Methodenartikel

Probenvorbereitung für die Endopeptidomic Analyse im menschlichen Liquor cerebrospinalis

DOI:

10.3791/56244

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4. Dezember 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inst. of Neuroscience and Physiology, Dept. of Psychiatry and Neurochemistry, Sahlgrenska Academy at University of Gothenburg, 2Clinical Neurochemistry Laboratory, Sahlgrenska University Hospital, 3Department of Molecular Neuroscience, UCL Institute of Neurology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Eine Methode für die massenspektrometrische Analyse von endogenen Peptiden in menschlichen zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) wird vorgestellt. Durch den Einsatz von Molekulargewicht Cut-off-Filtration, chromatographische Pre-Fraktionierung, massenspektrometrischen Analyse und eine anschließende Kombination von Peptid-Identifikation-Strategien, war es möglich, die bekannten CSF Peptidome fast um das Zehnfache im Vergleich zu erweitern zu früheren Studien.

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt eine Methode entwickelt, um die endogene Peptide in menschlichen zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) zu identifizieren. Zu diesem Zweck eine zuvor entwickelte Methode basierend auf Molekulargewicht Cut-Off (MWCO) Filtration und massenspektrometrische Analyse wurde mit einer offline hohem pH-Wert umgekehrter Phase HPLC Pre Fraktionierung Schritt kombiniert.

Sekretion in Liquor ist der Hauptweg zur Entfernung von Molekülen durch Zellen des zentralen Nervensystems zu vergießen. So spiegeln sich viele Prozesse in das zentrale Nervensystem im Liquor, eine wertvolle diagnostische Flüssigkeit zu rendern. CSF hat eine komplexe Zusammensetzung enthält Proteine, die einen Konzentrationsbereich von 8-9 Größenordnungen umfassen. Neben Proteinen haben frühere Studien auch die Anwesenheit einer großen Anzahl von endogenen Peptiden gezeigt. Während weniger intensiv erforscht als Proteine, können diese auch potentielles Interesse als Biomarker halten.

Endogene Peptide wurden von der CSF Proteingehalt durch MWCO Filtration getrennt. Einen Großteil der Proteingehalt aus der Probe entfernen, ist es möglich, das Probenvolumen studiert und damit auch der Gesamtbetrag der endogene Peptide zu erhöhen. Die Komplexität der Mischung filtriert Peptid wurde behoben, indem unter anderem einen umgekehrten Phase HPLC (RP) Pre-Fraktionierung Schritt bei alkalischen pH-Wert vor der LC-MS-Analyse. Die Fraktionierung wurde kombiniert mit einem einfachen Verkettung Regelung denen 60 Brüche in 12 gebündelt wurden, konnte Analyse Zeitverbrauch dadurch verringert werden, Co Elution noch weitgehend zu vermeiden.

Automatisierte Peptid Identifikation erfolgte durch mit drei verschiedenen Peptid/Protein-Identifikation-Software-Programme und kombinieren anschließend die Ergebnisse. Die verschiedenen Programme wurden ergänzende als vergleichbar mit weniger als 15 % von Identifikationen, die zwischen den drei überlappt.

Einleitung

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Biomarker im Liquor cerebrospinalis (CSF) sind derzeit verwandelt Forschung in Neurodegenerative Erkrankungen. Bei der Alzheimer-Krankheit die häufigste Neurodegenerative Erkrankung, Auswirkungen auf mehr als 60 Millionen Menschen weltweit1,2, ein Biomarker-Triplett bestehend aus Peptid Amyloid Beta, Mikrotubuli-stabilisierenden Protein Tau, und eine Tau Form phosphoryliert und erkennt die Krankheit mit hoher Sensitivität und Spezifität in der diagnostischen Forschung Kriterien3aufgenommen wurde. In anderen neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Parkinson und Multiple Sklerose haben....

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Protokoll

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Die nachfolgend beschriebene Protokoll ist eine verfeinerte Version des einen in einer früheren Studie verwendet, wo eine große Menge von endogenen Peptiden in menschlichen CSF15identifiziert wurden. Updates für das ursprüngliche Protokoll betreffen kleine Änderungen der chemischen Vorbehandlung von CSF sowie Optimierung des Verlaufs für offline hohem pH-Wert RP HPLC Pre Fraktionierung verwendet.

Ethische Überlegungen

Alle Studien von schwedischen Patienten und Kontrolle von ethischen Komitees genehmigt worden: St. Göran (Nr. 2005-554-31/3). CSF aus Amsterdam Demenz Kohort....

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Ergebnisse

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Die hier beschriebene Methode wurde angewendet und evaluiert in drei Studien vor der Einführung der Probe vor Fraktionierung (Tabelle 1). Die erste Studie offline LC für spotting CSF Fraktionen auf eine MALDI-Zieltafel verwendet und 730 identifizierten endogene Peptide11ergeben. In den beiden folgenden Studien wurde die Isobaren Kennzeichnung eingesetzt. In erster Linie in einem Fall/Dimmer Studie zur Identifizierung und Charakterisierung potenzieller Biomarker in der CSF Endopeptidome und Proteom.......

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Diskussion

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Die Einführung eines hohem pH-Wert RP HPLC Pre Fraktionierung Schritts auf ein zuvor entwickelte Protokoll für die Wiederherstellung von endogenen Peptiden durch Molekulargewicht Ultrafiltration11 relative Probe Komplexität reduziert und dadurch für eine 5-fach größere erlaubt Probenvolumen untersucht werden. Dies wiederum erhöht die Konzentration der Teilmenge von Peptiden in jede Fraktion vertreten und dadurch verbessert die Chancen auf Erkennung von niedrigen reichlich Peptide.

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Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte, finanziellen oder sonstigen zwischen Autoren sind berichtet worden.

Danksagungen

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Vielen Dank an Tanveer Batth und Kollegen für die Beratung bei der Einrichtung der Pre-Fraktionierung-Methode.

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Mittel vom schwedischen Forschungsrat, der Wallström und Sjöblom Foundation, die Waffe und Bertil Stohne Stiftung Stiftelse, Magnus Bergwall Stiftung, Åhlén Stiftung, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut und Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen und FoU Västra Götalandsregionen.

Die wichtigsten Empfänger von Zuschüssen für dieses Projekt waren Kaj Blennow, Henrik Zetterberg und Johan Gobom.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
  1 M TriethylammoniumbicarbonatFluka, Sigma-Aldrich17902-100MLTEAB
  8 M GuanidiniumhydrochloridSigma-AldrichG7294-100MLGdnHCl
Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochloridPierce20490TCEP
IodacetamidSIGMAI1149-5GIAA
Hydroxylamin 50% (w/w)Sigma-Aldrich457804-50ML
Acetonitril, Fern-UV, HPLC-GradientenqualitätSigma-Aldrich271004-2LAcN
AmeisensäureFluka, Sigma-Aldrich 56302-1mL-FFA
TrifluoressigsäureSigma-AldrichT6508-10AMPTFA
AmmoniumhydroxidlösungSigma-Aldrich 30501-1L-1MNH4OH
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-30 MembranMerck MilliporeUFC903024MWCO-Filter
Sep-Pak C18, 100 mgWasserWAT023590SPE-Säule
Resprep 12-Port SPE Verteiler Restek26077Vakuumverteiler
TMT10plex Isobares MarkierungsreagenziensetThermo Fisher Scientific90110TMT10plex
UltiMate 3000 RSLCnano LC SystemDionex5200.0356Online-Probentrennung
Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation BinärsystemDionexIQLAAAGABHFAPBMBEZOffline-Fraktionierung mit hohem pH-Wert
Orbitrap Fusion Tribrid MassenspektrometerThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMBCXMassenspektrometer für die Probenanalyse
Proteome Discoverer 2.0 Thermo Fisher ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUHProteomics-Suchplattform
Mascot v2.4Matrix Science - Proteomik-Suchmaschine
Sequest HTThermo - Proteomik-Suchmaschine
SPITZEN v7.5 Bioinformatik-Lösungen Inc.) - Proteomik-Suchmaschine
Acclaim PepMap 100, 75 & micro; m x 2 cm, C18, 100 & Aring; Porengröße, 3 & Mikro; m PartikelgrößeThermo Fisher Scientific164535Trap-Säule (Nano-HPLC)
Acclaim PepMap C18, 75 & Mikro m x 500 mm, 100" Aring; Porengröße,  2 & Mikro; m PartikelgrößeThermo Fisher Scientific164942Trennsäule (Nano-HPLC)
Savant SpeedVac HochleistungskonzentratorenThermo Fisher ScientificSC210A-230SpeedVac/Vakuum-Konzentrator
XBridge Peptide BEH C18 Säule, 130Å, 3,5 &Mikro; m, 2,1 mm x 250 mmWasser186003566Trennsäule (Mikro-HPLC)

Referenzen

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  1. Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
  2. Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
  3. Dubois, B., et al.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

MWCO FiltrationReversed Phase HPLCLC MS AnalysePeptid Vorfraktionierungendogene PeptideMassenspektrometriePeptididentifizierung

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