Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

Vision ist wahrscheinlich der wichtigste Sinn des Menschen und seiner Beeinträchtigung hat eine hohe sozio-ökonomische Auswirkungen. In der industrialisierten Welt entfallen degenerative Netzhauterkrankungen die Mehrheit der Sehbehinderung und Blindheit bei der erwachsenen Bevölkerung¹. Retinitis Pigmentosa (RP) ist die häufigste erbliche Ursache für Erblindung bei Menschen im Alter zwischen 20 und 60, Auswirkungen auf etwa 1,5 Millionen Menschen weltweit^2,3. Es ist eine heterogene Familie von retinalen Erbkrankheiten durch fortschreitenden Verlust der Photorezeptoren (PRs), gefolgt von Degeneration des retinalen Pigmentepithels und anschließend Gliosis und Umbau des inneren Neuronen⁴gekennzeichnet. Der Krankheitsverlauf lässt sich erklären durch den inkrementellen Verlust der PR zwei Zelltypen, Stangen, die sind verantwortlich für achromatische Vision im Dämmerlicht und Zapfen, die für Color Vision und Sehschärfe⁵sind in der Regel ab. Ein einzelnes Gendefekt reicht für RP. Bisher wurden mehr als 130 Mutationen in mehr als 45 Genen verbunden mit der Krankheit-⁶. Dies führt zu unterschiedlichen Phänotypen der Krankheit und ist einer der Gründe, die Gentherapie nicht verallgemeinerbare ist und somit eine komplexe therapeutische Ansatz. Daher ist dringend erforderlich, neue allgemeine Therapieansätze zur Behandlung von retinaler Degenerationen in blendenden Krankheiten zu entwickeln.

Netzhautdegeneration oft schließt PR Verlust; Daher ist PR Zelltod ein Markenzeichen für die degenerativen Prozesse in der Netzhaut-⁷. Es wurde bereits nachgewiesen, dass PR Zelltod Müller Glia Zelle (MC) Aktivierung und Proliferation⁸stimuliert. MCs, großen glialen Zelltyp in der vertebrate Retina galten einmal als nichts anderes als ein "Klebstoff" zwischen Netzhaut Neuronen. In den letzten Jahren haben viele Studien gezeigt, dass MCs zu handeln, als mehr als bloße strukturelle⁹unterstützen. Unter den verschiedenen Funktionen MCs beteiligen sich auch an Neurogenese und¹⁰zu reparieren. In der Tat, in Reaktion auf diffusiblem Faktoren von der degenerierenden Netzhaut, MCs deutlich erhöhen glial fibrillary sauer (GFAP) Proteinexpression. Daher kann als Marker für MC Aktivierung als sekundäre Reaktion auf Netzhaut Verletzung und Degeneration¹¹GFAP Kennzeichnung verwendet werden.

Vor kurzem haben wir eine neuartige Anpassung der fokalen Verletzungen mit Hilfe eines Lasers induzieren Netzhautdegeneration im Zebrafisch (Danio Rerio) entwickelt. Fokalen Verletzung ist vorteilhaft für das Studium bestimmte biologische Prozesse wie die Wanderung von Zellen auf der verletzten Seite und der genaue Zeitpunkt der Ereignisse, die während der Netzhaut Regeneration¹²stattfinden. Darüber hinaus ist der Zebrabärbling aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen seine visuellen System und dem von anderen Wirbeltieren in visuelle Forschung wichtig geworden. Grobe morphologischen und histologischen Merkmale des menschlichen und teleost Netzhaut zeigen einige Unterschiede. Dementsprechend enthalten Mensch und Zebrafisch Netzhaut die gleichen großen Zelle Klassen organisiert in dem gleichen geschichteten Muster, wo lichtempfindlichen Photorezeptoren die äußerste Schicht, besetzen, während die Netzhaut Projektion Neuronen, die Ganglienzellen im Innersten wohnen neuronalen Ebene, proximal an der Linse. Die Netzhaut Interneuronen, die amakrinen, bipolar, und horizontalen Zellen zwischen den Photorezeptoren und Ganglienzellen Zelle Schichten¹³zu lokalisieren. Darüber hinaus ist die Zebrafisch Netzhaut Kegel beherrscht und daher näher an der menschlichen Netzhaut als zum Beispiel intensiv studierte Nagetier Netzhaut. Ein faszinierende Unterschied zwischen teleost und Säugetiere ist die anhaltende Neurogenese in Fisch Netzhaut und Netzhaut Regeneration nach Schaden. Im Zebrafisch können MCs Gewebestammzelle und Regeneration im geschädigte Netzhaut^14,15vermitteln. Bei Hühnern haben MCs einige Fähigkeit auch, geben Sie den Zellzyklus und Gewebestammzelle. Nach Netzhaut Verletzung bei Erwachsenen Fischen MCs übernehmen bestimmte Merkmale der Stammvater und Stammzellen, migrieren, die beschädigte Netzhautgewebe und produzieren neue Neuronen¹⁶. Gen Expression profiling von Säugetieren MCs offenbart unerwartete Ähnlichkeiten mit retinalen Stammväter, und Beweise für die innewohnende Potenzial neurogenen MCs im Huhn, Nager und auch die menschliche Netzhaut wächst¹⁷. Dennoch, warum die regenerative Antwort in Vögel und Säugetiere niedriger, verglichen mit der starke Reaktion in Fisch ist noch nicht geklärt. Daher kann die körpereigene Reparaturmechanismen im Zebrafisch Verständnis Strategien für anregende retinalen Regeneration bei Säugetieren und beim Menschen vorschlagen. Einsatz der körpereigene Reparaturmechanismus der MCs als therapeutisches Werkzeug für die Behandlung von Patienten mit Netzhautdegeneration hervorragend für unsere Gesellschaft auswirken würde.

Hier bieten wir Ihnen die notwendigen Schritte zur Degeneration/Regeneration Modell in Augenheilkunde beschäftigen. Wir konzentrierte sich zunächst auf Induktion fokalen Schäden in der neurosensorischen Netzhaut, dann auf die Darstellung der Ereignisse am Verletzung Aufstellungsort und schließlich visualisieren Beteiligung der benachbarten MCs entwickeln. Das allgemeine Protokoll ist relativ einfach durchzuführen und öffnet eine Vielzahl von Möglichkeiten für die Bewertung der Netzhaut danach.

alle Experimente der Anweisung für den Einsatz von Tieren in Ophthalmic und Vision Research Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) eingehalten und beachten Sie die damit verbundenen Vorschriften der staatlichen Behörden.

1. Tiere

1. pflegen TgBAC (Gfap:gfap-GFP) Zebrafisch 167 (AB) Belastung im Alter von 6-9 Monate unter normalen Bedingungen in Wasser mit einer Temperatur von 26,5 ° C und eine 14/10 h hell/dunkel-Zyklus ¹⁸.
2. Richtlinien der Tierbetreuung der beteiligten Institutionen für die Tierversuche nach Genehmigung durch die staatlichen Behörden.

2. Reversible systemische Narkose

1. Vorbereitung der Stammlösung Ethyl-3-Aminobenzoate-Methanesulfonate-Salz (Tricaine) durch Auflösen von 400 mg Tricaine Pulver in 97,9 mL Wassertank und 2,1 mL 1 M Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS). Passen Sie auf pH 7,0 mit 1 M Tris (pH 9) und Store bei 4 ° C in den dunklen bis zu einem Monat.
   Hinweis: Tricaine sollten bereit sein, im Wasser wie die natürlichen Lebensbedingungen der Tiere, vorzugsweise original Wassertank verwendet werden sollten.
2. Der Stammlösung 01:25 im Tank Wasser zu verdünnen und sofort nutzen.
3. Setzen der Zebrabärbling in einer 10 cm Petrischale mit 50 mL Anästhesie-Lösung, bis sie unbeweglich und nicht auf äußere Reize (ca. 2-5 min, je nach Gewicht und Alter reagieren).
4. Übertragen jeden Fisch von hand auf eine maßgeschneiderte Silikon Stift Halterung für Laser-Behandlung ( Abb. 1A).
   VORSICHT! Der Fisch kann außerhalb des Behälters für bis zu 10 min nur betäubt bleiben.
5. Um die Narkose nach der Behandlung und/oder Bildgebung umzukehren, legen der Zebrabärbling in Behälter, Tank Wasser.
6. Zur Unterstützung der Wiederherstellung erstellen einen Wasserfluss frischen Tank über den Kiemen durch Verschieben der Zebrabärbling hin und her im Wasser.

3. Laser-fokalen Verletzungen auf Netzhaut

Hinweis: A 532 nm Diodenlaser wird verwendet, um fokale leichte Schäden an der Netzhaut der Zebrafisch erstellen. Der Versuchsaufbau des Lasers ermöglicht die Einrichtung einer reproduzierbaren fokale Netzhaut Verletzung im Erwachsenen Zebrafisch.

1. Eingerichtet, die Ausgangsleistung des Lasers: 70 mW; Antenne Durchmesser: 50 µm, Impulsdauer: 100 Ms.
   Vorsicht! Die Verwendung von Laserlicht erfordert geeignete persönliche Schutzausrüstung und Kennzeichnung des Gebiets.
2. 1-2 Tropfen 2 % Hydroxypropylmethylcellulose topisch in die Augen vor der Behandlung und eine 2,0 mm Fundus Laserlinse verwenden, um den mit dem Ziel, Laser Strahl auf die Netzhaut zu konzentrieren.
   VORSICHT! Hydroxypropylmethylcellulose Tropfen sind zähflüssig und kann Probleme verursachen, wenn es auf den Kiemen geht atmen.
3. Platz vier Laser Spots rund um den Sehnerv auf der linken Seite Auge und verwenden Sie das richtige, unbehandelte Auge als interne Kontrolle.

4. In vivo Bildgebung der Netzhaut Morphologie

1. am Tag 0, visualisieren die Zebrafisch Netzhaut direkt nach der Laser-Induktion ohne Wiederbelebung sie aus der Narkose. Zu allen anderen Zeitpunkten beschäftigen Vollnarkose (siehe Abschnitt 2: Reversible systemische Anästhesie). Legen Sie die immobilisierten Zebrafisch auf eine maßgeschneiderte Silikon-Pin-Halter ( Abbildung 1 B, b. 1).
2. Um optimale Aufnahmen zu schneiden eine handelsübliche Hydrogel-Kontaktlinse Zebrafisch Auge passen (Ø = 5,2 mm, R = 2,70 mm Mittendicke = 0,4 mm) durch einen Locher. Füllen Sie die konkave Oberfläche der Linse mit Methylcellulose und legen Sie es über die Hornhaut.
3. Statten das OCT-System mit einem 78D berührungslose Schlitz Lampe Objektiv.
4. Konzentrieren sich die Infrarot (IR) Bild in der IR + OCT-Modus ( Abbildung 2A) zu visualisieren den Fundus des Auges die IR Bilder durch Klicken auf die " erwerben " Taste ( Abb. 2 b) zu lokalisieren die Laser-Flecken auf der Netzhaut, die mit dem System ' s Software.
5. Visualisieren eine dreidimensionale Abschnitt der Netzhaut Schichten in der IR + OCT-Modus und nehmen Sie die Bilder durch Klicken auf die " erwerben " Taste ( Abb. 2 b). Die Schwere der Verletzungen in der nuklearen Außenschicht (ONL) zu beobachten (siehe Abschnitt 3: Laser-fokalen Verletzungen auf Netzhaut) in diesen Bildern.
6. , Betäubung rückgängig zu machen, nachdem die Behandlung und/oder Bildgebung der Zebrabärbling in einem Behälter mit Wassertank platziert.
7. Zur Unterstützung der Wiederherstellung erstellen einen Wasserfluss frischen Tank über den Kiemen durch Verschieben der Zebrabärbling hin und her im Wasser.
8. Führen Sie ähnlich wie in-Vivo Bildgebung der Netzhaut Morphologie an Tag 1, 3, 7, 14 und Woche 6.

5. Hämatoxylin & Eosin (H & E) färben

1. einschläfern Zebrafisch durch Eintauchen in kalt (4 ° C) Anästhesie-Lösung auf Eis für mindestens 10 min und Einatmung die Augen sofort mit Hilfe von kleinen gebogenen Pinzette.
2. Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C für 20 h die ganze Augen in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixieren und dann pausiert die Proben in einer Reihe von abgestuften Alkohol (Xylol, 100 % für 5 min zweimal, Ethanol 100 % für 5 min zweimal, Ethanol 96 % für 3 min zweimal und Ethanol 70 % 3 mi einmal n).
   VORSICHT! PFA kann reizend auf die Augen, der Nase und der oberen Atemwege. PFA ist ein bekanntes menschliches Karzinogen und eine vermutete Gefahr für die reproduktive.
3. Der Proben in Paraffin eingebettet, geschnitten 5 µm-Abschnitte auf der Ebene des Sehnervenkopfes und klebe sie auf Glasobjektträger.
4. Fleck in den deparaffinized Abschnitten mit 0,1 % Säure Hämatoxylin Lösung für 5 min und Tauchen Sie die Folien zweimal in destilliertem Wasser nach dem Eintauchen der Folien in Salzsäure-Mix (2 mL 25 % HCl in 250 mL destilliertes Wasser) und Ammoniak (2 mL 25 % Ammoniak in 250 mL mischen destilliertes Wasser). Fleck in den Abschnitten mit Eosin G wässriger Lösung 0,5 % für 3 min nach der Entwicklung der Hämatoxylin-Färbung von Leitungswasser für mindestens 10 min.
5. Montieren Sie dehydrierten Folien in Acrylharz Eindeckmittel und beobachten Sie die Folien unter dem Lichtmikroskop.

6. Immunohistochemistry für die Aktivierung von MC

1. die deparaffinized Abschnitte in Antigen Abruf Puffer (Tris-EDTA + 0,05 % nicht-ionische Waschmittel, pH 9,0) für 3 min in eine geeignete Dampfgarer oder Mikrowelle für 10-15 min. erhitzen und waschen dreimal mit TBS für 5 min.
2. Kreis in den Abschnitten mit einem Silikon Stift und hinzufügen 100 µL blockiert Lösung (TBS + 10 % normalem Ziegenserum + 1 % Rinderserumalbumin, pH 7.6) bei Raumtemperatur für 1 h.
3. Fleck mit Anti-glial fibrillary sauren Protein (GFAP) Kaninchen polyklonalen Antikörper und Anti-Glutamin Synthestase (GS) Maus monoklonaler Antikörper, sowohl in einer Verdünnung von 1: 200 (40 µL pro Probe). Über Nacht inkubieren Sie die Folie in eine feuchte Kammer bei 4 ° C. Waschen dreimal mit TBS + 0,1 % Tween 20 für 5 min.
4. Finish Visualisierung mit dem entsprechenden Sekundärantikörper. Dieses Protokoll verwendet eine Ziege Anti-Kaninchen IgG H & L grün Sekundärantikörper für GFAP und eine Ziege Anti-Maus IgG H & L leuchtend rot für GS, sowohl in einer Verdünnung von 1: 500 bei Raumtemperatur für 1 h
5. Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel mit DAPI und beobachten Sie die Folien unter dem Fluoreszenzmikroskop.

Echtzeit-OCT: ein Laser Verletzungen Modell induzieren eine gut abgegrenzte Zone von Schäden in der Netzhaut Zebrafisch verwendet, um die Analyse der Rolle der MCs in retinalen Reparatur. Die Website des Schadens wurde mittels in Vivo OCT zum ersten Mal (Tag 0) innerhalb von 60 Minuten nach der Verletzung (Abbildung 3) abgebildet. Um die Optik des Auges Fisch zu kompensieren, wurde eine maßgeschneiderte Kontaktlinse auf die Hornhaut gelegt. Unmittelbar nach der Laserbehandlung wurde ein diffuses hyper-reflektierende Signal an der äußeren Netzhaut (Pfeile) lokalisiert. Es erstreckte sich von der Netzhaut pigmentierten Pigmentepithels (RPE) an der äußeren plexiformen Schicht (OPL). Ein ähnliches Signal war auch am 1. Tag nachweisbar. Nach dem 3. Tag wurde dieses diffuse Signal besser organisiert und dichten. Es wurde konsequent in die nukleare Außenschicht (ONL) erstreckt sich in der Photorezeptor-Layer gesehen. Nach der ersten Woche (Tag 7) gab es ein deutlichen Rückgang der durchschnittlichen Läsion Größe und nur ein kleinen hyper-reflektierende Signal erkannt wurde. Ab 14. Tag bis der neuesten Zeitpunkt (Woche 6) untersucht, wurden die Laser-Spots nicht mehr sichtbar in IR und OCT-Bildern.

Histologische Beurteilung des Retinal Degeneration/Regeneration: um untersuchen, das Ausmaß und die Kinetik der Retinal Degeneration/Regeneration, H & E Färbung zu verschiedenen Zeitpunkten nach Schaden Induktion (Tag 0, 1, 3, 7, 14 eingesetzt wurde und Woche 6) (Abbildung 4). Experimente wurden auf drei Augen von drei Fischen durchgeführt. Jedoch wurde keine statistische Analyse durchgeführt, da dieses Manuskript die Methode demonstrieren soll. Subtile Veränderungen in der nuklearen Innenschicht (INL) und ONL kann gesehen unmittelbar Post-Laser (z. B. leichte Ödeme in den ONL) und reduzierte interzellulären Raum in der INL innerhalb von 60 Minuten nach der Laserbehandlung. Die Degeneration folgte für 6 Wochen nach der Induktion der Laser Verletzungen. Morphologische Veränderungen beobachtet wurden konsequent nach 1 Tag mit Desorganisation des ÖTD und mit einem Hohlraum-Formation in der ONL und in den subretinalen Raum. In der Tat gab es ein Verlust der Kerne innerhalb der ONL in den Schadensbereich zwischen 1 und 7 Tagen. Der maximale PR-Verlust wurde am 3. Tag gefunden. Ab 14 Tage bis 6 Wochen, hatte die äußeren Netzhaut wieder seine normale Morphologie hergestellt.

Glia Beteiligung während Retinal Degeneration/Regeneration: MC-Aktivierung zu verschiedenen Zeitpunkten (Tag 0, 3, 14) zu beurteilen nach der Induktion der Retinal Degeneration, wir für die Gliazelle Marker GS immunhistochemische Analysen durchgeführt und GFAP (Abbildung 5). Experimente wurden wieder auf drei Augen von drei Fischen ohne Quantitative Analyse durchgeführt. GS spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Ebene von extrazellulärem Glutamat und gilt ausschließlich in MC Soma und seine Prozesse19,20ausgedrückt werden. Astroglia ist hochreguliert während der Alterung und wann die Netzhaut beschädigt oder gestresst ist. Es ist lokalisiert in den MC Ende-Füßen und21verarbeitet. Schwache GFAP Ausdruck wurde auch in den inneren Teil der Kennzeichnung anderer glialer Zelltypen, z. B. Astrozyten unverletzt Kontrolle Netzhaut gefunden. Die Autofluoreszenz des PR-Außensegmenten ebenfalls eine Signal in die ONL, aber dies könnte deutlich unterscheiden. Das GFAP Signal war hochreguliert am 3. Tag nach der Verletzung. Dabei Analysen durchgeführt am 3. Tag nach der Laserbehandlung zeigte GFAP-positiven MCs nur innerhalb der Verletzung Aufstellungsort in die ONL der Netzhaut. Ab Tag 14 die Regeneration ist weitgehend abgeschlossen und die GFAP-Signal war herunterreguliert, Grundniveau in den Schadensbereich. Im Gegensatz zu GFAP gab es keine erhebliche Änderung in der Höhe der GS Ausdruck. Aber hätte es eine lokalisierte Herabregulation der GS an der Stelle der Verletzung.

Abbildung 1: Setup für die Induktion der Laser Verletzung der Zebrafisch Netzhaut und nach Analyse der OCT. (A) Anordnung des Lasersystems vor der Behandlung. (A. 1) Zebrafisch auf Silikon-Pin-Halter mit Fundus Kontaktlinse in kurz vor Anwendung des Laserstrahls gelegt. (B) Anordnung der OCT-System vor Bildgebung. (B. 1) Zebrafisch platziert vor 78D Schlitz Lampe Objektiv vor die Erkennung der Schäden Seiten mittels Okt. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Setup für den Erwerb der IR und ÜLG Bilder. (A) Screenshot im Software-Fenster während der Bildgebung. IR und OCT-Modi werden dargestellt. (B) Überblick über das Panel verwendet, um die Bilder zu erwerben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: IR (links) und OCT (rechts) Bilder der Verletzten und unverletzten Stätten der Netzhaut in der gleichen Auge zu anderen Zeitpunkt Punkte (Tage 0, 1, 3, 7, 14 und Woche 6) nach Laser-induzierte Netzhautdegeneration. In den IR-Bildern ein grünes Feld zeigt der Teil der Netzhaut, die analysiert werden und die grüne Linie zeigt die Position der OCT-Bilder auf der Netzhaut. Pfeile zeigen die Standorte der Laser Spots als hyper-reflektierende Signale im Okt. Maßstabsleiste erkannt = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: H & E Färbung des Verletzten und der kontralateralen unverletzt Zebrafisch Auge zu anderen Zeitpunkt Punkte (Tage 0, 1, 3, 7, 14 und Woche 6) nach Laser-induzierte Netzhautdegeneration. GC, Ganglion Zellschicht; INL, nukleare Innenschicht; ONL, nukleare Außenschicht. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: immunhistochemische Nachweis von MC Aktivierung. GFAP (grün) und GS (rot) Färbung in der Verletzten und unverletzten Zebrafisch Netzhaut zu unterschiedlichen Zeit (Tage 0, 3, 14) nach Laser-induzierte Netzhautdegeneration verweist. Das grüne Signal in die ONL ist durch die Autofluoreszenz des PR oUter Segmente. Zellkerne sind mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die Autoren haben nichts preisgeben.