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Methodenartikel

Visualisierung und Live Imaging Oligodendrozyt Organellen in organotypischen Gehirnscheiben mit Adeno-assoziierten Virus und konfokale Mikroskopie

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DOI:

10.3791/56237

⸱

23. Oktober 2017

 , 
1Division of Anatomy, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo, 2Department of Microbiology, Oslo University Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Myelinating Oligodendrozyten fördern schnelle Aktionspotential Ausbreitung und neuronale überleben. Hier beschriebene ist ein Protokoll für Oligodendrozyt-spezifischen Ausdruck der fluoreszierende Proteine in organotypischen Gehirnscheiben mit nachfolgenden Zeitraffer Bildgebung. Darüber hinaus wird ein einfaches Verfahren zur Visualisierung von ungefärbten Myelin vorgestellt.

Zusammenfassung

Nervenzellen setzen auf die elektrische Isolierung und trophischen Unterstützung der Myelinating Oligodendrozyten. Trotz der Bedeutung der Oligodendrozyten wurden die erweiterte Tools derzeit verwendet, um Neuronen, studieren nur teilweise getroffen auf Oligodendrozyt Forscher. Zelle typspezifische Färbung durch virale Transduktion ist ein sinnvoller Ansatz, live Organelle Dynamik zu studieren. Dieser Beitrag beschreibt ein Protokoll zur Visualisierung von Oligodendrozyt Mitochondrien in organotypischen Gehirnscheiben durch Transduktion mit Adeno-assoziierte Virus (AAV) mit Genen für mitochondriale gezielte fluoreszierende Proteine von transkriptionelle kontrolliert Das Myelin basic Protein Förderer. Freuen Sie sich auf das Protokoll zur Herstellung von organotypischen koronalen Maus Gehirnscheiben. Ein Verfahren für Zeitraffer-Aufnahmen von Mitochondrien dann folgt. Diese Methoden auf andere Organellen übertragen werden können und möglicherweise besonders hilfreich für das Studium Organellen in der Myelinscheide. Schließlich beschreiben wir eine leicht verfügbare Technik zur Visualisierung von ungefärbten Myelin in lebenden Scheiben durch Reflexion der konfokalen Mikroskopie (CoRe). Kern erfordert keine zusätzliche Ausrüstung und kann nützlich sein, um die Myelinscheide während der live-Aufnahme zu identifizieren.

Einleitung

Weißen Substanz des Gehirns besteht aus Nervenzellen Axone eingewickelt in Myelin, eine spezielle erweiterte Plasmamembran von Oligodendrozyten gebildet. Myelin ist für schnelle und zuverlässige Aktionspotential Ausbreitung und langfristiges Überleben der Markhaltige Axone erforderlich, und ein Verlust von Myelin kann neurologische Dysfunktion verursachen. Trotz ihrer großen Bedeutung sind die Eigenschaften von Oligodendrozyten weniger bekannte Neuronen und Astrozyten im Vergleich. Infolgedessen wurden weniger Werkzeuge für das Studium von Oligodendrozyten entwickelt.

Leben Sie Bildgebung von Zellorganellen, wie Mitochondrien, endoplasmatischen Retikulum (ER) oder verschiedene vesikuläre Strukturen, dynamische Veränderungen in der Organellen im Laufe der Zeit zu studieren nützlich sein können. Traditionell wurde Bildgebung der lebenden Oligodendrozyten in Monokulturen1,2durchgeführt. Jedoch Oligodendrozyten in Monokultur zeigen keine kompakte Myelin und organotypischen oder akuten Hirnschnitten, daher möglicherweise eine bessere Option bei der Lokalisierung und Bewegung der Organellen zu studieren. Lokalisierung von kleine Organellen und Proteinen in der Myelinscheide kann aufgrund der kurzen Entfernung zwischen Markhaltige Axon und die umgebenden Myelinscheide schwierig sein. So haben leichte mikroskopische Immunostaining Verfahren allein nicht die räumliche Auflösung zur Unterscheidung zwischen Organellen in der Myelinscheide und diejenigen in Markhaltige Axon. Dies kann durch virale Transduktion mit Genen für Organelle ausgerichtete fluoreszierende Proteine angetrieben von Zelle typspezifische Promotoren gelöst werden. Die Vorteile sind ein zellspezifische und spärlich Ausdruck, der genaue Beurteilung der Organelle Lokalisierung und Dynamik ermöglicht. Transgene Tiere können auch verwendet werden, um solch eine Organelle ausgerichtete zellspezifische Ausdruck3zu erreichen. Jedoch die Herstellung und Instandhaltung von transgenen Tieren ist teuer und bieten in der Regel nicht die spärlichen Ausdruck, der durch virale Methoden erreicht werden kann.

Die beschriebene Methode verwendet hier virale Transduktion von Oligodendrozyten mit mitochondrialen gezielt fluoreszierenden Proteinen (Dsred oder grün fluoreszierenden Proteins, GFP) angetrieben von Myelin basic Protein Promotor (MBP-Mito-Dsred oder MBP-Mito-GFP) zu visualisieren Oligodendrozyt Mitochondrien in organotypischen Hirnschnitten. Darüber hinaus wird Ausdruck einer anderen fluoreszierenden Proteins im Zytoplasma (GLP zusammen mit Mito-Dsred oder Tdtomato mit Mito-GFP verwendet) zur Visualisierung der Zellmorphologie, einschließlich der zytoplasmatischen Kompartimente der Myelinscheide ermöglichen. Das Protokoll enthält die Verfahren zur Herstellung von organotypischen Gehirnscheiben (eine modifizierte Version des Protokolls von De Simoni und Yu, 20064,5beschrieben). Dann beschreiben wir die Time-Lapse bildgebende Verfahren zur Untersuchung der mitochondrialen Bewegung. Dieses Verfahren nutzt eine aufrechte confocal Mikroskop mit einem kontinuierlichen Austausch von bildgebendes Medium, eine Einrichtung, die einfache Anwendung von Drogen oder anderen mittleren Änderungen während der Bildgebung ermöglicht. Die Time-Lapse bildgebende Verfahren kann auf jedem confocal Mikroskop mit einige zusätzliche Ausrüstung für die Aufrechterhaltung der lebenden Scheiben wie unten beschrieben durchgeführt werden. Das Protokoll enthält auch einige Tipps zur Optimierung der Bildgebung und Reduzierung Phototoxizität.

Zu guter Letzt bezeichnet man eine schnelle und einfache Möglichkeit, ungefärbten Myelin durch Reflexion der konfokalen Mikroskopie (CoRe) zu visualisieren. Dies ist nützlich, um die Myelinscheide während der live-Aufnahme zu identifizieren. In den letzten Jahren verschiedene Techniken wurden entwickelt um Bild Myelin ohne jede Färbung erforderlich, aber die meisten von Ihnen erfordern spezifische Ausstattung und Kompetenz6,7,8. Das hier beschriebene Verfahren verwendet die Reflexionseigenschaften der Myelinscheide und ist eine vereinfachte Single-Erregung Wellenlänge Version der spektrale Reflexion der konfokalen Mikroskopie (Partitur, in denen mehrere-Wellenlängen Laser werden kombiniert, um Myelin zu visualisieren) 9. Kern kann auf jede confocal Mikroskop, das 488 nm Laser und ein 470-500 nm Emission Bandpassfilter oder einen einstellbaren Emission Filter erfolgen.

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Protokoll

die hier beschriebenen Vorgänge von der norwegischen Tier Forschung Behörde genehmigt worden. Lieferanten und Bestellnummern für das Verbrauchsmaterial und andere erforderliche Ausrüstung gibt es in der Liste der Materialien am Ende des Dokuments.

1. Vorbereitung des organotypischen Scheiben

Hinweis: dieses Rezept nutzt zwei Maus-Welpen bei postnatalen Tag 7-9 (p7-9), die Ausbeute 24 organotypischen Scheiben aufgeteilt auf zwei sechs-Well Kultur Gerichte. Sofern nicht anders angegeben, alle Verfahren sollte in einem sterilen Abzug erfolgen und Nitril oder Latex-Handschuhe verwendet werden sollte. Nur Zelle Kultur Grade Zutaten verwendet werden sollten.

  1. Autoklaven Flaschen, Dissektion Werkzeuge (1 große Schere, 1 kleine Schere, 1 großen flachen Spatel, 1 kleine abgerundete und geschärften Spachtel und 1 Zange finden Sie unter Materialien Liste für Details), Glas, Pipetten, Pipettenspitzen und Gewebe Tücher für die Slice-Vorbereitung verwendet.
  2. Als die Hälfte der Glaspipetten mit der großen Öffnung verwendet werden sollte, brechen Sie das schmale Ende.
    1. Stift Partitur mit einer Diamant-Scriber (falls vorhanden) um die Pipette direkt unter dem Punkt, wo das Glas Verengung beginnt. Legen Sie das Spitze Ende der Pipette in ein Nitril-Handschuh oder ähnliches. Brechen Sie vorsichtig die Spitze durch Biegen der Pipette und schieben Sie es gegen eine Werkbank.
    2. Dann stumpf gebrochene Ende durch Reiben auf einem Stück Schleifpapier oder leicht auf dem Bunsenbrenner schmelzen. Die gebrochene Pipetten werden verwendet, um die geschnittenen Hirnschnitten mit gebrochenen Ende verwandelte sich in den Gummiball zu übertragen und die große offene Ende berühren die Lösung/Scheiben.
      Hinweis: Dies geschieht nicht in einem sterilen Haube und kann mehrere Tage im Voraus erfolgen.
  3. Kultur Gerichte zubereiten.
    Hinweis: Dies kann am Tag vor dem Aufschneiden oder mindestens 2 Stunden vor dem Aufschneiden erfolgen.
    1. Sterilisieren Polytetrafluorethylen (PTFE) Membranen (" Konfetti "). Verwenden Sie zwei sterile Pinzetten, um einzelnen Konfetti aus den umliegenden blauen Kunststoff-Teile zu entfernen und durch Eintauchen in eine Petrischale mit 96 % igem Ethanol (EtOH) zweimal zu sterilisieren. Legen Sie Konfetti flach in einer sterilen große Petrischale trocknen.
      Hinweis: Das Konfetti sind hydrophil PTFE-Membranen, die ähnlich wie die Membranen in der Kultur-Einsätze. Die Verwendung von Konfetti hilft dem live imaging, weil einzelne Scheiben leicht vom Einsatz im Mikroskop-Setup übertragen werden können durch das Konfetti mit der Pinzette anheben (siehe 4.8. für Details). Alternativ können die Gehirnscheiben ohne das Konfetti kultiviert werden (in der die Scheiben direkt an die Membran des Einsatzes Kultur zuordnen werden). In diesem Fall muss die Membran-Einlage mit einem Skalpell übertragen die Scheibe auf das Mikroskop Bad geschnitten werden.
    2. Fügen Sie 1 mL Kulturmedium (Rezept in Reagenzien ' Tabelle) zu jedem Bohrloch der sechs gut Kultur Gerichte.
    3. Ort eine Kultur legen Sie in jede Vertiefung mit sterilen Pinzette. Vermeiden Sie Luftblasen zwischen dem Einsatz und dem Kulturmedium.
      Hinweis: Um Geld und die Umwelt zu retten, ist es möglich, die Kultur-Einsätze wiederzuverwenden. Dies kann durch gründliches Spülen in destilliertem H 2 O (dH 2 O) gefolgt von Inkubation bei 70 % EtOH für mindestens 24 h bis Wiederverwendung. Bei der Vorbereitung für neue Kultur, die Einsätze in einer Zellplatte Kultur unter Ultraviolett (UV) Licht für 15-30 min. Trocknen
    4. Platz zwei (sterilisiert und trocken) Konfetti auf jedem der Kultur-Einsätze. Legen Sie das Konfetti in Richtung der Ränder der Einsätze zu minimal überlappen.
    5. Legen die Platten in der Zelle-Kultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO 2.
  4. Blase kalt Dissektion Medium (Rezept in Reagenzien ' Tabelle) mit Bioxide Gas (95 % O 2 /5%CO 2). Um die Lösung steril zu halten, schließen Sie den Schlauch von der Gasflasche auf eine sterile Spritze Filter (0,22 µm Porengröße).
    1. Paar das andere Ende der Spritze Filter in ein steriles Röhrchen mit einer sterilen Glaspipette verbunden. Legen Sie die Glaspipette in die Lösung, mit Parafilm decken Sie ab und schalten Sie das Gas. Halten Sie die Dissektion Medium auf Ice
  5. Bereich Dissektion/Schneiden vorbereiten.
    Hinweis: Im Idealfall sollte diese Prozedur in einem sterilen Abzug erfolgen. Wenn dies nicht möglich ist, kann der Vibratome auf einer Werkbank gelassen werden. In diesem Fall empfiehlt es sich, eine Haarmaske Net und Gesicht zu verwenden.
    1. Mit Hilfe einer einzelnen Kante Rasierklinge ein rechteckiges Stück (ca. 2 x 0,5 cm) Agarosegel Ausschneiden (Rezept in Reagenzien ' Tabelle) und dies auf die Bühne Vibratome kleben, so dass die lange Seite die Vibratome Klinge steht.
    2. Reinigen Sie alle Oberflächen und die Vibratome Teile mit 70 % EtOH und wischen mit autoklaviert Gewebe wischt.
      Hinweis: Es ist wichtig, dass alle Stücke, die in Kontakt mit dem Hirngewebe werden vollständig trocken sind, da EtOH die Zellen schädigen kann.
    3. Der Vibratome eine sterile Rasierklinge beimessen und Vibration-Prüfung durchführen, wenn der Vibratome diese Funktion hat.
    4. Ort autoklaviert Dissektion Werkzeuge in der Haube zusammen mit autoklaviert Gewebe wischt, vier kleine Petrischalen, eine Runde Kante Skalpell, 2 Glaspipetten mit Kautschuk-Lampen, zwei Open-End Glaspipetten (siehe Pkt. 1.1) und super Kleber (gespritzt mit EtOH).
    5. Pour sprudelte Dissektion Medium ins Boot Vibratome und in den vier kleinen Petrischalen.
      Hinweis: Dieser Schritt sollte nur erfolgen unmittelbar vor der Dissektion da Medium ab diesem Zeitpunkt ist nicht sprudelte oder auf Eis gehalten
  6. Dissect und Mount Gehirne.
    Hinweis: Um gesunde Scheiben zu erhalten, muss dieser Schritt schnell und präzise erfolgen. Etwas Übung ist erforderlich.
    1. Einschläfern Tier #1 durch Dislokation der Neckor nach lokalen Richtlinien und dann mit der großen Schere enthaupten.
    2. Mit kleinen, scharfen Schere, schnell die Haut entfernen, indem man einen sagittalen Schnitt vom Hals, die Nase und ziehen Sie zur Seite um den Schädel zu offenbaren.
      1. Schneiden Sie entlang die sagittale Naht, gefolgt von seitliche Einschnitte über den inneren Teil der Stirnbeine und die Lamboid Naht (die Grenze zwischen Großhirn und Kleinhirn).
      2. Benutze Zange offen biegen den Schädel auf jeder Seite. Die Hirnnerven werden vom Gehirn durch Einfügen einer runden, scharfen Spachtel unter der ventralen Seite des Gehirns und sanft bewegen den Spatel seitlich abgeschnitten.
    3. Eine einzelne Kante Rasierklinge verwenden, um einen koronalen rostral an das Kleinhirn Schneiden machen.
      Hinweis: Dieser Schnitt bestimmt den Winkel in dem die Scheiben geschnitten werden. Es sollte daher in einem geraden Winkel gemacht werden.
    4. Flip das Gehirn aus dem Schädel und in eine kleine Petrischale mit Dissektion Medium.
    5. Wiederholen Sie Schritte 1.6.1.-1.6.4. für Mensch und Tier #2 Ort dieses Gehirn in einen zweiten Petri dish.
      Hinweis: Die Tiere sind nicht steril. Führen Sie die Präparation auf der einen Seite der Haube und verschieben Sie dann auf der anderen, sauberen Seite, sobald die Gehirn aus dem Schädel entfernt wurden.
    6. Handschuhe ändern.
    7. Attach Gehirn Vibratome Bühne: Fügen Sie eine dünne Schicht von Superkleber auf die Bühne vor der montierten Agarosegel. Halten Sie Gehirn #1 mit einem großen flachen Spatel mit frisch geschnittenen (kaudalen) Seite berühren den Spachtel und der Bauchseite nach unten (und so nah wie möglich an) das Agarosegel.
      1. Dann legen Sie vorsichtig das Gehirn auf den Kleber durch Abstoßen der Spachtel mit einer Reihe von Zangen. Stellen Sie sicher, lassen ausreichend Platz für Gehirn #2.
        Hinweis: Es ist wichtig, dass die Gehirn gut auf die Bühne, aber ohne übermäßige Kleber befestigt sind, wie dies das Schneiden behindern kann.
    8. Sofort nach der Montage des Gehirns #1 Spatel die große fügen Sie einige Tropfen der Dissektion Medium auf das Gehirn. Dies wird das Gehirn feucht halten, härtet den Klebstoff und festhalten an den Seiten des Gehirns zu verhindern.
    9. Wiederholen Sie die Schritte 1.6.7 und 1.6.8. für Gehirn #2.
    10. Legen die Bühne auf dem Boot Vibratome.
  7. 230 µm dicken koronalen Scheiben schneiden mit einer Amplitude von 1-1,5 mm, einer Frequenz von 85 Hz und einer Geschwindigkeit von 0,2 mm/s. sammele Scheiben etwa zwischen 1,4 mm rostral und kaudalen, Bregma 2,1 mm.
    1. Sammeln Scheiben nach jede Scheibe geschnitten worden ist, durch den Einsatz von Open-End Glaspipetten (Pkt. 1.1). Übertragen Sie Scheiben auf einer Petrischale mit Dissektion Medium. Eine abgerundete Skalpell verwenden, um die Scheiben in zwei Stücke, die zwischen der beiden Hemisphären geschnitten.
  8. Wenn die Scheiben geschnitten werden, legen Sie Scheiben in die Kultur Gerichte.
    1. Der Kulturschale (man damals) aus dem Inkubator nehmen.
    2. Mit Open-End Glaspipetten, sorgfältig eine Scheibe zu jedem der das Konfetti übertragen.
      Hinweis: Die Scheiben sollten flach in der Mitte das Konfetti liegen. Dies erfordert etwas Geschick. Jedoch, wenn einige Scheiben nicht perfekt sind, ist es besser, sie zu verlassen, als zu verbringen Zeit mit dem Versuch, sie zu bewegen, da es wichtig ist, die Scheiben in den Inkubator so schnell wie möglich zu erhalten.
    3. Verwenden eine Glaspipette (Spitzen Ende), sanft überschüssige Mittel zu entfernen, ohne die Scheibe zu berühren.
      Hinweis: Scheiben darf nicht in Flüssigkeit während der Inkubation eingetaucht werden. So muss überschüssige Mittel abgesaugt werden, so dass die Scheiben der Luft ausgesetzt sind (eine Dünnschicht des Mediums wird noch die Scheiben abdecken). Scheiben, die in Flüssigkeit eingetaucht bleiben in der Regel werden ungesunde oder sterben (4 und unsere Beobachtungen).
    4. Die Schüssel wieder in den Inkubator zu bewegen, sobald das Konfetti haben eine Scheibe.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 1.7.8.-1.8.4. für Gericht #2.
  9. Ändern das Kulturmedium.
    Hinweis: Sollte dies am Folgetag (Tag 1 in vitro DIV1) schneiden und dann alle 2-3 Tage.
    1. Vorheizen Nährmedium in einem Wasserbad oder Inkubator.
    2. In einer sterilen Kapuze verwenden Vakuumsauger oder einer regelmäßigen Pipette mit einer sterilen Spitze zum Kulturmedium von jedem Bohrloch abzusaugen. Dies geschieht durch sanft kippen die Schüssel (von ca. 30 Grad) und setzen die Pipettenspitze am Rande der Kultur einfügen.
    3. Entfernen Sie etwa 800 µL aus jedem Bohrloch (Abfahrt nur genügend Mittel um die Unterseite des Einsatzes in Medium bedeckt zu halten). Dann fügen Sie mithilfe einer sauberen Pipette 800 µL vorgewärmten Medium in jede Vertiefung. Dann legen Sie das Geschirr zurück in die Zelle-Kultur-Inkubator.

2. Virale Transduktion

  1. Kauf oder machen Flugabwehrpanzer mit einem Plasmid von Interesse, wie zuvor beschrieben, 10 , 11.
    Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des AAV Serotyp 2/8 (AAV 2/8) mit mitochondrialen Dsred oder GFP als ein Reportergen transkriptionelle Kontrolle des Myelin basic Protein Promotor 12 ausgerichtet (AAV2/8 MBP_mito_dsred oder AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) Oligodendrozyt Mitochondrien zu visualisieren. AAV 2/8 mit GFP oder Tdtomato als Reportergen angetrieben durch die allgemeine CAG-Promotor (AAV 2/8 CAG_GFP oder AAV 2/8 CAG_tdtomato) wird verwendet, um Oligodendrozyt Zytoplasma zu visualisieren. Die Kombination von AAV2/8 MBP_mito_dsred mit AAV 2/8 CAG_GFP gibt so, rote Mitochondrien und grüne Zytoplasma in Oligodendrozyten, während die Kombination von AAV2/8 MBP_mito_GFP und 2/8 AAV CAG_tdtomato gibt grünen Mitochondrien und rote Zytoplasma. Die Konstrukte sind beschrieben in mehr detail an anderer Stelle 13.
  2. Am Tag 7 in-vitro-(DIV7), transduzieren Oligodendrozyten mit der Flugabwehrpanzer.
    Achtung: Beachten Sie die Sicherheitsvorschriften für die Arbeit mit Flugabwehrpanzer. Achten Sie auf die richtige Ausbildung und die Sicherheitsstufe-Genehmigung erforderlich. Die folgenden Punkte sollten in einem Klasse II Biosicherheit Schrank mit Handschuhe und Kittel durchgeführt werden. Hier wird die Anwendung der AAV in den Kortex-Bereich der Scheiben beschrieben, da dies der Bereich, der die beste Erholung zeigt. Kulturmedium
    1. verdünnt die AAV im vorgeheizten (37 ° C). Verdünnungen um 2 × 10 9 Genom Kopien/mL (GC/mL) werden empfohlen, um eine spärliche Transduktion von Oligodendrozyten bekommen die Bildgebung einzelner Zellen innerhalb der Scheibe ermöglicht. Jedoch sollte eine Pilot mit verschiedenen Titer getan werden, damit eine Dichte von Oligodendrozyten ausgestrahlt, die für die spezifischen Experimente geeignet ist. Wenn zwei verschiedene Flugabwehrpanzer verwendet werden, sollten sie in der gleichen Projektmappe gemischt und gleichzeitig den Slice hinzugefügt.
    2. Etwa 1,3 µL verdünnt AAV jedes Slice hinzufügen: Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze außen trocken ist. 1.3 µL Pipette AAV verdünnt und halten Sie die Pipette über den Kortex, so nah wie möglich ohne den Slice mit der Pipettenspitze (ca. 1 mm).
    3. Drücken Sie dann langsam Lösung aus der Pipette. Wenn die Lösung die Scheibe berührt, bewegen Sie die Pipettenspitze über den Kortex, die Lösung über den gesamten Kortex-Bereich zu verbreiten.
      Hinweis: Dieses Verfahren sollte so schnell wie möglich zu vermeiden, halten Sie die Scheiben aus der Haube länger als nötig erfolgen. Tun Sie dies auf ein Gericht zur Zeit und setzen das erste Gericht wieder in den Inkubator vor Gericht #2 ab. Um eine zufrieden stellende Verteilung der AAV zu erhalten, ohne Beschädigung des Gewebes einige Übung und eine ruhige Hand erfordert.
  3. Wenn eine aufrechte Fluoreszenzmikroskop im Labor Zelle vorliegt, kann Proteinexpression während der Zeit in Kultur indem man die Schale unter dem Mikroskop geprüft werden.
    Hinweis: Das Gericht nicht aufbewahrt werden aus dem Inkubator für mehr als 2 bis 5 Minuten.

3. Time-Lapse Imaging

Hinweis: die Bildgebung kann durchgeführt werden, wenn der Ausdruck der fluoreszierenden Marker ausreichend sind und die Scheiben gesund aussehen (in der Regel DIV11-14).

  1. Achten Sie darauf, das Mikroskop, Perfusion und Heizung korrekt so eingerichtet sind, dass sprudelte imaging-Lösung wird erhitzt und kann betreten und des Bades verlassen.
    Hinweis: Verschiedene Lösungen gibt es für Bad Kammern. Eine einfache Version wird hier vorgestellt.
    1. Stellen ein- und Verkaufsstellen des Bades durch stumpfen Spritze Nadeln (Bent bei ~ 45°), die an den Seiten des Bades durch Blu-Tack/Spaß Tack angehängt sind.
    2. Sorgen dafür, dass die Schläuche aus einer Flasche kontinuierlich sprudelte imaging-Lösung, über die peristaltischen Pumpe durch die Heizrohrregister des Heizgerätes und dann Spritze Einlassnadel in der Badewanne geht.
    3. Ein weiterer Schlauch an der Spritze Nadel Steckdose anschließen. Dieses Rohr geht dann über die peristaltischen Pumpe und zurück in die Flasche von imaging-Lösung (oder einer Abfallflasche).
  2. Bubble-imaging-Lösung (Rezept in Reagenzien ' Tabelle) mit Bioxide.
    Hinweis: Dies sollte staRTed mindestens 15 Minuten vor Bildgebung und während des gesamten Experiments.
  3. Turn für peristaltische Pumpe und Heizung laufen Lösung durch das Bad, optimale Badetemperatur (37 ± 0,5 ° C) zu erhalten. Sicherzustellen, dass die Thermometer-Sensor verbunden, die Temperatureinheit in der Bad-Lösung eingetaucht ist.
  4. Schalten Sie das Mikroskop, Fluoreszenz Lampe und geeignete Laser.
  5. Set up geeignet Licht Weg für das Beispiel.
    Hinweis: Dies variiert je nach Setup Mikroskop und Sonde. Allgemeinwissen wie confocal Mikroskop verwenden ist erforderlich und wird hier nicht behandelt werden.
  6. Verwenden eine Wasser-Immersion-Ziel mit der entsprechenden Vergrößerung und numerische Apertur (n.a.). Wir verwenden eine 40 X Wasser eintauchen Plan-Apochromat Objektiv (n.a. 1.0).
  7. Open Lochkamera einen optische Abschnitt von ca. 2-2,5 µm für das Time-Lapse Video zu erreichen. Dies reduziert das Auftreten von Mitochondrien bewegen außerhalb des Fokus während des Time-Lapse.
  8. Übertragung organotypischen Scheibe zum Bad:
    1. einen Tropfen des imaging-Lösung oder Kulturmedium zu einem kleinen Kunststoff Petrischale.
    2. In einer sterilen Kapuze Verwendung sterilen Pinzette übertragen eine organotypischen Scheibe aus der Membran einfügen bis zum Tropfen. Die Zange sollte nur das Konfetti und nicht die Scheibe berühren.
    3. Setzen Sie den Deckel auf die Petrischale.
    4. Sofort der Kulturschale mit der Rest der Scheiben wieder in den Inkubator gestellt.
    5. Bringen Petrischale mit Scheibe am Mikroskop.
    6. Schalten Sie peristaltische Pumpe während der Übertragung Slice auf Mikroskop-Bad. Verwenden Sie zuerst Zange, um Konfetti mit Scheibe aus Petrischale an die Spitze des Bades zu heben (das Konfetti wird schwimmen). Dann platzieren Sie die beiden Spitzen der Zange auf jeder Seite das Konfetti zu, so dass sie das Konfetti berühren, ohne die Scheibe zu berühren, und schieben Sie das Konfetti durch die Lösung auf den Boden des Bades. Zentrieren Sie das Konfetti in der Mitte des Bades.
    7. Einsatz Zange, den Niederhalter Anker (Harfe) am Anfang das Konfetti zu platzieren, ohne die Scheibe zu berühren.
      Hinweis: Eine Harfe ist eine hufeisenförmige Platin Anker, der verwendet wird, um zu verhindern, dass die Scheibe aus schwimmend oder driften in der Badewanne. Für akute Scheiben laufen dünnere Saiten von einer Seite der Harfe zum anderen (ähnlich einer Musik-Harfe). Für organotypischen Scheiben, die Harfe sollte Keniabohne und passen die Größe der das Konfetti in einer Weise, dass es auf das Konfetti legen kann, ohne die Scheibe zu berühren.
    8. Peristaltische Pumpe wieder einzuschalten.
  9. Das Ziel auf die Probe zu senken.
  10. Wählen Sie Zelle und Region Bild.
    Hinweis: Vermeiden Sie übermäßige Sonnenbestrahlung der Zellen, Laserlicht, da dies Zelle Toxizität führen kann (siehe Tipps in die folgenden Punkte).
    1. Verwenden die Okulare und die Leuchtstofflampe, um eine gesund aussehende Oligodendrozyt mit dem richtigen Ausdruck zu finden. In der Regel erscheinen Oligodendrozyten, die eine starke Überexpression des fluoreszierenden Proteins ungesund. Ungesunde Oligodendrozyten haben Prozesse mit einem Klecks aussehen, und die Mitochondrien erscheint fragmentiert. In gesunden Oligodendrozyten, die Soma und Prozesse erscheinen glatt und Mitochondrien haben verschiedene Längen (obwohl in der Regel wesentlich kürzer als in Neuronen und Astrozyten 13 , 14 , 15).
    2. legen Sie die Zelle von Interesse in der Mitte des Sehfeldes.
    3. Verwendung der " Leben " Funktion in der Software (für Leica und Zeiss Mikroskope) identifizieren die Zelle auf dem Bildschirm und wählen einen Bereich von Interesse, z. B. einen Teil der Zelle, die mehrere primäre Prozesse oder Myelinscheiden oder eines einzelnen Prozesses enthält oder Myelinscheide.
      Hinweis: Um Bild als ein Großteil der Prozesse/Hüllen wie möglich zu sein, wählen Sie Bereiche mit Prozessen, die relativ lag flach in Richtung X-y.
    4. Vergrößern Sie den Bereich von Interesse (in der Regel produzieren ein Bild mit Pixelgröße von 0,14 - 0,30 µm).
    5. Mit den " Regionen " Werkzeug, zeichnen Sie ein Rechteck um den Bereich und wählen Sie die Option nur den ausgewählten Bereich zu scannen. Scan-Zeit, und somit Laserbelichtung, verringert sich um nur das Scannen der ausgewählten Region.
      Hinweis: Horizontale rechteckige Bereichen werden schneller als vertikale Bereiche aufgrund der kürzeren Anzahl der gescannten Zeilen benötigt gescannt werden. Wenn eine vertikale Rechteck-Region gescannt wird, kann die Scan-Zeit reduziert werden, durch Drehen der Scan-Bereich von 90 Grad (mit dem Drehungswerkzeug).
  11. Adjust Laserleistung und Gewinn eine gute Aussicht auf Mitochondrien.
    Hinweis: Verwenden Sie die minimale Laserleistung benötigt. Wenn möglich, zu gewinnen, anstatt immer Laserleistung aufdrehen. Zusätzlich zu Zelle Toxizität verursachen, werden zu hohe Laserleistung bleichen die abgebildeten Objekte im Laufe der Zeit erfordern somit eine weitere Steigerung der Laserleistung oder gewinnen beim Scannen. Die erforderlichen Laserleistung und Gewinn hängt von den Ausdruck und das Mikroskop. Mit einem LSM700 confocal Mikroskop verwenden wir ein 555 nm-Laser mit einer Leistung von 20-40 µW, Bild Dsred oder Tdtomato und einem 488 nm Laser bei 20-30 µW GFP (Laserleistung gemessen an der hinteren Öffnung des Ziels) Bild verwendet wird. Gewinn ist in der Regel im Bereich von 700-800 für GLP und 850-980 für Dsred und Tdtomato hoch für live Aufnahmen eingestellt. Die high-Gain verursachen einige mehr Hintergrundgeräusche, die entfernt wird, durch die Erhöhung des digitale Versatzes (Offset, die Werte in der Regel zwischen 0 und 15 lag). Nach unserer Erfahrung mit MBP_mito_GFP gibt ein besseres Signal-Rausch-als MBP_mito_dsred.
  12. Select Scangeschwindigkeit.
    Hinweis: Scan-Zeit zu minimieren, indem eine schnelle Scan-Geschwindigkeit und zeichnen eine Kleinregion Scan (siehe Punkt 4.10.5 unten). Es ist auch möglich, Scan-Zeit durch eine bidirektionale Scan ausführen zu speichern. Dies wird jedoch nicht empfohlen aufgrund der schlechteren Bildqualität.
  13. Set Häufigkeit und Dauer der Zeitraffer Aufnahmen, z. B. erfassen alle 2 Sekunden für eine Gesamtmenge von 20 Minuten für die mitochondriale Bildgebung in Oligodendrozyten.
    Hinweis: Die Häufigkeit und Dauer sollte festgelegt werden, nach der Mobilität der Objekte von Interesse. Eine höhere Frequenz wird die Probe um mehr laser-Licht aussetzen, aber schneller bewegende Objekte erfordern auch eine kürzere Gesamtdauer von Zeitraffer-Videos (z. B. Mitochondrien in den Neuronen, die sich immer häufiger und mit einer viel höheren Geschwindigkeit als Mitochondrien in bewegen Oligodendrozyten, werden in der Regel jede Sekunde abgebildet, für insgesamt 2 16 Minuten).
  14. Starten Zeitrafferaufnahme.
    Hinweis: Die Mitochondrien können unscharf bewegen und/oder drift aus der abgebildeten Region während der Aufnahme. Zur Minimierung von Schwingungen und Bewegung anpassen ein- und Verkaufsstellen des Bades und ggf. die Pumpengeschwindigkeit reduzieren. Kleine Änderungen im Fokus, die in der Regel immer noch auftreten. Somit kontinuierliche Überwachung des Bildschirms während der Bildgebung ist erforderlich, mit kleinen Anpassungen der Fokus während der Aufzeichnung.
  15. Einen Z-Stapel die ganze Zelle für die künftige Identifikation der Zelle zu erfassen und Prozess abgebildet.
    Hinweis: Für eine bessere Auflösung die Lochkamera sollte zurückgesetzt werden auf 1 luftig Einheit für den Z-Stapel.
  16. Optional: visualisieren ungefärbten Myelin.
    Hinweis: In Oligodendrozyten mit GFP (zytoplasmatischen) ausgestrahlt, die Myelinscheiden können in der Regel als gerade Linien des Zytoplasma (der zytoplasmatischen Grate) verbunden zu einem primären Prozess (siehe Abbildung 2 A und B) identifiziert werden. Jedoch wenn GFP Ausdruck zu schwach ist oder ein zytoplasmatischen Marker wird nicht verwendet, ist es möglich, die Myelinscheide durch Reflexion der konfokalen Mikroskopie (CoRe) zu visualisieren, wie hier erläutert.
    1. Richten Sie einen neuen Lichtweg in der Software mit Laseranregung bei 488 nm und Capture emittiert Licht auf der gleichen Wellenlänge, z.B. 470-500 nm.
    2. Adjust Laserleistung und gewinnen bis Myelin sichtbar ist (siehe Beispiel in < starke Klasse = "Xfig "> Abbildung 3). Mit einem LSM 510 Meta-Mikroskop, wir verwenden in der Regel eine Laserleistung von 7-12 µW (gemessen an der hinteren Öffnung des Ziels).
  17. Optional: Erstellung von Scheiben für Immunostaining.
    1. Wenn die abgebildete Zelle nach Immunostaining, identifiziert werden muss ein geringer Vergrößerung Bild (10 X) der Zelle und geben Sie ihre Position im Bild durch einen Pfeil zeichnen oder ähnliches. Zur Erkennung der Zelle Unterstützung, es wird empfohlen, auch eine manuelle Karte der ganzen Scheibe, Angabe der Lage der Zelle zeichnen.
    2. Fix schneiden in 4 % Paraformaldehyd (PFA) auf Shaker für 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
      Achtung: PFA ist schädlich. Verwenden Sie Schutzkleidung und verwenden Sie nur in einer belüfteten Kapuze.
    3. Fixiermittel 01:10 in PBS verdünnen und lassen bei 4 ° C bis ab Immunohistochemistry wie an anderer Stelle beschrieben 17.
      Hinweis: Obwohl Scheiben in verdünnten Fixiermittel für mehrere Wochen verlassen, Fluoreszenz verblassen kann. Empfiehlt sich die Durchführung von Immunohistochemistry innerhalb von 10 Tagen nach Fixierung.

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Ergebnisse

Organotypischen Gehirnscheiben, die kultiviert und ausgestrahlt, wie oben beschrieben wurden, zeigte eine spärliche Verteilung der kortikalen Oligodendrozyten mit dem Ausdruck Mito_dsred und GLP. Immunostaining mit Antikörpern gegen Olig2 und MBP bestätigte, dass der Ausdruck spezifisch für Oligodendrozyten (Abbildung 1).

Für live Aufnahmen wurden ausgestrahlt Oligodendrozyten durch ihre charakteris...

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Diskussion

Das Protokoll zur Herstellung von organotypischen Kulturen hier beschrieben ist eine modifizierte Version18 des Protokolls von De Simoni und Yu (2006)5beschrieben. Die wichtigsten Änderungen sind nachfolgend dargelegt worden. TRIS-Puffer ist das Kulturmedium hinzugefügt, die das Überleben der Scheiben wenn außerhalb des Inkubators während virale Transduktion und Wechsel des Mediums Zelle verbessert. Die Sterilisation für Konfetti wird ebenfalls geändert. Während andere Prot...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Linda Hildegard Bergersen und Magnar Bjørås für den Zugang zu Handy-Lab und Ausrüstung, Janelia Molekularbiologie gemeinsame Ressource Personal für Plasmid und Virus-Produktion und Koen Vervaeke Unterstützung bei Lasermessungen macht. Diese Arbeit wurde von der norwegischen Health Association, der Norwegische Forschungsrat finanziert und die Mikroskopie-Ausrüstung wurde durch Norbrain finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agarose Sigma A9539
BD Mikrolanze 19GBD301500Nadeln für den Ein- und Auslass des Bades
BioxidgasAGA105701
Marke PipettenbirnenSigma-AldrichZ615927Pipettenbirnen
Bunsenbrenner (Flüssigpropanbrenner)VWR89038-530
Kabelkonfektion für HeizungsreglerWarner Instruments64-0106 Temperaturregler - Thermometerteil
CaCl2Fluka21100
CO2 AGA100309CO2 für Inkubator
Deckglas, quadratisch CorningThermo  Fischer Scientific13206778Zur Befestigung unter der Badewanne für Live-Bildgebung. Mit Kleber oder Vaseline verschließen.
D-(+)-GlucoseSigmaG7021
Zarte PinzetteFinescience11063-07Zum Sezieren
Diamant-RitzstiftTed Pella Inc.54463
Einweg-Glaspasteurpipetten 230 mmVWR612-1702Glaspipetten
Doppelschneidige Rasierklinge aus EdelstahlElektronenmikroskopie Sciences#7200Rasierklinge für Vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)Gibco-Invitrogen24010-043
FilterpapierkreiseSchleicher & Schuell300,220Filterpapier zur Filtration von PFA
Fun TackLoctite1270884Zum Anschließen/Einstellen der Position von Ein- und Auslässen in der Badewanne
Handtuch C-Fold 2Katrin344388
Harfe, flach für RC-41 Kammer,Warner Instruments  64-1418Harfe, um Konfetti in der Badewanne festzuhalten. Schneiden Sie die Fäden vor der Verwendung mit organotypischen Scheiben ab. 1,5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260,3SigmaH-7006
Holten LaminAir, Modell 1.2Heto-Holten96004000MLaminar-Flow-Haube
Pferdeserum, hitzeinaktiviertGibco-Invitrogen26050-088
KClSigmaP9541
LCR-Membran, PTFE, MilliporeFHLC0130Konfetti 
Leica VT1200Leica14048142065Vibratome
MEM-Glutamax mit HEPESThermo Fischer Scientific42360024
MgCl2R.P. Normapur25 108.295
Mikrolöffel Heyman Typ BElektronenmikroskopieSciences 62411-BKleiner, abgerundeter Spatel mit geschärftem Ende zum Sezieren
Millex-GP FiltereinheitMilliporeSLGPM33RASpritzenfiltereinheit
Millicell Zellkultureinsatz, 30 mmMilliporePICM03050Zellkultureinsätze
Minipuls 3 Speed Control ModuleGILSONF155001Schlauchpumpe für Live-Imaging - Steuermodulteil (Anschluss an Zweikanalkopf)
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaHCO3Fluka71628
Nunclon Delta SurfaceThermo  Fischer Scientific140675Kulturplatte
Nystatin SuspensionSigma-AldrichN1638
Objektiv W "Plan-Apochromat" 40x/1,0 DIC Zeiss441452-9900-000 Wasserimmersionsobjektiv für Live-Bildgebung. (WD=2.5mm), VIS-IR
ParafilmVWR291-1211
Paraformaldehyd, granulatElektronenmikroskopie Sciences#19208
PC-R PerfusionskammerSiSkiYou  15280000EBad für Live-Bildgebung
Penicillin-Streptomycin, flüssigInvitrogen15070-063
Petrischale 140 mm Heger1075Große Petrischale 
Petrischale 92x16 mm;Sarstedt 82.1473Mittlere Petrischale 
Petrischale 55x14,2 mmVWR391-0868Kleine Petrischale
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)SigmaP4417PBS Tabletten
R2 Zweikanal-Kopf GILSONF117800Schlauchpumpe für Live-Imaging - Zweikanal-Kopfteil (Steuermodul erforderlich)
Rund-/Flachspatel, EdelstahlVWR82027-528Großer Spatel zum Sezieren
SchleifpapierVWRMMMA63119Optional, zum Glätten von Glasscheren Pipetten
Schere,   17,5 cmFinescience14130-17Große Schere zum Sezieren
Schere, 8,5 Finescience14084-08Kleine, scharfe Schere zum Sezieren
Einschneidige, EdelsteinklingeElektronenmikroskopie Sciences#71972Einschneidige Rasierklinge
Einfache Inline-Lösungsheizung SH-27BWarner Instruments64-0102Temperaturregler - Heizteil
Steritop-GP Filtereinheit, 500 ml, 45mmMilliporeSCGPT05REFilter zum Sterilisieren Lösungen
Sekundenkleber PräzisionLoctite1577386
Chirurgische Skalpellklinge Nr. 22Swann Morton Ltd.209Abgerundete Skalpellklinge
Temperaturregler TC324BWarner Instruments64-0100Temperaturregler für Live-Bildgebung (erfordert Lösungsheizung und Kabelkonfektion)
Trizma-BasisSigma T1503
Trizma HClSigmaT3253
Inkubator mit Wassermantel Serie IIForma Scientific78653-2882Inkubator

Referenzen

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