelmäßig Morphologie nach der Inkubation in Schritt 2,8), die Ausdruck zu verkürzen, und führen Sie Laser Microirradiation (Abschnitt 4) 16-20 Uhr nach Transfektion, solange die Protein-Expression kann bestätigt werden (für Fluoreszenz-Detektion, siehe Punkt 4.3). In diesem Fall führen Sie Transfektion direkt in der 35-mm-Schale. Samen 3.0 x 105 HeLa-Zellen in einer 35-mm-Schale mit einem gerasterten Deckgläschen zu erreichen ca. 50-70 % Zusammenfluss nach 30 h. Transfect DNA Plasmide, und wechseln Sie Medium 2-6 h nach Transfektion. Fahren Sie mit Laser Microirradiation 12-20 h später, wenn Protein-Expression vernünftig ist und Zellen gesund erscheinen.

(3) Zellzyklus Synchronisation

Hinweis: Für homologe Rekombination (HR) Proteine zu reparieren, wie Rad51 und Cohesin, die Einstellung ist noch ausgeprägter in S/G2-Phase des Zellzyklus, in welchen HR Reparatur Platz51 dauert. So, um die Rekrutierung dieser Proteine zu überwachen, ist Zelle Synchronisierung S/G2-Phase notwendig.

  1. S/G2-Phase Synchronisation
    1. Verwenden Sie das doppelte Thymidin-Block-Protokoll für Zelle S/G2 Phase50,51-Synchronisation. Nach der Aussaat der Zellen in einer 35 mm gerasterten Deckglas Petrischale (siehe Punkt 1.1), Inkubation der Zellen mit Thymidin (um eine Endkonzentration von 2,5 mM) in Kulturmedien (wie in Schritt 1.1) für 17 h bei 37 ° C und 5 % CO2.
    2. Spülen Sie die Zellen mit 1 mL Thymidin-freie Kultur Medien (wie in Schritt 1.1) zweimal, und inkubieren Sie die Zellen in 2 mL Thymidin-freie Kulturmedien für 9 h wie in Schritt 1.1.
    3. Eine Endkonzentration von 2,5 mM Thymidin fügen Sie 200 µL 27,5 mM Thymidin-Stammlösung (aufgelöst in Kulturmedien hinzu) in den Kulturmedien mit den Zellen. Brüten Sie die Zellen wie in Schritt 3.1.1 für eine weitere 15 h spülen und inkubieren Sie die Zellen in Kulturmedien für 4-6 h Thymidin-frei und verursachen Sie DNA-Schäden (Abschnitt 4).
    4. Bestätigen Sie Synchronisierung Effizienz mithilfe von Zellzyklus Marker (Cyclin A2 und B1 für S/G2 und G2, beziehungsweise), S/G2 phasenspezifische DNA-Schäden reparieren Faktoren (z.B., Rad51 oder Cohesin), oder durch IdU/EdU Eingliederung (für S Phase Zellen)51.
  2. G1-Phase-Synchronisation
    1. Samen 6-8 x 104 HeLa-Zellen in der Kulturschale 35 mm mit gerasterten Deckglas (Schritt 2.1).
    2. Nach 2 Tagen Metaphase Zellen, die leicht angehoben und rundes, unter einem inversen Mikroskop mit 10 X-Objektiv und 10 X Okularen Linsen sind zu identifizieren. Erwerben Sie die Bilder, um die Position der Metaphase Zellen auf die gerasterten Deckglas aufzeichnen.
    3. Bestätigen Sie nach ca. 3-4 h Zellteilung in zwei Tochterzellen (in G1-Phase) und induzieren Sie DNA-Schäden (Abschnitt 4) zu.

4. Titration des Lasers Eingangsleistung

Hinweis: In diesem Protokoll induzieren wir DNA-Schäden mit einem 780 nm gepulsten fs NIR Lasersystem angeschlossen, um ein confocal Mikroskop oder ein 800 nm gepulsten fs NIR Laser gekoppelt an ein umgekehrtes Epi-Fluoreszenz-Mikroskop. Obwohl Eingangsleistung (tatsächliche Bestrahlungsstärke im Brennpunkt Laser in der Probe) benötigt, um vergleichbare DDR induzieren in diesen Systemen unterscheidet, ist das Grundprinzip der Eingangsleistung Titration gilt für beide, oder überhaupt, NIR-Systeme32,57 . Die in Situ -Energie pro Laser Puls und Peak Bestrahlungsstärke im Brennpunkt für die zwei Laser-Systeme wurden in den Bereich von 5,33 × 10-2-4 × 10-1 nJ und 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, bzw.32.

  1. Schalten des NIR-Lasers und lassen das Lasersystem zum Aufwärmen für 1 h vor dem Gebrauch.
  2. Platzieren Sie ein Gericht aus Zellen auf einer beheizten (37 ° C) Bühne in einer Kammer, die CO2 (5 %) und Feuchte (100 %)-Steuerung ermöglicht.
    Hinweis: Wenn eine CO2 Kammer nicht verfügbar ist, verwenden Sie CO2-unabhängige Kulturmedien für bis zu 5-6 h. Wenn eine Heizstufe nicht verfügbar ist, halten Sie die Zellen unter dem Mikroskop für < 20 min und sofort in der Gewebekultur Inkubator mit der richtigen Temperatur, CO2und Feuchtigkeitskontrolle ersetzen. Diese Kulturbedingungen variieren je nach der spezifischen Zelltyp sowie den Organismus der Ableitung (z.B. Säugetiere im Vergleich zu Amphibien) verwendet.
  3. Live Zellanalyse Eindringmittel tagged Proteine wählen Sie für ein GLP-Filter (450-490 nm Anregung, 515-586 nm Emission) oder Cy3 Filter (540-552 nm Anregung, > 590 nm Emission) für GLP oder mCherry verschmolzen Protein bzw. mit einem 100 X oder 63 X Ölimmersion Ziel.
  4. Suche nach Zellen, die vergleichbare Fluoreszenz Signale, vergleichbaren Niveau der Proteinexpression reflektiert haben. Vermeiden Sie Zellen, die zu schwach oder zu stark Ausdruck um Zell-Zell-Variabilität in der Fluoreszenz-Messungen zu verringern.
  5. Titrieren Sie die Laser-Eingangsleistung.
    1. 780 nm NIR Laser angebracht zu einem konfokalen Mikroskop
      1. Die Software-Bleichmittel-Funktion verwenden, um lineare Spuren im Inneren des Zellkerns für die Exposition gegenüber einzelnen Laserscans (Auflösung 512 x 512 Pixel, Zoom X1, gebleicht Region 50 x 4 Pixel, 12,8 µs Pixel Verweilzeit, Iteration X1) durch das Öl-Ziel als Ziel (100 X / 1,3 NA).
      2. Passen Sie den Laser-Übertragung-Prozentsatz (unter Verwendung der Software/Hardware in der Laser-Mikroskop-System vom Hersteller eingebaut) auf 5 % ohne andere Einstellungen zu ändern.
      3. Legen Sie eine Zelle in der Mitte des Feldes. Klicken Sie auf die Region of Interest (ROI) Werkzeug, und zeichnen Sie einer Linie oder Feld (ca. 50 x 4 Pixel) im Zellkern mit der Maus, und klicken Sie "Bleach" DNA-Schäden verursachen.
        Hinweis: Im anschließenden Bestrahlung Schritte "bleichen" sollte erhöht werden in Schritten von 5 % auf 40 % oder bis zu 100 % bei Bedarf.
      4. 800 nm NIR Laser angebracht an Epi-Fluoreszenz-Mikroskop
      5. Eingangsleistung durch Steuern ein (63 X / 1.4 NA) Phase Kontrast Öl eintauchen Ziel durch motorisierte Drehung eines Polarisationsfilters im Strahlengang eingeführt und montiert auf einer Computer-gesteuerten motorisierten Rotations Bühne32,39 , 58.
      6. Stellen Sie den Polarisator Winkel (°) und Messen Sie die Eingangsleistung (mW) in das Mikroskop mit einem Laser-Leistungsmesser. Bestimmen Sie die Polarisator Winkeln, die Eingabe Befugnisse dieses Bereichs von 20 mW-155 mW bei 5-10-mW-Schritten bereitstellen.
      7. Legen Sie den Polarisator-Winkel, der entspricht bis 20 mW Eingangsleistung.
        Hinweis: Für unsere Laser-System, wenn der Polarisator Winkel 40°, die Eingangsleistung ist 65 mW. Eingangsleistung mit 5-10-mW-Schritten zu erhöhen.
  6. Live Zellanalyse gehen Sie zu Schritt 6.1 und 6.3. Immunfluoreszenz-Erkennung des endogenen Proteinen oder Modifikationen fahren Sie mit Abschnitt 5. Gehen Sie nach der Analyse zu Schritt 4.7 für weitere Titration der Laserleistung. Um die vorgelagerten Faktor-Anforderung zu analysieren, gehen Sie zu Abschnitt 7.
    Hinweis: Einstellung von BER und NHEJ Faktoren ist schnell (innerhalb von ein paar Minuten) und Transient (< ~ 30 min - 1 h je nach Faktor und < ~ 4 h Post beschädigen Induktion, beziehungsweise). Im Gegensatz dazu, die Rekrutierung von HR Faktoren Rad51 und Cohesin nachweisbar bei ~ 30 min - 1 h und sie neigen dazu, mehr als 8 h bei unrepaired DNA-Läsionen44,50,51bestehen. Daher ist es notwendig, andere Zeit untersuchen, die Punkte Bestrahlung für verschiedene Reparatur Faktoren post.
  7. Erhöhen Sie Eingangsleistung von gewünschten Schritten (d.h.5 % für 780 NIR-Laser und 5 bis 10 mW für 800 NIR) wie in Schritt 4.4 zu, und wiederholen Sie die Schritte 4.5-4.7 an einem neuen Satz von Zellen zu bestimmen, die Schwelle (50 % der geschädigten Zellen zeigen Rekrutierung) und Spitze (100 % der Zellen zeigen Rekrutierung) für jedes Protein.

5. Immunfluoreszenz-Färbung

Hinweis: für die Erkennung von Protein kovalente Modifikation, wie PAR (komplexe Schäden Marker) und H2AX Phosphorylierung (γH2AX) (DSB-Marker), sowie Cyclobutan Pyrimidine Dimer (CPD)/(6-4) Photoproducts (6-4PP) und 8-Oxoguanine (8-OxoG) (Vernetzung und dem Boden Schaden Marker, beziehungsweise), Zellen fixiert und mit spezifischen Antikörpern gefärbt werden müssen. Darüber hinaus empfiehlt es sich, die Ergebnisse mit den Eindringmittel tagged rekombinanten Proteinen durch Antikörpernachweis der körpereigene Proteine, induziert durch Überexpression von rekombinanten Fusionsproteinen Artefakte zu unterscheiden bestätigen.

  1. Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Schaden Induktion (Schritt 4.5) abhängig von den Faktoren zu beheben, indem die Nährmedien (siehe Punkt 1.1) mit 1,5 mL 4 % Paraformaldehyd/1 X PBS für 10 min bei RT
    Achtung: Paraformaldehyd Dämpfe sind giftig und alle Arbeit sollte in einem gelüfteten Abzug erfolgen.
  2. Entfernen Sie 4 % Paraformaldehyd/PBS zu und fügen Sie 1 mL 0,5 % Waschmittel/PBS für 10 min bei RT
  3. 0,5 % Waschmittel/PBS und spülen Sie Zellen mit 2 mL PBS für 5 min zweimal zu entfernen, und inkubieren Sie Zellen in 2 mL Lösung zu blockieren (10 % Kälberserum, 1 % BSA/PBS) für 1 h bei RT
  4. Blockierende Lösung entfernen und 2 mL PBS auf Zellen, und ersetzen PBS mit 250 µL Primärantikörper Lösung von 3 % BSA/PBS über Nacht bei 4 ° C oder 1 h bei RT. Benutzung eine 1: 200-1: 500 Verdünnung (typische Konzentration ca. 1 µg/mL, empirisch bestimmt) Antikörper spezifisch für verschiedene DNA-Schaden-Marker (z. B.γH2AX/53BP1 (DSB); Ku (DSB, NHEJ); Rad51/Cohesin (DSB, HR); CPD/6-4PP (Vernetzung Schaden); 8-OxoG/DNA-Glycosylases (z.B.NTH1) (Basis Schaden); PAR (hochdosierte komplexe Schäden)).
  5. Die Antikörperlösung entfernen und Spülen mit 2 mL PBS für 5 min zweimal entfernen PBS und inkubieren Sie mit 250 µL 0.1 % Sekundärantikörper in 3 % BSA/PBS für 1 h im Dunkeln bei RT
  6. Entfernen Sie die sekundäre Antikörper-Lösung und fügen Sie 2 mL PBS für 5 min zweimal hinzu und Zellen in 1,5-2 mL PBS bei 4 ° C für die Bildgebung in Schritten 6.1 und 6.2.

(6) quantitative Fluoreszenzanalyse Immunostained oder lebende Zellen

  1. Aufnahmen von gefärbten oder live-Zellen (n > 10) Mikroskop zur Bestrahlung verwendet. Verwenden Sie für die Epi-Fluoreszenz-Mikroskop-System die Auflösung von 1.344 x 1.024 Pixeln und speichern Sie Bilder als TIFF 16-Bit-Dateien. Verwenden Sie für ein confocal Mikroskop 1 X Vergrößerung; Argonlaser für GLP/FITC, 594 HeNe-Laser für Cy3/mCherry; 512 x 512 oder 1.024 x 1.024 Pixel Bildauflösung; Scan-Geschwindigkeit 5, Anzahl: 1 für quick-Scan oder 2 + für die Mittelung über Mehrfachscans, Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
  2. Verwenden Sie eine Bildanalyse Programme entwickelt, um Pixel-Intensität zu messen.
    1. Verwenden Sie die Volumen-Rechteck-Werkzeug einen ROI auf dem Gelände der Schäden in der einzelnen Zelle Bild zu zeichnen. Verwenden Sie die gleiche Größe ROI um Fluoreszenz Hintergrundsignal neben Nukleoplasma, aber nicht überlappend mit den Schaden-Websites zu messen. Dies ist wichtig für die Normalisierung der Immunofluoreszenz nicht confocal Mikroskop-System zugeordnet.
    2. Zur Messung der Fluoreszenz-Signale mit dem Bild-Analyse-Programm, klicken Sie auf "Volume-Analysebericht" fand in der Tool-Box. Ein neues Fenster wird angezeigt. Überprüfen Sie im Abschnitt "Datenanzeige" nur die Felder "Name" und "Dichte". Klicken Sie auf "Fertig", um die Messungen zu visualisieren.
    3. Exportieren Sie die Werte in ein Tabellenkalkulations-Programm, indem Sie auf die Tabellensymbol am unteren Rand der Mengenbericht für Fenster und wählen Sie "Tabs (excel-Format)" als Feldtrennzeichen und "Akte" für Export Destination.
    4. Um relative Signale zu erhalten, verwenden Sie das Tabellenkalkulationsprogramm der Fluoreszenzintensität am Standort (Spalte 1) Beschädigung von Teilen, die im Steuerelement Hintergrund Region (Spalte 2) in das Nukleoplasma und Subtrahieren von 1 für die Normalisierung.
  3. Echtzeit-quantitative Zeitverlauf Fluoreszenzanalyse das konfokale Mikroskop
    1. Eindringmittel tagged Protein-positiven Zellen mit dem Mikroskop wie in Schritt 4.3 zu identifizieren.
    2. Führen Sie Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung vor Schaden und zu verschiedenen Zeitpunkten nach Schaden Induktion in Abschnitt 4. Zuerst zeichnen Sie das Bleichmittel ROI (für Schäden Induktion), und wählen Sie dann die "Acquire > Time Series" Untermenü, setzen Sie "" 20, sowie die "Durchlaufverzögerung" als 30 s, wählen Sie "bleichen einmal nach dem ersten Scan", und klicken Sie dann auf "start B". In diesem Fall wird das erste Bild unmittelbar vor dem Schaden Induktion, gefolgt von 19 Bild Akquisitionen in 30 s Intervallen erworben. Abständen ("Durchlaufverzögerung") können je nach Zweck der Studie geändert werden.
    3. Sobald Bildaufnahme abgeschlossen ist, klicken Sie auf "Meine", und zeichnen Sie den ROI in der Schaden-Region. Klicken Sie auf "Show Table", um eine Tabelle mit der Intensität innerhalb der ausgewählten ROIs zu erhalten. Normalisieren der Daten durch die Aufteilung der Fluoreszenzintensität des Standortes Schaden zu verschiedenen Zeitpunkten durch die Intensität der gleichen Region vor Schäden und Subtrahieren von 1.

7. kleine störende RNA (SiRNA) Transfection

Hinweis: Erschöpfung des Zielproteins ist ein effektiver Weg, die vorgelagerten Faktor-Anforderung für die beobachteten Protein-Einstellung zu Websites (Abschnitt 4) Schäden abzugrenzen. Darüber hinaus die Strategie ist der beste Weg an die Spezifität des Antikörpers für die Immunfluoreszenz-Erkennung eingesetzt (siehe Abschnitt 5).

  1. Tag 1: Bereiten Sie 2 Brunnen von HeLa-Zellen in einer 24-Well-Platte durch Aussaat 6-8 x 104 HeLa-Zellen in 0,5 mL Kulturmedien in jede Vertiefung zur Kontrolle SiRNA Transfektion und PARP1 SiRNA (5'-CCG AGA AAT CTC TTA CCT CAA-3').
  2. Tag 2: Bestätigen Sie, dass Zellen etwa 40-50 % Zusammenfluss sind. Führen Sie die erste Runde der SiRNA Transfection: Verdünnen Sie 5 Pmol SiRNA in 25 µL Serum-freie Kultur, Medien, hinzufügen 3 µL Lipide basierend Transfection Reagens in das Rohr vorsichtig mischen und ca. 5-10 min bei RT inkubieren
  3. Spülen Sie die Zellen mit 0,5 mL frische Kultur Medien einmal, und halten Sie die Zellen in 0,5 mL frische Kulturmedien (siehe Punkt 1.1).
  4. Die Zellen der RNA-Lipid komplexe hinzu, und mischen Sie leicht durch die Schüssel hin und her kippen. Setzen Sie die Zellen wieder in den Inkubator wie in Schritt 2.1.
  5. Aspirieren Sie den Transfektion Mix, und fügen Sie 0,5 mL frische Nährmedien (Schritt 1.1) nach 6 h.
  6. Tag 3: Führen Sie die zweite Runde der SiRNA Transfektionen (siehe Punkt 7.2). Dann Samen Sie 60-100 % der Zellen in einen 35 mm gerasterten Deckglas Teller, wie unter Punkt 2.3 beschrieben.
  7. 5. Tag: Fahren Sie mit Laser Microirradiation mit den optimalen Laser macht Zustand für die maximale Einstellung des Faktors von Interesse, wie durch Abschnitt 4 bestimmt. Effizienten Abbau kann in der Regel bei ca. 60-90 % der HeLa-Zellen beobachtet werden.
    Hinweis: Als Alternative und ergänzende Ansatz, Inhibitoren, falls vorhanden, lässt sich die Funktion des Faktors Interesse32,44hemmen. Für die Analyse der Wirkung der Hemmung der DDR-Signalisierung, 20 µM PARP-Inhibitor, 1 µM PAR Glycohydrolase (PARG) Hemmer oder hinzufügen 10 µM DNA-abhängigen Proteinkinase mit katalytischen Untereinheit (DNA-PKcs)-Inhibitor und 10 µM-ATM-Inhibitor in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) der 1 h vor Schäden Induktion Gerichte. Hinzu kommt DMSO nur Kontrollzellen.

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Ergebnisse

Mit PtK2 Zellen EGFP-53BP11220-1711 oder TRF2-YFP stabil zum Ausdruck zu bringen, wurde Laser Eingangsleistung Titration durchgeführt, um die optimale Voraussetzung für ihre Rekrutierung (Abbildung 1)32bestimmen.

Bei hohen Input-Power-Laser Schaden die erhebliche Bündelung von CPD (Vernetzung Schäden durch ultraviolette (UV) Schäden in der Regel generiert) sowie GLP-NTH1 DNA-Glycosylase, die speziell der Grundschaden erkennt wurd...

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Diskussion

Die Vorteile der Verwendung von Laser Microirradiation für die DDR-Forschung sind:

(1) Es ist möglich, verschiedene Arten induzieren Mengen DNA Beschädigung von einfachen Strangbrüche komplexe DNA-Schäden und zur Erkennung verschiedene Reparatur Faktoren bei der DNA-Schäden Websites durch Anpassung der Laser-Bestrahlung-Parameter. Es ist auch möglich, mehrere Male in den gleichen Zellkern schädigen um Trans -Effekte (siehe Abbildung 3) zu bewerten.

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken Dr. Akira Yasui in Tohoku University, Japan für das GFP-NTH1-Expressionsplasmid und Dr. Eros Lazzerini Denchi am Scripps Research Institute, La Jolla, Kalifornien für TRF2-YFP und EGFP-53BP11220-1711 Ausdruck Plasmide. Diese Arbeit wurde von der Air Force Office of Scientific Research (FA9550-04-1-0101) und der Beckman Laser Institute Inc. Foundation (M.W.B), der Ford Foundation Fellowship von der nationalen Akademie der Wissenschaften (für B.A.S) und NSF MCB-1615701 und CRCC unterstützt CRR-17-426665 (zu K. J.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ti:Saphir NIR gepulster Femtosekundenlaser Mira-900Coherent Inc.Mira 900
Inverses Mikroskop Carl ZeissAxiovert 200M
63X/1.4 NA ObjektivZeissAPOCHROMAT Ph3 
Kompakter Rotationstisch Newport CorpPR50PP
TemperaturreglerWarnerTC-344B
HeizungssystemIbidi 10918
Gas-InkubationssystemIbidi 11920
Laserleistungs- und Energiemessgerät (RoHS)CoherentFieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digitale CCD-KameraHamamatsuC10600
LSM 510 META Laser-Scanning-MikroskopeCarl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APOCarl Zeiss
35mm Gitterschalen MatTekP35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 NierenepithelzellenATCCCCL 56 
HeLa-ZellenATCCCCL-2
DMEMLife Technologies11885-092
CO2-unabhängiges MediumLife Technologies18045-088
Fortgeschrittene MEM Life Technologies12492-013ergänzt mit L-Glutamin, 4% FBS
Penicillin/StreptomycinFisher Scientific15140122
L-GlutaminFisher Scientific25030081
FBSOmega ScientificFB-02
Thymidin   SIGMAT9250
Serum ohne Medien        (Opti-MEM I Reduziertes Serummedium)Fisher Scientific11058021
Anti-Cycolbutance Pyrimidin-Dimer (CPD) (Maus)Kamiya Biomedical CompanyMC-062
Anti-XRCC1 (Maus)Gene Tex IncGTX72311
Anti-53BP1 (Kaninchen)Santa Cruz Biotechsc-22760
Anti-CtIP (Kaninchen)Abcamab70163
Anti-PAR-Polymere (Maus)Enzo Life SciencesBML-SA216-0100
Anti-PAR (Kaninchen)Trevigen4336-BPC-100
Anti-TRF2 (Maus)Novus Biological NB100-56506
Anti 6-4PP (Maus)Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Kaninchen)                                        (für die Kohäsin-Detektion)erzeugt im Yokomori (KY) Labor
Anti-Rad51 (Kaninchen)Santa Cruz BiotechnologySC-8349
Anti-Ku70 (Maus)&nbsp; Novus BiologicalsNB100-102
8-Oxiguanin Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Kaninchen)                                       generiert im KY-Laborref 43
  Anti-hCAPG (Kaninchen)                                      (für die Kondensatdetektion)generiert in KY labref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc711-165-152
Esel Anti-Maus Alexa Fluor 488 IgGThermo Fisher ScientificA-21202
HiPerFect siRNA TransfektionsreagenzQiagen301705
Lipofectamine 2000 TransfektionsreagenzThermo Fisher Scientific11668019
GFP-SMC1 stabile Zelllinie      generiert in KY labref 49 
GFP-NEIL2 stabile Zellliniedie im KY-Laborref 54
GFP-NTH1 erzeugt wurde, GFP-NTH1 stabile Zelllinieim KY-Laborref 32
GFP-SMC1 Plasmiderzeugt im KY-Labor
GFP-Ku Plasmiderzeugt im KY-Labor
Anti-MDC1 (Kaninchen)  Novus BiologicalsNB100– 395
Anti-gH2AX (Kaninchen)  Millipore07– 164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2-stabile Zelllinieerzeugt im Berner Laborref 32
TRF2-YFP PtK2 stabile Zelllinieerzeugt in Berns labref 32
DMSOSigmaD2650-100ML
PANG-InhibitorTrevigen4680-096-03
DNA– PKcs-Hemmer  NU7026 SigmaN1537
ATM-Inhibitor KU55933  Calbiochem118500
Olaparib Apexbio TechnologyA4154
Paraformaldehyd ELEKTRONENMIKROSKOPIE SCIENC MS100503-916 (EA)
Menge Eins 1D-Analysesoftware Version 4.6.9Bio-RadSOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC Bildanalyse-Programm
ExcelMicrosoftTabellenkalkulationsprogramm
Triton X100Fisher ScientificBP151-500Waschmittel
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) 10X ohne Calcium und MagnesiumFisherScientific 14200166auf 1X verdünnen;
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