Der Zebrabärbling ist eine beliebte Tiermodell, Mechanismen der retinalen Degeneration/Regeneration bei Wirbeltieren zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um lokalisierte Verletzung die äußeren Netzhaut mit minimaler Beschädigung der inneren Retina stören zu induzieren. Anschließend überwachen wir in Vivo die Netzhaut Morphologie und der Müller Gliazellen Antwort in der gesamten Netzhaut Regeneration.
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Methodenartikel
Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ein faszinierende Unterschied zwischen teleost und Säugetiere ist das lebenslange Potenzial der teleost Netzhaut Netzhaut Neurogenese und Regeneration nach schweren Schäden. Die Regeneration Wege im Zebrafisch untersucht könnte neue Einblicke in innovative Strategien für die Behandlung von degenerativen Erkrankungen der Netzhaut bei Säugetieren bringen. Hierin, konzentrierten wir uns auf die Induktion einer fokalen Läsion an der äußeren Netzhaut in Erwachsenen Zebrafisch mittels einem 532 nm Diodenlaser. Eine lokalisierte Verletzung ermöglicht die Untersuchung biologischer Prozesse, die während retinalen Degeneration und Regeneration direkt auf dem Gelände des Schadens stattfinden. Verwendung von nicht-invasiven optischen Kohärenztomografie (OCT), konnten wir die Position der beschädigte Bereich und Monitor anschließende Regeneration definieren in-vivo. In der Tat produziert OCT-Bildgebung Cross-sectional hochauflösende Bilder der Zebrafisch Netzhaut, Bereitstellung von Informationen, die zuvor nur mit histologischen Analysen verfügbar war. Um die Daten in Echtzeit OCT bestätigen, histologische Abschnitte wurden durchgeführt und regenerative Reaktion nach der Induktion der Netzhaut Verletzung wurde von Immunohistochemistry untersucht.
Einleitung
Vision ist wahrscheinlich der wichtigste Sinn des Menschen und seiner Beeinträchtigung hat eine hohe sozio-ökonomische Auswirkungen. In der industrialisierten Welt entfallen degenerative Netzhauterkrankungen die Mehrheit der Sehbehinderung und Blindheit bei der erwachsenen Bevölkerung1. Retinitis Pigmentosa (RP) ist die häufigste erbliche Ursache für Erblindung bei Menschen im Alter zwischen 20 und 60, Auswirkungen auf etwa 1,5 Millionen Menschen weltweit2,3. Es ist eine heterogene Familie von retinalen Erbkrankheiten durch fortschreitenden Verlust der Photorezeptoren (PRs), gefolgt von....
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Protokoll
alle Experimente der Anweisung für den Einsatz von Tieren in Ophthalmic und Vision Research Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) eingehalten und beachten Sie die damit verbundenen Vorschriften der staatlichen Behörden.
1. Tiere
- pflegen TgBAC (Gfap:gfap-GFP) Zebrafisch 167 (AB) Belastung im Alter von 6-9 Monate unter normalen Bedingungen in Wasser mit einer Temperatur von 26,5 ° C und eine 14/10 h hell/dunkel-Zyklus 18.
- Richtlinien der Tierbetreuung der beteiligten Institutionen für die Tierversuche nach Genehmigung durch die staatlichen Behörden.
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Ergebnisse
Echtzeit-OCT: ein Laser Verletzungen Modell induzieren eine gut abgegrenzte Zone von Schäden in der Netzhaut Zebrafisch verwendet, um die Analyse der Rolle der MCs in retinalen Reparatur. Die Website des Schadens wurde mittels in Vivo OCT zum ersten Mal (Tag 0) innerhalb von 60 Minuten nach der Verletzung (Abbildung 3) abgebildet. Um die Optik des Auges Fisch zu kompensieren, wurde eine maßgeschneiderte Kontaktlinse auf die Hornhaut .......
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Diskussion
Regeneration/Degeneration der Netzhaut in der Zebrabärbling wurde durch verschiedene Ansätze wie Zytotoxin-vermittelte Zelle Tod22, mechanische Verletzungen23und thermische Schädigung24untersucht. Wir beschäftigten 532 nm Diodenlaser die Zebrafisch Netzhaut beschädigen. Unser Modell bietet dabei mehrere Vorteile. Zum Beispiel haben wir schnell einen klar umrissenen Bereich der Verletzung in der äußeren Netzhaut, speziell in der PRs-Schicht lokalisier.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken Martin Zinkernagel, MD, PhD und Miriam Reisenhofer, PhD für ihre wissenschaftlichen Beiträge zur Festsetzung von Modell und Federica Bisignani für ihre hervorragenden technischen Betreuung.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Saure Hämatoxylin-Lösung | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | A07030 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI Eindeckmedium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G wässrige Lösung 0,5% | Carl Roth, Arlesheim, Schweiz | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | 2860 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | 3989 | |
| Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Schweiz | A11008 | |
| Ziegen-Anti-Maus-IgG H& L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Schweiz | A11020 | |
| Ziege Normalserum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel Kontaktlinse | Johnson & Johnson AG, Zug, Schweiz | n.a.1-Day | Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Schweiz | n.a.Methocel | 2% |
| Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | A5040 | Tricain, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Deutschland | n.a.532 | nm Laser |
| Maus monoklonaler Anti-GS-Antikörper | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Deutschland | n.a.Spectralis | |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Deutschland | n.a.Version | 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | P5368 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | P5368 | |
| Kaninchen anti-GFAP polyklonaler Antikörper | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silikonstifthalter | Huco Vision AG Schweiz | n.a.Von | Hand aus Silikonstiftmatte der Sterilisationsschale entsprechend schneiden. |
| Spaltlampe BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Schweiz | n.a.Spaltlampenadapter | |
| Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a.Superfrost | ||
| Plus Glasdias | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Deutschland | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Deutschland | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | P1379 | |
| 78D berührungslose Spaltlampenlinse | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylol | Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz | 534056 | |
| Augenfundus-Laserlinse | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, Vereinigtes Königreich | R2100-EU | Dampfgarer |
Referenzen
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retin....
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Nachdrucke und Genehmigungen
