Summary
斑马鱼是研究脊椎动物视网膜变性/再生机制的流行动物模型。本议定书描述一种方法, 以诱导局部损伤破坏外视网膜, 对内视网膜的损害最小。随后, 我们监测在体内视网膜形态学和 m ü ller 胶质细胞反应在整个视网膜再生。
Abstract
硬和哺乳动物之间的一个奇妙的区别是硬视网膜在严重损伤后的视网膜神经形成和再生的终身潜能。调查斑马鱼的再生途径可能带来新的见解, 以制定创新的策略, 治疗视网膜退行性疾病的哺乳动物。在此, 我们的重点是通过 532 nm 半导体激光器诱导成人斑马鱼外侧视网膜病灶。局部损伤允许对视网膜变性和在损伤区域直接再生的生物过程进行调查。使用无创光学相干断层扫描 (OCT), 我们能够定义受损区域的位置, 并监测后续再生在体内.事实上, OCT 成像产生的高分辨率, 横断面图像的斑马鱼视网膜, 提供的信息, 以前只提供了组织学分析。为了证实 real-time OCT 的数据, 通过免疫组织化学研究视网膜损伤诱导后的组织学切片和再生反应。
Introduction
视力可能是人类最基本的感觉, 它的损害具有很高的社会经济影响。在工业化世界中, 视网膜退行性疾病占成年人群视力丧失和失明的大多数1。视网膜色素变性 (RP) 是最常见的遗传性失明的原因, 在人的年龄之间的20和 60, 影响约150万人在全球范围内2,3。这是一个异构家族遗传性视网膜疾病的特点是逐步丧失的光 (减贫) 后, 视网膜色素上皮变性, 随后, 胶质和重塑内神经元4。疾病的过程可以解释的两个 PR 细胞类型的增量损失, 通常从棒开始, 这是负责的消色差视觉在昏暗的光和锥, 这是必不可少的颜色视觉和视力5。单个基因缺陷足以引起 RP。到目前为止, 超过45基因的130突变已经与疾病6相关。这导致不同的疾病表型, 是一个原因, 基因治疗是 non-generalizable, 从而一个复杂的治疗方法。因此, 迫切需要制定新的一般治疗方法来治疗致盲疾病的视网膜退化。
视网膜变性常涉及 PR 损失;因此, PR 细胞死亡是视网膜退行性过程的标志7。它已经证明, PR 细胞死亡刺激 m ü ller 胶质细胞 (MC) 激活和增殖8。MCs, 在脊椎动物视网膜的主要胶质细胞类型, 曾经被认为只是一个 "胶水" 之间的视网膜神经元。近年来, 许多研究表明, MCs 的作用不仅仅是结构支持9。在不同的功能中, MCs 也参与神经再生和修复10。事实上, 在对变性视网膜的扩散因素的反应中, MCs 显著增加胶质纤维酸性蛋白的表达。因此, 在视网膜损伤和变性11中, 胶质蛋白标签可以作为 MC 活化的标志。
最近, 我们开发了一种新的局灶损伤的适应, 利用激光诱导斑马鱼视网膜变性 (斑马鱼)。局灶性损伤有利于研究某些生物学过程, 如细胞迁移到受伤部位, 以及视网膜再生过程中发生的事件的准确时间12。此外, 由于其视觉系统与其他脊椎动物的相似性, 斑马鱼在视觉研究中已经变得非常重要。人和硬视网膜的大体形态和组织学特征显示出很少的差异。因此, 人类和斑马鱼视网膜包含相同的细胞类组织在同一层模式, 其中感光光占据最外层, 而视网膜投射神经元, 神经节细胞, 居住在最里面神经元层, 近于晶状体。视网膜神经元, 突, 两极, 和水平细胞, 定位在感光细胞和神经节单元层之间13。此外, 斑马鱼视网膜是锥体控制, 因此更接近人的视网膜比, 例如, 密集研究的啮齿动物视网膜。硬和哺乳动物之间的一个奇妙的区别是鱼类视网膜的持续神经再生和损伤后的视网膜重建。在斑马鱼, MCs 能分化和斡旋再生在受伤的视网膜14,15。在鸡肉中, MCs 也有能力重新进入细胞周期和分化。在成年鱼类视网膜损伤后, MCs 采用了祖细胞和干细胞的某些特征, 迁移到受损的视网膜组织, 产生新的神经元16。哺乳动物 mcs 的基因表达谱显示出与视网膜祖细胞有意想不到的相似性, 而在鸡、啮齿动物甚至人类视网膜中, mcs 的内在神经源潜能的证据也在增长17。然而, 为什么鸟类和哺乳动物的再生反应比起鱼类的健壮反应还要低呢？因此, 了解斑马鱼内源性修复机制可能会提出刺激哺乳动物和人类视网膜再生的策略。采用 MCs 内源性修复机制作为治疗视网膜变性患者的治疗工具, 将对我们的社会产生显著的影响。
在此, 我们提供了在眼科研究中使用变性/再生模型的必要步骤。我们首先关注的是诱导感觉神经视网膜的病灶损伤, 然后是在损伤部位发生的事件的成像, 最后是对相邻 MCs 的参与。一般的协议是相对容易执行, 并打开了各种可能性, 评估视网膜后。
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Protocol
所有实验都遵守了在眼科和视力研究协会 (帕特) 视觉研究中使用动物的声明, 并尊重政府当局的相关规定.
1. 动物
- 保持 TgBAC (胶质蛋白: GFP) 斑马鱼 167 (AB) 菌株在水中的标准条件下 6-9 月, 温度为26.5 和 #176; C 和 14/10 h 光/暗循环 18 .
- 经政府当局批准后, 按照有关机构的动物保育准则进行动物实验.
2。可逆全身麻醉
- 准备 3-氨基磺酸乙酯盐 (tricaine) 的库存溶液, 溶解400毫克的 tricaine 粉, 在97.9 毫升的罐水和2.1 毫升的三缓冲盐水 (TBS) 的1米。调整到 ph 值7.0 与 1 M 三 (ph 9) 和存储在4和 #176; C 在黑暗中长达一个月.
注: Tricaine 应在水中准备, 如动物的自然生活条件, 最好使用原池水. - 在油箱水中稀释库存溶液 1:25, 并立即使用.
- 将斑马鱼放入10厘米的培养皿中, 其中含有50毫升的麻醉液, 直到它们变得不动并且不响应外部刺激 (大约 2-5 分钟, 取决于重量和年龄).
- 将每条鱼手工传送到 custom-made 硅胶针架上进行激光处理 ( 图 1A ).
谨慎!鱼可以保持麻醉外的坦克, 只有10分钟. - 在处理和/或成像后进行反向麻醉, 将斑马鱼放在装有水箱水的容器中.
- 为了支持恢复, 通过在水中来回移动斑马鱼, 在鳃上形成新鲜的水箱水.
3。视网膜激光局灶性损伤
注: 532 nm 二极管激光器用于在斑马鱼的视网膜上制造焦光损伤。这种激光的实验装置能够在成年斑马鱼中建立一个可再生的局灶性视网膜损伤.
- 设置激光器的输出功率:70 mW; 天线直径:50 和 #181; m; 脉冲持续时间: 100 毫秒
警告!使用激光光源需要对该区域进行适当的个人保护和标签.
在治疗前, - 在眼部应用 1-2 滴 2% hydroxypropylmethylcellulose, 并使用2.0 毫米眼底激光透镜将激光瞄准光束聚焦在视网膜上.
谨慎!hydroxypropylmethylcellulose 滴是粘性的, 如果它在鳃上, 可能会引起呼吸问题. - 在左眼周围放置四激光光斑, 并使用右、未经处理的眼睛作为内部控制.
4。 在体内 视网膜形态学的影像学
- 0 天, 直接在激光诱导后将斑马鱼视网膜可视化, 而不使其从麻醉中恢复。在所有其他时间点, 使用全身麻醉 (见2节: 可逆全身麻醉)。将固定的斑马鱼放在 custom-made 硅胶针架上 ( 图 1 b, b. 1 )。
- 要获得最佳图像, 请切割一个商业可用的水凝胶隐形眼镜, 以适合斑马鱼眼 (和 #216; = 5.2 毫米, r = 2.70 mm, 中心厚度 = 0.4 mm), 方法是通过打孔。用纤维素填充镜片的凹面, 并将其置于角膜上.
- 为 OCT 系统配备78D 非接触式狭缝灯透镜.
- 将红外线 (ir) 图像聚焦在 ir + OCT 模式 ( 图 2A ) 中, 通过单击和 #34 来可视化眼睛的眼底, 并获取 ir 图片; 获得和 #34; 按钮 ( 图 2B ) 以本地化使用系统和 #39 软件的视网膜上的激光斑点.
- 在 IR + OCT 模式下可视化视网膜图层的三维剖面, 并通过单击 #34、获取和 #34; 按钮 ( 图 2B ) 来获取图片。观察外核层损伤的严重性 (参见3节: 视网膜激光局灶损伤) 在这些图像中.
- 在处理和/或成像后将斑马鱼放在装有水箱水的容器中, 进行反向麻醉.
- 为了支持恢复, 通过在水中来回移动斑马鱼, 在鳃上形成新鲜的水箱水.
- 在1、3、7、14和6周, 在活体 视网膜形态学成像中执行类似 .
5。苏木素和 #38; 曙红 (H 和 #38; E) 染色
- 安乐斑马鱼被浸没到寒冷 (4 和 #176; C) 麻醉溶液在冰上至少10分钟, enucleate 眼睛立即通过小弯曲钳.
- 将4% 甲醛 (粉煤灰) 的全眼固定在4和 #176 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中; C 为20小时, 然后脱水的样品在一个分级酒精系列 (二甲苯100% 为5分钟两次, 乙醇100% 为5分钟两次, 乙醇96% 为3分钟两次, 乙醇 70% 3 min 次).
谨慎!粉煤灰可以刺激眼睛, 鼻子和上呼吸道的轨道。粉煤灰是一种已知的人类致癌物和疑似生殖危险. - 将样品嵌入石蜡切片, 切割5和 #181; m 部分在视神经头的水平, 并安装在玻璃幻灯片上.
- 用0.1% 酸苏木精溶液将 deparaffinized 切片染色5分钟, 然后在蒸馏水中蘸上两次在盐酸混合 (2 毫升 25% HCl 中250毫升蒸馏水) 和氨混合 (2 毫升25% 的氨水) 中的幻灯片。蒸馏水)。染色的部分与曙红 G 水溶液0.5% 为3分钟后, 发展的苏木精染色自来水至少10分钟.
- 在丙烯酸树脂安装介质上安装脱水的幻灯片, 并在光显微镜下观察幻灯片.
6。MC 激活的免疫组织化学作用
- 将抗原检索缓冲区中的 deparaffinized 部分加热 (三-EDTA + 0.05% 非离子洗涤剂, pH 9.0) 3 分钟在适当的蒸笼或微波炉 10-15 分钟和洗涤三次与 TBS 为5每分钟.
- 用硅胶笔圈出部分, 并添加100和 #181; L 阻断溶液 (TBS + 10% 山羊正常血清 + 1% 牛血清白蛋白, pH 7.6) 在室温下为 1 h.
- 染色与 anti-glial 纤维酸性蛋白 (胶质酸) 多克隆抗体和 anti-glutamine 合成酶 (GS) 小鼠单克隆抗体, 都在1:200 稀释 (40 和 #181; L 每样)。在4和 #176 ° C 的湿室中孵育幻灯片。用 TBS + 0.1% 吐温20洗三次, 每次5分钟.
- 用适当的辅助抗体完成可视化。该协议使用山羊兔 igg h 和 #38; 绿色二次抗体和山羊 anti-mouse igg 和 #38; l 亮红色的 GS, 在1:500 稀释在室温下为1小时.
- 装入包含 DAPI 的安装介质的幻灯片, 并在荧光显微镜下观察幻灯片.
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Representative Results
实时 OCT: 为了分析 MCs 在视网膜修复中的作用, 我们使用了一种激光损伤模型, 在斑马鱼视网膜中诱发界定损伤区。损伤部位是在受伤后的60分钟内第一次 (0 天) 用在体内OCT 成像的 (图 3)。为了补偿鱼眼的光学, 在角膜上放置了一个 custom-made 的隐形眼镜。激光治疗后, 一个弥漫性超反射信号被定位到外部视网膜 (箭头)。它从视网膜色素上皮 (RPE) 延伸到外状层 (组织)。1天也可探测到类似的信号。3天后, 这个弥漫的信号变得更有条理和密集。它在外层核层中一直可见, 延伸到感光层。在第一周 (7 天) 之后, 平均病灶大小明显下降, 只有一个小的超反射信号被检测到。从14天开始直到最新的时间点被调查 (星期 6), 激光斑点在 IR 和 OCT 图像不再是可看见的。
视网膜变性/再生的组织学评估: 为了研究视网膜变性/再生的程度和动力学, H 和 #38; E 染色在损伤诱导后的不同时间点被使用 (天 0, 1, 3, 7, 14和6周) (图 4)。对三只三只鱼的眼睛进行了实验。然而, 没有进行统计分析, 因为这份手稿的目的是演示方法。在激光治疗后60分钟内, 内部核层 (INL) 和 post-laser 的细微变化可以立即被看到 (例如,轻度水肿和 INL 细胞间隙减少)。在激光损伤诱导后6周内变性发生。1天后, 随着减贫战略的瓦解和在视网膜空间中的空洞形成, 形态学改变持续观察。事实上, 在1和7天之间的损伤区内, 核中的细胞核丢失了。最大 PR 损失在3天被发现了。从14天到6周, 外部视网膜重建了它的正常形态。
视网膜变性/再生过程中的神经胶质受累: 为了评估在不同时间点 (0、3、14) 的 MC 激活, 我们对胶质细胞标记进行了免疫组化分析, 并胶质蛋白 (图 5)。对三只三只鱼的眼睛进行了实验, 没有进行定量分析。GS 在控制胞外谷氨酸水平方面起着重要的作用, 并被认为是在 MC soma 中完全表达的, 其过程19,20。在衰老和视网膜受损或有压力时, 胶质蛋白上调。它在 MC 端脚中本地化, 并处理21。弱的胶质蛋白表达也发现在未受伤控制的视网膜标签其他胶质细胞类型,例如,星形胶质。PR 外段的自发荧光也提供了一个信号, 但这可以清楚地区分。上调3天后。因此, 在激光治疗后3天进行的分析显示, 只有在视网膜的损伤部位内才会出现胶质纤维阳性的 MCs。从14天, 再生基本上是完整的, 并 downregulated 的胶质细胞信号的基线水平的损害区域。与胶质蛋白不同, GS 表达水平没有显著变化。然而, 在受伤地点可能有局部下调的 GS。
图 1: 对斑马鱼视网膜激光损伤的诱导和 OCT 分析的设置.(A) 在治疗前安排激光系统。(1) 在应用激光束之前, 将斑马鱼置于硅胶针架上, 并放置在眼底接触镜上。(B) 在影像学前安排 OCT 系统。(1) 斑马鱼放置前78D 狭缝灯镜头前, 通过 OCT 检测损伤部位.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 用于获取 IR 和 OCT 图像的设置.(A) 图像中软件窗口的屏幕截图。描述了 IR 和 OCT 模式。(B) 用于获取图像的小组概览。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 激光诱导的视网膜变性后, 在不同时间点 (0、1、3、7、14和6周) 同一眼内视网膜损伤和未受伤部位的 IR (左) 和 OCT (右) 图像.在红外图像中, 绿色方框显示了已被分析的视网膜部分, 绿色的线表明了 OCT 图像在视网膜上的位置。箭头表示在 OCT 中检测到的激光斑点的位置为超反射信号. 缩放栏 = 200 µm.请点击这里查看这个数字的更大版本
图 4: H 和 #38; 在不同时间点 (0、1、3、7、14和6周), 在激光诱导的视网膜变性后, 损伤和对侧未受伤的斑马鱼眼的染色.气相色谱, 节细胞层;INL, 内核层;只有外核层缩放栏 = 50 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: MC 激活的免疫组织化学检测在不同时间点 (0、3、14) 的受损伤和未受伤的斑马鱼视网膜上的胶质纤维 (绿色) 和 GS (红色) 染色, 导致视网膜变性。在唯一的绿色信号是由于荧光的公关 o外段。细胞核被 DAPI (蓝色) 染色。缩放栏 = 50 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
通过毒素介导的细胞死亡22、机械损伤23和热损伤24等不同方法对斑马鱼视网膜再生/变性进行了研究。我们使用了 532 nm 二极管激光器来破坏斑马鱼视网膜。因此, 我们的模型提供了几个优点。例如, 我们迅速建立了一个明确界定的损伤区域, 在外部视网膜, 特别是在减贫战略层。此外, 这种实验装置可以被修改, 以产生较大的损害区域, 以研究其他生物过程, 例如, 破坏赫的膜诱导脉络膜新生血管。有最小的附带损害和再生反应的时间可以精确调整和性。
随着时间的推移, 我们使用海德堡 Spectralis 系统和海德堡眼探险软件型的变化。因此, 在斑马鱼中发现眼底红外显像是特别有用的。与眼底荧光 (AF) 不同的是, 激光光斑与周围区域的对比度较低, 通过红外成像可以更容易地定位受损部位。这使我们能够检测更改并监视在体内的再生, 这在 AF 模式下是不可能的。如前所述25, OCT 可用于监视斑马鱼视网膜的退行性/再生过程。在我们的模型中, 视网膜激光损伤被检测为一个超反射带 (图 3), 这与哺乳动物在26中报告的类似。在再生过程中, 超反射信号下降, 直到14天完全消失。
OCT 图像与在激光病变中看到的形态学变化 (图 4) 相关。OCT 图像中弥漫的超反射信号 (0 天) 代表了斑马鱼在激光治疗后1小时内 INL 的 post-laser 变化。在3天检测到的微妙和界定超反射信号对应于空腔的形成, 由于杆的损耗。从14天开始, OCT 和组织学分析证实, 外视网膜已恢复其正常形态。
在本研究中, 我们也评估了 MC 反应在视网膜再生 (图 5)。许多团体已经研究了胶质细胞的激活, 特别是对 MCs 的活化, 作为对损伤的初始再生反应。更具体地说, 他们建议, 病理生理学 MC 激活可能诱导 MCs 采取干细胞的特点, 提供一个内源性的新功能细胞类型, 可以集成到受损的地区的视网膜27。正如预期的, 我们发现, 视网膜激光损伤刺激 MC 活化, 表明上调的胶质蛋白。实际上, 在后3天内, 明显增加了胶质蛋白的表达, 并仅限于损伤区。从14天开始, 再生很大程度上是完整的, 胶质细胞的信号被 downregulated 到损伤区域的基线水平。因此, 我们已经证明, MCs 发挥积极作用的视网膜重组, 并可能再生, 继受伤。
总之, 激光诱导的视网膜变性/再生模型是一种多用途的工具, 以产生快速和病灶损伤的斑马鱼视网膜和以下再生可以可视化的无侵入 OCT 成像。此外, 我们可以证明, 激光视网膜变性是伴随着 MC 活化, 随后的胶质是逆转后, 再生。然而, 需要对所涉及的细胞类型 (例如,小胶质, 巨噬) 和通路进行详细的研究。可能需要进行关键的修改, 特别是对 MCs 的实时跟踪, 以便更好地了解它们在再生过程中的行为 (例如,从它们在 INL 中的原始位置迁移到外部视网膜, 特别是在减贫战略层中)和它们对 PR 细胞的分化。另外, 光损伤范例可以被用来引起广泛和一致的损失的杆和锥型减贫战略28。然而, 所描述的模型的优势是一个更明确的伤害区域, 其中一个可以研究退化光和活化 MCs 之间的局部相互作用。
总的来说, 我们相信该模型将有助于更好地理解在感官视网膜的退行性/再生过程, 并可能使这些发展与哺乳动物系统的比较。它也可以用来研究先天免疫系统的影响和活性物质的影响。在将来, 人们可以利用这些结果来修改人类视觉系统的退化。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢马丁 Zinkernagel, MD, 博士和仪 Reisenhofer, 博士为她的科学投入建立模型和费德里卡比西纳尼为她出色的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
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