Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von einem oder mehreren Plasma und/oder intrazellulären Membranproteinen mit Grundzustand Erschöpfung (GSD) Super-Auflösung Mikroskopie in Säugerzellen. Hier besprechen wir die Vorteile und die Überlegungen der Verwendung solcher Ansätze zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen.
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Methodenartikel
Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Fortschritte in der Fluoreszenz-Mikroskopie und Zellbiologie korrelieren eng mit der verstärkten Fähigkeit zu visualisieren, zelluläre Ereignisse führt häufig zu dramatischen Sprünge in unserem Verständnis, wie Zellen funktionieren. Die Entwicklung und Verfügbarkeit der Höchstauflösung Mikroskopie wurde erheblich erweitert die Grenzen der optischen Auflösung von ~ 250-20 nm. Biologen sind nicht mehr nur auf die Beschreibung der molekularer Interaktionen in Bezug auf NS1 innerhalb eines Bereichs von Beugung begrenzt, sondern es ist nun möglich, die dynamischen Wechselwirkungen einzelner Moleküle zu visualisieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie für feste Zelle Bildgebung. Wir bieten Beispiele aus zwei verschiedenen Membranproteinen, Bestandteil des endoplasmatischen Retikulum Translocon, sec61β undeiner Plasmamembran lokalisiert Voltage-gated Typ L Ca 2 + -Kanäle (CaV1.2). Diskutiert werden spezifische Mikroskop Parameter, Fixierung Methoden, Foto-Umschaltung Puffer Formulierung und Fallstricke und Herausforderungen der digitalen Bildverarbeitung.
Einleitung
Zelluläre Reaktionen Signalisierung übersetzen wechselnde interne und externe Umgebungen um eine zelluläre Reaktion zu initiieren. Sie regelt alle Aspekte der menschlichen Physiologie, dienen als Grundlage für Hormon und Neurotransmitter-Freisetzung, der Herzschlag, Vision, Düngung und kognitive Funktion. Störung der diese Signalisierung Kaskaden kann gravierende Folgen in Form von pathophysiologischen Bedingungen wie Krebs, Parkinson und Alzheimer-Krankheit haben. Jahrzehntelang haben biologischer und medizinischer Forscher erfolgreich fluoreszierende Proteine, Sonden und Biosensoren gepaart mit Fluoreszenz-Mikroskopie als die wichtigsten Tools verwendet, um die gena....
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Protokoll
1. Waschen Glasdeckgläser
- am Vortag Probenverarbeitung, reinigen #1.5 Glasdeckgläser in einer 1 M Lösung von KOH 1 h beschallen. Dies entfernt alle fluoreszierenden Verunreinigungen, die auf den Deckgläsern vorhanden sein können.
- KOH von Deckgläsern mit deionisiertes Wasser gründlich zu spülen.
- Einmal in KOH gereinigt, speichern in 70 % igem Ethanol bis zum Gebrauch der Deckgläsern.
2. Beschichtung Glasdeckgläser
Hinweis: Schritte in diesem Abschnitt sollte durchgeführt werden, in eine Zelle Kultur Haube um Kontaminationen zu vermeiden.
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Ergebnisse
Wie in der Einleitung beschrieben, gibt es viele andere super-Auflösung Mikroskopie bildgebende Modalitäten. Dieses Protokoll konzentriert sich auf GSD Höchstauflösung Bildgebung. Repräsentative Bilder und Lokalisierung Karten sind in Abbildung 2 und Abbildung 3gezeigt.
Abbildung 2 zeigt eine COS-7-Zelle, mit der ER Protein, mCherry-Sec61β .......
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Diskussion
Die jüngste Explosion von Technologien, mit denen Bildgebung jenseits der Beugungsgrenze haben neue Fenster in die Komplexität der Säugetier-Zelle signalisieren in Raum und Zeit angeboten. Diese Technologien sind Sturm, STED, PALM, GSD, SIM und ihre Varianten (z.B. dSTORM, FPALM). Der Einfallsreichtum der Wissenschaftler hinter diesen Techniken ermöglichte uns, die Beschränkungen durch die Gesetze der Physik für die Beugung von Licht zu umgehen. Trotz dieser großen Leistung jede dieser Techniken macht eine Art K.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der AHA an R.E.D (15SDG25560035) unterstützt. Autoren möchten Dr. Fernando Santana für den Einsatz des Mikroskops seiner Leica SR GSD-3D und Dr. Johannes Hell für die freundlicherweise Bereitstellung des FP1 Antikörpers erkennen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | Zum Reinigen von Deckglas |
| #1,5 Deckglas 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | Zum Züchten/Verarbeiten/Abbilden von Zellen |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Verdünnen auf 1x mit entionisiertem Wasser |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P4832 | Hilft bei der Zelladhäsion auf Deckglaslaminin |
| Sigma | 114956-81-9 | Hilfsmittel bei der Zelladhäsion auf Deckglas | |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventrikuläre Myozyten-Kulturmedien |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Zellkulturmedien |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media Supplement |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | Medien Zusatz |
| 0,05 % Trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Zellkulturlösung |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transientes Transfektionsreagenz |
| Ca2+-frei PBS | Gibco | 1419-144 | Zellkultur |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Zellfixierung |
| Paraformaldehyd | Elektron Microscopy Sciences | 15710 | Zellfixierung |
| Glutaraldehyd | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Zellfixierung |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA oder andere Blockierungslösungsalternativen existieren |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergens zur Permeabilisierung |
| der Zellen Kaninchen Anti-CaV1.2 (FP1) | Geschenk | N/A | Es gibt kommerzielle Anti-CaV1.2-Antikörper wie Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoklonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primärer Antikörper |
| Alexa Fluor 647 Donket Anti-Kaninchen-IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Sekundärantikörper |
| Alexa Fluor 568 Anti-Maus-IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Sekundärer Antikörper |
| Natriumazid | Sigma | S2002 | Verhindert mikrobielles Wachstum für die Langzeitlagerung von Proben |
| Katalase | Sigma | C40 | Photoschaltender Pufferbestandteil |
| Glukoseoxidase | Sigma | G2133 | Photoschaltender Pufferbestandteil |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoschaltender Pufferbestandteil |
| Beta-Mercaptoethylaminhydrochlorid | Fisher | BP2664100 | Photoschaltender Pufferbestandteil |
| beta;-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoschaltender Pufferbestandteil |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoschaltender Pufferbestandteil |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoschaltender Pufferbestandteil |
| Glas Depression Objektträger | Neolab | 1 – 6293 | Zum Montieren von Proben |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | Zum Versiegeln von Deckglas |
| sec61β- mCherry Plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D-Mikroskop | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Waschblocklösung | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primärantikörper-Inkubationslösung | 0,5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Sekundärantikörper-Inkubationslösung | 1:1000 in PBS |
Referenzen
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G.
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Nachdrucke und Genehmigungen
