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Methodenartikel

Snap Chip für Cross-reactivity frei und Spotter Multiplex Sandwich Immunoassays

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DOI:

10.3791/56230

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13. November 2017

 ,  ,  , 
1McGill University and Génome Québec Innovation Centre, 2Biomedical Engineering Department, McGill University, 3Parallex BioAssays Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir zeigen eine Snap-Chip-Technologie für die Durchführung von cross-reactivity-freie gemultiplexten Sandwich Immunoassays durch Einrasten einfach zwei Folien. Ein Snap-Apparat dient zur Übertragung von zuverlässig Reagenzien von Microarray-Microarray. Die Snap-Chip kann für jede biochemischen Reaktionen erfordern NS1 der verschiedenen Reagenzien ohne Cross-Kontamination verwendet werden.

Zusammenfassung

Multiplex Protein-Analyse ergab höhere diagnostische Sensitivität und Genauigkeit im Vergleich zu einzelnen Proteine. AntikörperMicroarrays erlauben Tausende Mikromaßstab Immunoassays gleichzeitig auf einem einzigen Chip durchgeführt. Sandwich-Assay-Format Spezifität des Assays erkennt jedes Ziel mit zwei Antikörper verbessert, sondern Kreuzreaktivität zwischen Reagenzien, wodurch ihre multiplexing Fähigkeiten leidet. Antikörper NS1 Microarray (ACM) für cross-reactivity-freie gemultiplexten Proteindetektion entwickelt wurde, aber erfordert eine teure vor-Ort-Spotter für Microarray Herstellung während der Tests. In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen eine Snap-Chip-Technologie, die Reagenz von Microarray-Microarray überträgt, indem einfach schnappen zwei Chips zusammen, somit kein Spotter während der Inkubation der Probe und Nachanmeldung Erkennung Antikörper (Tupfer) auf benötigt wird Lagerung von Pre-gefleckte Folien, Wehre die Folie Vorbereitung von Assay Ausführung. Sowohl Einzel- und Doppelzimmer Transfermethoden werden vorgestellt, um genaue Ausrichtung zwischen den beiden Microarrays zu erreichen und die Herstellung der Folie für beide Methoden werden beschrieben. Ergebnisse zeigen, dass < mit doppelten Transfer erreichen eine Array-Dichte von 625 Punkte/cm240 μm Ausrichtung erreicht wurde. Ein 50-Plexed-Immunoassay wurde durchgeführt, um die Nutzbarkeit des Snap-Chips in Multiplex Protein-Analyse zu demonstrieren. Nachweisgrenzen von 35 Proteine befinden sich in der Reichweite des Pg/mL.

Einleitung

Eine Jury bestehend aus mehreren Proteinen Biomarker können höhere Sensitivität und Spezifität als einen einzigen Biomarker in der Diagnostik von komplexen Krankheiten wie Krebs1,2. Die Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) wurde der Goldstandard Technik in klinischen Labors erreichen maximal Erkennung bei niedrigen Pg/mL im Plasma, aber Grenzen auf ein Ziel pro Assay3,4,5. AntikörperMicroarrays sind entwickelt worden, denn Platz für Tausende von miniaturisierten Assays parallel auf einem einzigen Mikroskop Folie6,7,8durchgeführt. Jedoch die multiplexing Fähigkeit dieser Methode wird durch Reagenz-driven Kreuzreaktivität, die aus der Anwendung eines Gemisches aus Spitzen, begrenzt und wird es schwieriger mit einer wachsenden Zahl von Zielen9,10 , 11. Pla Et Al. haben erklärt, dass die resultierende Anfälligkeit eines Multiplex-Sandwich-Assays als 4N(N-1) Schuppen wo N ist die Anzahl der Ziele12.

Um Kreuzreaktivität in AntikörperMicroarrays, Antikörper NS1 Microarray zu mildern wurde in unserem Labor für Multiplex-Sandwich Assay12(ACM) entwickelt. Capture-Antikörper (Kabinen) sind auf einem Substrat mit einem Microarray-Spotter gesichtet. Nach Sperre Proben sind auf der Oberfläche aufgetragen, und dann einzelne Pinselstriche werden an den gleichen Stellen mit dem cAb-Antigen-Komplex gesichtet. Alle Szenarien der Kreuzreaktivität zwischen Antikörpern und Antigenen mit ACM abgeschwächt werden können, und Nachweisgrenzen bei Pg/mL erreicht wurden. Allerdings erfordert der Assay-Protokoll vorbereiten und Schmierblutungen die Pinselstriche während der Experimente mit einer vor-Ort-Microarray-Spotter mit hoher Präzision zwecks Ausrichtung, die teuer und zeitaufwendig ist, begrenzt die breite Anwendung dieser Technologie in anderen Labors. Ein handheld ACM, benannt Snap-Chip wurde entwickelt für cross-reactivity-frei und Spotter-freie multiplex-Sandwich Immunoassays13,14,15. Kabinen und tupft sind bereits gesichtet auf ein Assay und ein Transfer-Folie bzw. im Microarray-Format gespeichert. Während der Test die Folien abgerufen werden und ein Microarray tupft sind gemeinsam auf der Assay-Folie durch einfach fangen die beiden Chips zusammen übertragen. Ein Snap-Apparat ist für zuverlässige Reagenz Übertragung verwendet. Nitrozellulose, beschichtete Folien mit einer relativ hohen Antikörper-Bindungskapazität als der Assay-Folien verwendet wurden, um die Flüssigkeitströpfchen absorbieren und somit Reagenz Transfer erleichtert, die Folien sind jedoch teurer als normales Glas Folien und microarray Scannern kompatibel mit nicht-transparenten Folien sind für die Signalerfassung notwendig.

In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen das Protokoll für die Durchführung einer Multiplex-Sandwich-Immunoassay mit einem Snap-Chip. Für bequeme und sichere Reagenz Übertragung von Microarray-Microarray wurde eine neuartige Snap-Apparat entwickelt. Wichtig ist, haben wir hier die Übertragungsmethode Reagenz auf regelmäßiges Glas-Objektträger mit dem Snap-Chip etabliert. 1024 Punkte wurden erfolgreich übertragen und auf einen Objektträger, erheblich erweitern den Einsatz dieser Technologie in den meisten Labors ausgerichtet.

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Protokoll

1. Herstellung und Lagerung von snap Chips

  1. einzelne Übertragungsmethode ( Abbildung 1a)
    1. Spot Kabine Lösungen enthält 400 µg/mL Antikörper und 20 % Glycerin in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf eine Nitrocellulose (oder einem funktionalisierten Glas) Assay-Folie mit einem Inkjet-Microarray Spotter 13 bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % (1.2 nL für jeden Fleck) mit 800 µm-Mitte-zu-Mitte-Abstand. Sicherstellen, dass die Folie auf die Spotter-Deck nach einer Ecke fest (hier links unten verwendet wurde).
    2. Die gefleckte Assay-Folie bei Raumtemperatur 1 h mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % inkubieren.
    3. Klemmen eine Folie Modul Dichtung mit 16 Fächern auf der Assay-Folie in 16 Vertiefungen unterteilen. Spülen Sie die Folie dreimal durch Zugabe von 80 µL PBS mit 0,1 % Tween-20 (PBST) in jeweils gut und schütteln bei 450 u/min auf einen Shaker, 5 min jedes Mal.
    4. Hinzufügen 80 µL blockiert Lösungen für jedes gut und schütteln für 1 h bei 450 u/min.
    5. Entfernen Sie die Dichtung und die Assay-Folie mit einem Strom von Stickstoff trocknen.
    6. Fix eine Transfer-Folie auf dem Spotter-Deck und drücken die unteren linken Ecke der Folie gegen links unten auf dem Spotter-Deck. Inkjet vor Ort eine Reihe von Ausrichtungsmarken (eine Lösung von Polystyrol-Mikro-Kügelchen) mit dem gleichen Layout wie die für die Fahrerhäuser.
    7. Lassen die Ausrichtungsmarken trocknen. Drehen Sie die Transfer-Folie und setzen Sie ihn wieder auf die Spotter-Deck, Befestigung gegen die untere linke Ecke.
    8. Bereiten die dAb Schmierblutungen Lösungen mit 20 µg/mL Antikörper, 20 % Glycerin und 1 % BSA.
    9. Mit dem Spotter ' s Kamera, nehmen Sie ein Bild einer Ausrichtung-Marke. Setzen Sie dieses Bild in das spotting Programm als eine so und bekommen Sie das Bildsystem für die Anerkennung von Inkjet-Spotter, die am obere linken Marke zu identifizieren. Verwenden Sie die Koordinate als den ersten Platz des dAb-Arrays. Platz 8 nL pro Tröpfchen mit einem Abstand von Mitte zu Mitte von 800 µm.
  2. Double Übertragungsmethode ( Abbildung 1 b)
    1. eine Transfer-Folie 1 auf dem Inkjet-Spotter-Deck gegen die untere linke Ecke zu platzieren. Vor Ort Taxis Lösungen mit 400 µg/mL Antikörper, 20 % Glycerin und 1 % BSA mit PBS-Puffer auf der Folie mit einem Inkjet-Microarray-Spotter bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % (0,4 nL für jeden Fleck und ~ 200 µm im Durchmesser). Der Abstand von Mitte zu Mitte beträgt 400 µm.
    2. Snap der Transfer Folie mit einem Nitrozellulose beschichtet (oder einer funktionalisierten Glas) Assay Folie mit einem Snap-Apparat ( Abbildung 2), die Kabine Tröpfchen auf der Assay-Folie übertragen.
      1. Wende alle sechs Tasten auf der Seite der Snap-Apparat um 90 Grad zu ziehen und die Kolben in der geöffneten Position verriegeln. Einfügen Sie die Transfer-Folie in den Diahalter in die Buchse mit der abgeschnittenen Ecke mit Blick auf die feste Pogo pin Schalten Sie den ersten Satz von drei Tasten lassen Sie die Kolben mit der goldenen Pogo Pin und sicherstellen, dass die Folien sind gegen die Passstifte geschoben.
      2. Fügen Sie eine Nitrozellulose-beschichtete Folie in der Snap Apparat Upside-Down-auf die 4 Pogo Pins sitzen. Biegen Sie die zweite Gruppe von drei Tasten loslassen Kolben mit dem Silber-Pin und sicherstellen, dass die Folien sind gegen die Passstifte geschoben.
      3. Das Snap-Gerät schließen, indem man die Oberschale auf den Diahalter mit der Ausrichtung Säulen und Löcher für eine präzise Positionierung.
      4. Legen Sie den geschlossenen Snap-Apparat in seinem Käfig und die Registerkarte "Schließung" vollständig nach unten drücken um die Microarrays von Angesicht zu Angesicht beim Anwenden der entsprechenden Drucks zu bringen. Für 1 Minute geschlossen halten,
    3. Die Folien zu trennen. Die Assay-Folie bei Raumtemperatur 1 h mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % inkubieren. Waschen, blockieren und trocknen die Assay-Folie wie 1.1.3 - 1.1.5 beschrieben.
    4. Legen Sie einen anderen Transfer Folie auf dem Inkjet-Spotter Deck und drücken gegen die untere linke Ecke. Vor Ort dAb Lösungen mit 50 oder 100 µg/mL von Antikörpern (siehe Tabelle 1), 20 % Glycerin und 1 % BSA mit PBS-Puffer. Sicherzustellen, dass jeder einzelne Strahler 0,8 ist nL und der Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen den Spots beträgt 400 µm.
    5. Speichern der Assay und der Transfer-Folie. Versiegeln-Assay und Transfer Folien in einem luftdichten Beutel mit Trockenmittel und legte in einem Gefrierschrank-20 ° C.

2. Gemultiplext Immunoassays mit Snap-Chips

  1. Abrufen der Assay-Folie aus dem Gefrierfach. Lassen Sie den Beutel versiegelt für 30 min, bis die Folie auf Raumtemperatur kommt.
  2. Prepare 7-Punkt seriell verdünnt Beispiellösungen von Spick Proteine in PBS mit 0,05 % Tween-20.
    Hinweis: Hier wird ein 5-fold Verdünnungsfaktor verwendet. Die ab Konzentrationen für jedes Protein sind in Tabelle 1 aufgeführt.
  3. Vorbereiten Beispiellösungen je nach Bedarf. Z. B. Humanserum 4mal in PBST Puffer verdünnen.
  4. Eine 16-fach-Dichtung auf der Assay-Folie spannen.
  5. Füllen Sie eine Spalte von 8 Brunnen mit den 7 Proteinlösungen Verdünnung und eiweißfreie PBST Pufferlösung durch pipettieren. Pipette Beispiellösungen in die weiteren 8 Bohrungen auf derselben Folie.
    Hinweis: 80 µL Lösungen passen Sie in jedem gut. Weitere Folien können verwendet werden, um bei Bedarf zusätzliche Proben messen.
  6. Brüten die Proben auf einem Boston-Shaker mit 450 u/min für 1 h bei Raumtemperatur oder für eine Nacht bei 4 ° c waschen der Folie dreimal mit PBST auf den Shaker mit 450 u/min, 5 min jedes Mal. Entfernen Sie die Dichtung und trocknen Sie die Folie unter dem Strahl des Stickstoffgas.
  7. Abrufen die Transfer-Folie mit Tupfer aus der Tiefkühltruhe. Halten Sie den Beutel versiegelt für 30 min bei Raumtemperatur. Dann die Folie in einer geschlossenen Kammer (z.B. leere Tipps Box) mit 60 % Luftfeuchtigkeit Stabilisierung Perlen für 20 min für Rehydrierung inkubieren.
  8. Snap die Transfer-Folie mit der Assay-Folie mit einem Snap-Apparat ( Abbildung 2), die dAb-Tröpfchen übertragen. Siehe Abschnitt 1.2.2 für den Betrieb des Geräts Snap.
  9. Trennen die Folien. Die Assay-Folie in einer geschlossenen Kammer mit 60 % Luftfeuchtigkeit Stabilisierung Perlen für 1 h. Klemme der Assay-Folie mit einer 16-fach Dichtung brüten und spülen Sie die Folie 4 Mal mit PBST auf einem Boston-Shaker mit 450 u/min, 5 min jedes Mal.
  10. Pipette 80 µL Lösungen mit 2,5 µg/mL Streptavidin Fluorophor in PBS in jede Vertiefung. 20 min auf einen Shaker bei 450 u/min inkubieren.
  11. Der Folie 3 Mal mit PBST und einmal mit destilliertem Wasser auf den Shaker mit 450 u/min spülen. Entfernen Sie die Dichtung und trocknen Sie die Folie mit Stickstoffgas.

3. Dia scannen und Datenanalyse

  1. die Assay-Folie mit einem Fluoreszenz-Microarray-Scanner mit dem 635-nm-Laser scannen.
  2. Extrahieren die net Intensität von jedem Ort mit einer Analyse-Software (z.B. Array-Pro Analyzer) 16.
  3. Der Nachweisgrenze (LOD) jedes Proteins mit einer Statistiksoftware zu berechnen und die Proteinkonzentrationen in den Proben zu bestimmen.
    Hinweis: Die Detailgenauigkeit ist definiert als der Y-Achsenabschnitt der Norm cuRVE erhöht durch drei Mal die Standardabweichung von drei unabhängigen Assays.

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Ergebnisse

Das Testverfahren für Einzel- und Doppelzimmer Transfermethoden ist in Abbildung 1dargestellt. In einzelnen zu übertragen die Kabinen sind direkt auf der Folie Assay gesichtet und die Farbtupfer auf der Assay-Folie bei Verwendung in einem Spiegel-Muster der Kabinen (Abbildung 1a) übertragen. Nur ein Übertragungsverfahren ist erforderlich, aber diese Methode leidet Fluchtungsfehler zwischen den zwei Microarrays, hauptsächlich bedi...

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Diskussion

In dieser Arbeit haben wir eine Snap-Chip-Technologie vorgestellt, die cross-reactivity-freie Multiplex-Immunoassays für die Forscher mit einfachen Versuchsaufbau weithin verfügbar macht. Anders als bei bestehenden AntikörperMicroarrays, benötigt keine Microarray-Spotter für Endnutzer. Sowohl Einzel-als auch Doppelzimmer Transfermethoden demonstriert, und doppelte Übertragung bietet überlegene Ausrichtung Genauigkeit bis zu ~ 40 μm bei 98 % Flecken, mit die größten Fehlausrichtung von 63 µm14. Ein...

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Offenlegungen

McGill Universität hat einige Aspekte dieser Arbeit mit Huiyan Li und David Juncker als Erfinder eine Patentanmeldung eingereicht.

Danksagungen

Wir danken Dr. Rob Sladek für die Verwendung von Inkjet-Spotter. Wir anerkennen die letzte Unterstützung der kanadischen Institute für Gesundheit Forschung (CIHR), die Naturwissenschaft und Engineering Research Council of Canada (NSERC), die kanadische Krebs Gesellschaft Research Institute und Canada Foundation für Innovation (CFI). D.J. Dank Unterstützung von einem Canada Research Chair.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Phosphatgepufferte KochsalztabletteFisher Scientific5246501EA
Streptavidin-konjugiert Cy5Rocklands000-06
Tween-20Sigma-Aldrichp1379
RinderserumalbuminJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc001-000-162
GlycerinSigma-AldrichG5516
Blockierungslösung: BSA-freier Stabilisator Stabilisator StabilisatorSurModics, IncSG02
Nitrozellulose-beschichtete ObjektträgerGrace Bio-Laboratories, Inc305116
Aminosilan-beschichtete ObjektträgerSchott Nordamerika1064875
Snap DeviceParallex BioAssays Inc.PBA-SD01
Inkjet-Microarray-SpotterGeSiMNanoplotter 2.0
Dichtung des SchiebemodulsGrace Bio-Laboratories, Inc204862
FeuchtigkeitsstabilisierungsperlenParallex BioAssays Inc.PBA-HU60
Array-Pro Analyzer SoftwareMedien KybernetikVersion 4.5
Fluoreszenz-Microarray-ScannerAgilentSureScan Microarray-Scanner
Biostatistik-SoftwareGraphPad SoftwareGraphPad Prism 6
Endoglin-Einfang AntikörperR& D SystemsMAB10972
Endoglin-Proteinen D Systems1097-DE
Endoglin Nachweis AntikörperF& Technik D SystemsBAF1097
IL-6a (siehe Tabelle 1)F& D Systems
IL-6b (siehe Tabelle 1)Invitrogen
Forschung und Entwicklung von

Referenzen

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