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RGB und spektrale Wurzel Bildgebung für die Pflanze Phänotypisierung und physiologischen Forschung: Versuchsaufbau und Imaging-Protokolle

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DOI:

10.3791/56251

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8. August 2017

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1Division of Agronomy, Department of Crop Sciences, University of Natural Resources and Life Sciences, 2Carinthian Tech Research AG, High Tech Campus Villach, 3Computational Science Center, University of Vienna, 4Simulationswerkstatt

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein experimentelles Protokoll ist für die Beurteilung der Boden gewachsen Pflanze Wurzelsysteme mit RGB und hyperspektralen Bildgebung vorgestellt. Kombination von RGB Bild Zeit Serie mit chemometrischen Informationen aus hyperspektrale scannt optimiert Einblicke in Werk Wurzel Dynamik.

Zusammenfassung

Besseres Verständnis der Pflanze Wurzel Dynamik ist wesentlich zur Verbesserung der Ressourceneffizienz Nutzung landwirtschaftlicher Systeme und erhöhen die Widerstandskraft der Ernte Sorten gegen Umweltbelastungen. Ein experimentelles Protokoll ist für RGB und hyperspektralen Bildgebung des Wurzelsystems vorgestellt. Der Ansatz verwendet Rhizoboxes, wo Pflanzen wachsen in natürlichen Böden über einen längeren Zeitraum voll entwickeltes Wurzelsystem zu beobachten. Experimentelle Einstellungen sind beispielhaft für die Bewertung Rhizobox Pflanzen unter Wasserstress und Untersuchung der Rolle von Wurzeln. Eine RGB-Image-Setup wird für günstige und schnelle Quantifizierung der Wurzelentwicklung im Laufe der Zeit beschrieben. Hyperspektrale Bildgebung verbessert die Segmentierung der Wurzel aus dem Boden-Hintergrund im Vergleich zu RGB-Farbe Schwellwerte. Die besondere Stärke der hyperspektralen Bildgebung ist der Erwerb von chemometrischen Informationen über das Wurzel-Boden-System für funktionales Verständnis. Dies wird mit hoher Auflösung Wasser Content Mapping gezeigt. Spektralen Bildgebung ist jedoch viel komplexer in Bilderfassung, Verarbeitung und Analyse im Vergleich zu den RGB-Ansatz. Eine Kombination beider Methoden kann eine umfassende Bewertung des Wurzelsystems optimieren. Anwendungsbeispiele, die Integration von Wurzel und oberirdische Züge sind für den Kontext der Phänotypisierung und Pflanze physiologischen Pflanzenforschung gegeben. Weitere Verbesserung der Wurzel Bildgebung erhalten Sie durch die Optimierung der Bildqualität RGB mit bessere Ausleuchtung mit verschiedenen Lichtquellen und durch Verlängerung der Bildanalyseverfahren auf Wurzel Zoneneigenschaften von spektralen Daten abzuleiten.

Einleitung

Wurzeln geben mehrere wesentliche Funktionen für Pflanzen wie Lagerung von in sich aufnimmt, Verankerung der terrestrischen Pflanzen im Boden, und Aufnahme und Transport von Wasser und Nährstoffen1. Aus evolutionärer Sicht gilt die Bildung der Wurzel Achsen eine grundlegende Voraussetzung für die Entstehung von Land Pflanzen2. Trotz dieser wichtigen Rolle haben Wurzeln historisch nur eine marginale Position in der biologischen Forschung besetzt. In neuerer Zeit jedoch steigt wissenschaftliches Interesse an der Pflanze-Wurzel-Systeme wie in Abbildung 1.

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Abbildung 1: Relevanz der Wurzel Studien in Pflanzenwissenschaften.
Anzahl der Wurzel Studien im Zusammenhang als Prozentsatz aller veröffentlichten Werk Studien in SCI-Zeitschriften in den letzten Jahrzehnten. Suchergebnis von Scopus mit Schlüsselwörtern "Pflanze" und "Pflanze und Wurzel". Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zwei Hauptgründe können vermutet werden, um die jüngsten Fortschritte in der Wurzel Forschung zugrunde liegen. Erste, terrestrische Vegetation ist häufiger Umweltbelastungen infolge globaler Wandel3ausgesetzt. Im Rahmen der landwirtschaftlichen Pflanzenproduktion wird geschätzt, dass weltweit rund 30 % der landwirtschaftlichen Nutzfläche durch Wasser und Phosphor4,5begrenzt sind. Stressabbau der Ernteerträge sind ein Hauptgrund für erhebliche Ausbeute Lücken, die unteren 50 % der möglichen Produktivität für Rainfed Agrarökosysteme6weltweit geschätzt werden. Neben niedrigen Ressourcenverfügbarkeit ist dies auch schlechte Nutzung Ressourceneffizienz, d.h. ausreichender Kapazität einer Anlage zur verfügbaren Ressourcen7nutzen zusammen. Dies führt zu Verlusten von mobilen Ressourcen wie Nitrat die andere Ökosysteme negativ beeinflussen können. Die aktuelle globale Verwendung Stickstoffeffizienz beläuft sich beispielsweise auf 47 %8. Bessere Ressourcennutzung Effizienz durch verbesserte Managementmethoden und Sorten ist daher von großer Bedeutung sowohl für nachhaltiges Wachstum der landwirtschaftlichen Ausgänge sowie für ökologische Nachhaltigkeit. In diesem Kontext Pflanze Wurzeln gelten eine wichtige Zielgruppe für bessere Ernten und Zuschneiden Systeme9,10.

Ein zweiter wichtiger Hintergrund für das aktuelle Interesse an Pflanzenwurzeln ist technologischer Fortschritt in der Messmethoden. Root-Methoden haben lange von zwei zentralen Herausforderungen eingeschränkt worden: für die Messung der Wurzeln von Pflanzen, die wachsen im Boden isoliert für die Quantifizierung, werden meist durch Waschen11, mussten dabei stören die architektonische Anordnung der Wurzel Achsen. In-Situ -Wurzel-Beobachtung mit Ausgrabung Methoden, dadurch erhalten die natürliche Lage der Wurzeln im Boden, für botanische Beschreibung12verwendet worden. Sie sind sehr zeitaufwendig und somit erfüllen nicht die Anforderungen an den Durchsatz der vergleichende strukturelle funktionelle Wurzelsystem Analyse. Auf der anderen Seite waren Hochdurchsatz-Methoden zur Wurzel Architektur Messung meist erfolgt auf künstliche Medien und für Setzling Pflanzen13 wo die Extrapolation auf die natürlichen Wachstums Umwelt Pflanzen fraglich14.

Der jüngste Boom der Wurzel Forschung ist eng mit der Fortschritt im Bereich der bildgebenden Methoden15verbunden. Imaging-Ansätze in der Wurzel Studien kann grob in drei Typen gruppiert werden. Erstens gibt es hochauflösende 3D Verfahren wie CT und MRT16. Diese Methoden eignen sich Interaktionsprozesse der Pflanzenwurzeln mit dem Boden, zu studieren wie Dürre Xylem Embolie17induziert. In der Regel sind sie vergleichsweise kleine Proben zugewiesen, wo sie detaillierte Beobachtungen erlauben. Ein Vergleich der CT und MRT für unterschiedlich große Töpfe und feinen Wurzel Imaging ist in18vorgesehen. Zweitens gibt es Hochdurchsatz-bildgebenden Methoden19,20. Diese Methoden sind meist basierend auf gemeinsamen 2D RGB Darstellung der Wurzeln wachsen auf künstliche Medien (Gel, Keimung Papier), wo hoher Kontrast ermöglicht vergleichsweise einfache Dissektion zwischen Wurzeln und Hintergrund. Sie eignen sich für hohen Durchsatz Vergleich zwischen Sämling Wurzel Merkmale der verschiedenen Ernte Genotypen unter standardisierten künstlichen wachsenden Bedingungen13. Zwischen diesen beiden Ansätzen werden Rhizobox Methoden: sie verwenden 2D Darstellung der Wurzeln wachsen im Boden über längere Zeit und haben mittleren Durchsatz21,22. Eine aktuelle Herausforderung an (2D) Wurzel Bildgebung soll auch Indikatoren für die Wurzel Funktionalität neben der Beschreibung der Struktur23erfassen.

In der vorliegenden Arbeit präsentieren wir die experimentelle Protokolle für imaging Rhizobox Wurzelsysteme mit (i) eine günstige und einfache maßgeschneiderte RGB bildgebenden Setup und (Ii) ein komplexeres NIR bildgebenden Setup gewachsen. Beispielergebnisse aus diesen zwei Setups werden gezeigt und diskutiert im Zusammenhang mit der Anlage Phänotypisierung und physiologischen Pflanzenforschung.

Protokoll

1. Rhizoboxen für das Pflanzenwachstum

HINWEIS: Das experimentelle System verwendet Rhizoboxen, um Pflanzen zur Wurzelabbildung anzuziehen. Zunächst wird das Design der Boxen und das verwendete Substrat beschrieben, anschließend werden Details zum Befüllungsverfahren gegeben.

  1. Entwurf der Rhizoboxen
    1. Stellen Sie Rhizoboxen (Abbildung 2) her, die aus einer Rückwand und Seitenrahmen aus grauem PVC mit 15 mm Stärke bestehen. Verwenden Sie eine Box-Größe von 300 mm x 1000 mm. Als Frontscheibe dient 6 mm starkes Mineralglas, das mit Metallschienen an den Seitenwänden verschraubt wird.
    2. Bohren Sie drei Löcher in den unteren Rahmen, um ein Abfließen von überschüssigem Wasser zu ermöglichen. Diese Löcher können optional mit Kunststoffschrauben verschlossen werden.
    3. Passt man vor dem Befüllen den Innendurchmesser der Rhizobox (zwischen 10 mm und 30 mm) durch Einsetzen von PC-Mehrwandscheiben an. Für die meisten Kulturpflanzen wird ein Innenabstand von 10 mm empfohlen, um das Gewicht (das Gewicht der Rhizobox ohne Erde beträgt 13,2 kg) des gesamten Systems zu verringern.

Diagramm der Wandstruktur mit PVC, Glas, Mehrwandplatten; Entwurfsentwässerung; beschriftete Abmessungen.
Abbildung 2: Rhizobox-Experimentalsystem und seine Komponenten.
Die linke Abbildung zeigt die Abmessungen einer Rhizobox, die rechte Abbildung ihre einzelnen Komponenten: eine graue PVC-Rückplatte mit Seitenrahmen, eine vordere Mineralglasscheibe, Mehrwandplatten zur Variierung des Innendurchmessers und Metallwinkel zur Befestigung des vorderen Glases am hinteren Fach. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

  1. Substrat
    1. Füllen Sie die Rhizoboxen mit Feldboden (für dieses Experiment: Schlufflehm-Oberboden eines kalkhaltigen Chernozems), der auf eine Korngröße von 2 mm gesiebt wurde.
    2. Öffnen Sie die Rhizoboxen, um das Substrat in die innere Kammer (Rückplatte mit Seitenrahmen) in horizontaler Position einzufüllen, wobei vorbenetztes Substrat verwendet wird. Füllen Sie horizontal, um Schichtung und Trennung zwischen feinen und groben Partikeln zu vermeiden, die auftreten kann, wenn das Substrat in senkrechter Position durch die obere Öffnung eingefüllt wird.
    3. Benetzen Sie das Substrat vor dem Befüllen. Überschreiten Sie je nach Substrattyp (insbesondere bezüglich seines Schluff- und Tonanteils) einen Wassergehalt von 0,12–0,18 cm3*cm-3 nicht, um Verschmierung und Strukturdegradation zu vermeiden. Fügen Sie die Differenz zwischen dem vorab eingemischten und dem Ziel-Wassergehalt nach dem Befüllen des Substrats in die Rhizoboxen hinzu.
      HINWEIS: Das Befüllen mit (im Ofen-)trockenem Substrat und die anschließende Zugabe des gesamten Wassers wird nicht empfohlen, da dies zu starker Setzung des Substrats und zur Bildung großer Risse führen kann.
  2. Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Befüllen
    1. Legen Sie den Ziel-Wassergehalt fest. Hier wird er zunächst auf 80 % pflanzenverfügbares Wasser (PAW) gesetzt, bei dem Pflanzen keinerlei Wassermangel erleiden.
    2. Bestimmen Sie die Feldkapazität (FC) und die ständige Welkepunkt (PWP) des Substrats. Ermitteln Sie hierzu FC mithilfe eines PVC-Rohrs mit gleicher Höhe (100 cm) wie die Rhizoboxen.
      1. Schließen Sie das Rohr unten mit einem Stopfen, der kleine Drainagelöcher aufweist, geben Sie 1 cm Kies hinzu, um eine Verstopfung der Löcher durch feineres Substrat zu verhindern, und füllen Sie das Substrat mit derselben Schüttdichte wie bei den Rhizoboxen (1,3 g cm-3) auf.
      2. Sättigen Sie das Rohr mit Wasser, bis Drainage einsetzt, und lassen Sie es zwei Tage zur Gleichgewichtseinstellung ruhen (der resultierende Wassergehalt entspricht per Definition der Feldkapazität), wobei Sie die obere Öffnung mit Frischhaltefolie abdecken, um Verdunstung zu vermeiden. Der bei diesem Boden erreichte FC-Wert betrug in diesem Experiment 0,357 cm3 cm-3.
        HINWEIS: Der Wassergehalt am PWP muss im Voraus aus standardmäßigen bodenphysikalischen Methoden (z. B. Druckplattenmessungen24) oder aus texturbasierten Pedotransferfunktionen25 bekannt sein. Hier beträgt er für den verwendeten Boden 0,12 cm3 cm-3.
      3. Wenn FC ebenfalls mittels Druckplattenextraktion gemessen wird, verwenden Sie den Wassergehalt bei einem Matrixpotential von h = -100 hPa und nicht h = -330 hPa, um der Geometrie der Rhizoboxen (Höhe von 100 cm = 100 hPa) Rechnung zu tragen.
      4. Berechnen Sie den Wassergehalt (WC) bei 80 % PAW: WC (cm3 cm-3) = 0,80 (FC-PWP) + PWP. Für die hydraulischen Grenzwerte des hier verwendeten Bodens ergibt sich ein volumetrischer Wassergehalt bei 80 % PAW von 0,31 cm3 cm-3.
      5. Berechnen Sie die Wassermenge für ein Rhizoboxvolumen von 2850 cm3 (30 cm Breite, 1 cm Innendicke, 95 cm Höhe, wobei die oberen 5 cm zur Bewässerung frei bleiben). Dies ergibt ein Wasservolumen von 883,5 cm3, was bei einer Dichte von Wasser von 1,0 g cm-3 bei 20 °C 883,5 g entspricht.
    3. Legen Sie die Schüttdichte (db) fest, mit der die Rhizoboxen befüllt werden sollen. Hier wird ein Wert von 1,3 g cm-3 gewählt, was typischen Werten in landwirtschaftlichen Feldböden entspricht. Die Menge an trockenem Substrat, die benötigt wird, um ein Rhizoboxvolumen von 2850 cm3 bei dieser db zu füllen, beträgt 3705 g trockenen Bodens.
    4. Benetzen Sie den trockenen Boden auf einen gravimetrischen Wassergehalt von 0,108 g g-1 (entspricht einem volumetrischen Wassergehalt von 0,14 cm3 cm-3), indem Sie 400 g Wasser zu 3705 g trockenem Boden hinzufügen und vorsichtig mischen, um eine homogene Wasserverteilung zu erzielen. Zerstören Sie manuell größere Aggregate, um die Korngröße ≤ 2 mm zu halten.
    5. Füllen Sie den vorbenetzten Boden in die geöffneten Rhizoboxen und verdichten Sie ihn vorsichtig mithilfe einer Polystyrolplatte (30 x 10 x 1,5 cm), die den inneren Raum der Box abdeckt, wodurch eine homogene db von 1,3 g cm-3 erreicht wird.
    6. Fügen Sie die verbleibende Wassermenge (483,2 g) hinzu, um den Ziel-Wassergehalt von 0,31 cm3 cm-3 zu erreichen, indem Sie sie mit einer Sprühflasche auf die Oberfläche aufsprühen. Achten Sie auf kleine Tröpfchengröße, um Oberflächenstrukturschäden und eine homogene Benetzung zu vermeiden. Stellen Sie die Box während des Sprühens auf eine Waage, um die tatsächlich zugeführte Wassermenge zu überwachen.
    7. Lassen Sie das Wasser 10 Minuten lang umverteilen, drücken Sie dann das Glas auf die Oberfläche und befestigen Sie es mit den seitlichen Metallschienen. Das durchschnittliche Endgewicht der Rhizoboxen mit befeuchtetem Substrat betrug 17818 ± 68 g (13230 g Gewicht der Rhizobox + 3705 g trockener Boden + 883 g Wasser).
      HINWEIS: Der homogene Wassergehalt, der in die horizontalen Boxen eingefüllt wurde, wird sich umverteilen, sobald die Boxen in ihre endgültige Position gebracht werden, entsprechend dem resultierenden Potentialgradienten. Dies ist ein physikalischer Prozess in allen Pflanzenwachstumstöpfen entsprechend ihrer Geometrie (Höhe), und die Experimentatoren sollten sich der hydraulischen Bedingungen in ihren Töpfen bewusst sein26.

2. Einrichtung des Klimaraums

  1. Statten Sie den Klimaraum (Abbildung 3) mit 8 LED-Lampen aus, die eine homogene Beleuchtung von 450 μmol m-2 s-1 mit spektralen Spitzen bei 440 (blau) und 660 (rot) nm für ein optimales Pflanzenwachstum bereitstellen.

Diagramm des Pflanzenstressversuchs; LED-Anordnung, Wetterstation, Stomatale Leitfähigkeit, Dampfdefizitdiagramm.
Abbildung 3: Klimakammer mit Rhizoboxen für den Stressversuch.
(A) Ansicht von links der gesamten Kammer mit LED-Beleuchtung, Wetterstation und PC (hier zur Aufzeichnung der Blatthygrometer); Ansicht von rechts mit einer Nahaufnahme des Metallgestells, das die Rhizoboxen in einem Neigungswinkel von 45 ° hält, sowie der Holzplatten, die verwendet werden, um das Glasfenster der Rhizoboxen vor Lichteinfall abzuschirmen. (B) Stressversuch mit Zuckerrüben, der vier Stadien kombiniert, in denen Stress durch unterschiedliche atmosphärische Verdunstungsanforderungen (hoch/niedrig) und Bodenwasserverfügbarkeit (hoch/niedrig) verursacht wird. Die grünen Balken der mittleren stomatalen Leitfähigkeit geben einen Hinweis auf die Stressreaktion der Pflanzen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

  1. Stellen Sie die Umgebungsparameter gemäß den Anforderungen der Pflanze bzw. des Experiments ein. Verwenden Sie hierfür eine Beleuchtungsdauer von 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit. Während der Etablierungsphase der Pflanzen und vor Beginn der Stressbehandlungen die Temperatur auf 20 °C tagsüber und 15 °C nachts einstellen und die relative Luftfeuchtigkeit bei 50 ± 8 % halten.
  2. Platzieren Sie die Rhizoboxen mithilfe eines geeigneten Metallgestells in einem Winkel von 45°. Dadurch wird aufgrund der Gravitropie das Wurzelwachstum in Richtung der Glasoberfläche maximiert.
  3. Bedecken Sie das Glassichtfenster mit einer Holzplatte, um den Wurzelbereich im Dunkeln zu halten und das Algenwachstum durch Lichteinfall durch die Glasoberfläche zu verhindern.

3. Beispielanordnung und Behandlungen an Zuckerrüben

  1. Keimen Sie Zuckerrübensamen drei Tage lang auf feuchtem Filterpapier bei 20 °C im Inkubator vor, bis die Radikel austreten. Dadurch wird sichergestellt, dass nur lebensfähige Pflanzen ausgesät werden.
    ANMERKUNG: Eine Vorkeimung ist bei Samen mit hoher Keimkraft nicht erforderlich, wodurch das Risiko einer Beschädigung der Radikel beim Aussäen vermieden wird. Bei Zuckerrübensamen mit dickem Perikarp ist jedoch das Risiko nicht lebensfähiger Samen hoch, und die Vorkeimung beschleunigt im Vergleich zur direkten Aussaat im Boden den Austrieb der Radikel erheblich.
  2. Bohren Sie mit einem Schraubendreher ein kleines Loch bis zu einer Tiefe von etwa 1,5 cm in die Mitte der Rhizobox, platzieren Sie mithilfe einer Pinzette ein Samenkorn mit der Radikel nach unten und direkt neben das Glasscheibenfenster (dies verbessert die erste Sichtbarkeit) und bedecken Sie es vorsichtig mit Erde.
  3. Bringen Sie eine 0,5 cm dicke Schicht feinen Kieses (2–4 mm) auf der Bodenoberfläche an, um die Bodenaggregate vor Zerfall während der Bewässerung zu schützen und Verdunstungsverluste zu verringern. Um das Auflaufen zu erleichtern, halten Sie die Bodenoberfläche im Bereich der Samenposition kiesfrei.
  4. Geben Sie 10 g Wasser hinzu, um die Etablierung zu fördern.
  5. Während der Etablierungs- und frühen Wachstumsphase bis zum Beginn der experimentellen Stressbehandlungen bewässern Sie die Rhizoboxen alle 2–4 Tage, um den anfänglichen Feuchtegehalt von 80 % PAW beizubehalten.
    1. Bestimmen Sie die erforderliche Menge an Bewässerungswasser, indem Sie die Rhizoboxen wiegen und Wasser hinzufügen, bis das anfängliche Gewicht jeder einzelnen Box erreicht ist. Verwenden Sie bei manueller Bewässerung eine Pipette, um eine Zerstörung der Oberflächenstruktur während des Gießens zu vermeiden.
  6. Ordnen Sie die Rhizoboxen gemäß dem festgelegten Versuchsdesign im Klimaraum an. Das hier beschriebene Protokoll basiert auf einem Experiment mit sechs Zuckerrübensorten in fünf Wiederholungen nach einem vollständig randomisierten Design (CRD).
    1. Verändern Sie die Position der Rhizoboxen jedes Mal, wenn Sie sie aus der Metallhalterung nehmen, um sie zu wiegen und zu bewässern. Dadurch werden mögliche Effekte durch verbleibende (Licht-)Inhomogenitäten im Klimaraum vermieden.
  7. Legen Sie den Zeitpunkt für den Beginn der Stressbehandlungen und die Art des Stresses fest. Die folgenden Einstellungen (Abbildung 4) werden hier verwendet.
    1. Beginnen Sie die Messungen im BBCH-Stadium 15 (fünf entfaltete Blätter), wenn die Wurzeln etwa 75 % der Rhizoboxtiefe bedecken und die Blattkrone ausreichend entwickelt ist, um Blattmessungen durchzuführen. Halten Sie jedes Stadium mindestens drei Tage lang aufrecht, um eine Anpassung an die neuen Bedingungen sicherzustellen, und führen Sie die Messungen durch.
    2. Behalten Sie für die Beobachtungen unter Nicht-Stress-Bedingungen die anfänglichen Einstellungen bei, mit optimaler Bodenfeuchte (80 % PAW) und Umgebungsbedingungen (20 °C/15 °C Temperatur, 50 ± 8 % rH), was einem täglichen Dampfdruckdefizit (VPD) von 1,28 ± 0,1 kPa entspricht (vergl. Abbildung 3 C).
    3. Erhöhen Sie die atmosphärische Nachfrage auf ein Tages-VPD von 2,45 ± 0,4 kPa, indem Sie die Temperatur auf 27 °C/20 °C erhöhen und die rH auf 35 % senken, während die Bodenfeuchte bei 80 % PAW bleibt.
    4. Trocknen Sie die Rhizoboxen anschließend durch Unterlassen der Bewässerung auf 40 % PAW ab, was einem Wassergehalt von 0,215 cm3 cm-3 entspricht. Stellen Sie die anfänglichen Umgebungsbedingungen mit geringer atmosphärischer Nachfrage (VPD von 1,28 kPa) wieder her.
    5. Kombinieren Sie die Stressbedingungen, indem Sie die atmosphärische Nachfrage auf ein VPD von 2,45 kPa erhöhen und die Bodenfeuchte bei 40 % PAW halten.

4. Methoden zur Wurzelabbildung

  1. Kombinieren Sie bildgebende Verfahren, um deren jeweilige Vorteile zu nutzen, abhängig von den angestrebten Informationen.
    1. Wenden Sie RGB-Bildgebung im sichtbaren (VIS-)Bereich an, um das Wurzelwachstum, die Architektur und die Morphologie über die Zeit zu verfolgen, was indirekt häufige Messungen erfordert. Vorteile der RGB-Bildgebung sind (i) geringe Kosten, (ii) schnelle Bildaufnahme, (iii) geringer Speicherbedarf auf Festplatten (Bildgröße: 48 MB) und (iv) hohe Auflösung (3648 x 5472 Pixel).
    2. Verwenden Sie die hyperspektrale Bildgebung (HSI) im Nahinfrarot-(NIR-)Bereich, wenn chemometrische Merkmale von Wurzeln und Boden benötigt werden. Vorteile sind (i) spektrale Merkmale zur Segmentierung zwischen Wurzeln und Bodenhintergrund sowie (ii) Zugang zu physikalisch-chemischen Systemeigenschaften (z. B. Bodenwassergehalt, Wurzelalter). Nachteile sind (i) längere Abtastzeit (etwa 16 Minuten pro Rhizobox), (ii) große Datensatzgrößen (13,7 GB pro Rhizobox-Bild), (iii) geringere Auflösung der NIR-Kamera (320 x 256 Pixel) und (iv) höhere Komplexität der Datenanalyse.
  2. RGB-Wurzelbildgebung
    1. Verwenden Sie eine Bildbox (Abbildung 4), die vor Umgebungslicht abschirmt und die Kameraposition fixiert, bestehend aus einem Metallgestell mit einer Breite von 1 m und einer Höhe von 1 m, wobei die Seitenwände mit Pressplatten ausgekleidet sind. Befestigen Sie die Kamera an der Vorderseite an zwei Positionen in einem Abstand von 80 cm zur Rhizobox.
      1. Befestigen Sie ein Maßband mit transparentem Klebeband am Rhizobox-Rahmen und positionieren Sie die Rhizobox im Halter der Bildbox.
      2. Beleuchten Sie die Rhizobox mit vier 24-W-Fluoreszenzröhren, die in einem Abstand von 80 cm zur Rhizobox angebracht sind. Montieren Sie zusätzlich vier 15-W-UV-Röhren in 20 cm Abstand zur Rhizobox als alternative Beleuchtung unter Nutzung der Eigenfluoreszenz der Wurzeln, falls ein geringer Kontrast zwischen Wurzel und (hellfarbigem) Substrathintergrund vorliegt.
      3. Nehmen Sie zwei Bilder (obere und untere Position) auf, um die obere und untere Hälfte einer Rhizobox mit einer Überlappung von etwa 3 cm abzudecken.
    2. Nehmen Sie RGB-Bilder mit einer digitalen Spiegelreflexkamera auf, die mittels Schnellwechselplatten an den jeweiligen Positionen der Bildbox fixiert ist.
      1. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen bei Nutzung der Fluoreszenzröhren. Passen Sie diese Beispielwerte bei Änderungen der Abmessungen, der Beleuchtung oder des Kameramodells entsprechend an.
        1. Schalten Sie Autofokus und Bildstabilisierung am Kameraobjektiv aus. Stellen Sie die Kamera auf manuellen Modus.
        2. Stellen Sie die ISO-Empfindlichkeit auf 500. Stellen Sie die Verschlusszeit auf 13. Stellen Sie die Blende auf 5,6.
        3. Schalten Sie die Spiegelvorauslösung aus. Stellen Sie den Weißabgleich auf Automatischen Weißabgleich.
      2. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen bei Beleuchtung mit UV-Röhren:
        1. Schalten Sie Autofokus und Bildstabilisierung am Kameraobjektiv aus. Stellen Sie die Kamera auf manuellen Modus.
        2. Stellen Sie die ISO-Empfindlichkeit auf 1000. Stellen Sie die Verschlusszeit auf 13. Stellen Sie die Blende auf 5,6.
        3. Schalten Sie die Spiegelvorauslösung aus. Stellen Sie den Weißabgleich auf Fluoreszenz.
    3. Kombinieren Sie die RGB-Bilder von oben und unten der Rhizobox zu einem einzigen Bild mithilfe eines Bildbearbeitungsprogramms (z. B. Adobe Photoshop). Nutzen Sie das Maßband am Seitenrahmen der Rhizobox und kontrollieren Sie überlappende Objekte (Wurzeln und Bodenmerkmale).
      1. Kopieren Sie die beiden separaten Bilder, jedes mit einer Pixelgröße von 3648 x 5472, in eine neue Datei mit einer Größe von 3648 x 10944 Pixeln und weißem Hintergrund.
      2. Reduzieren Sie die Deckkraft einer Ebene auf 60 % und richten Sie die überlappenden Bildteile (Maßband, Objekte) aus. Stellen Sie danach die Deckkraft der Ebene wieder auf 100 %.
      3. Fügen Sie anhand des Lineals auf dem Bild zwei rote Linien mit genau 1 cm Länge an den oberen Bildrand hinzu, wo keine Wurzeln vorhanden sind. Diese Linien dienen später bei der Bildanalyse zur Skalierung des Bildes auf korrekte Längenmaße.
      4. Vereinigen Sie alle Ebenen und entfernen Sie mithilfe des Zuschneidewerkzeugs Bildteile außerhalb des mit Erde gefüllten Fensters.
      5. Speichern Sie das Bild als TIFF-Datei für die weitere Analyse.
      6. Falls Bilder mit UV-Beleuchtung vorliegen, reduzieren Sie vor dem Speichern die Farben auf Graustufen, indem Sie im Menü Anpassungen-Schwarz & Weiß den vordefinierten Filter Hochkontrast Blau auswählen.
    4. Verwenden Sie eine beliebige Wurzelanalyse-Software (siehe www.plant-image-analysis.org für verfügbare Tools) zur Segmentierung zwischen Wurzeln und Bodenhintergrund sowie zur Quantifizierung gewünschter Wurzelmerkmale (z. B. Länge, Oberfläche, Durchmesser, Verzweigung). Hier wird WinRhizo verwendet.
      1. Öffnen Sie das Rhizobox-TIFF-Bild in der Software.
      2. Kalibrieren Sie den Längenmaßstab des Bildes mithilfe der hinzugefügten Skalierungsstriche.
      3. Wählen Sie im Analysemenü Nach Farbe und dort Unterscheidung Wurzel & Hintergrund.
      4. Erstellen Sie eine Kalibrierungsdatei mit Farbklassen, die Wurzeln und Boden (Hintergrund) entsprechen. Für die hier verwendeten Beispielbilder (vergleiche Abbildung 8) werden drei Wurzelfarbklassen (alte Seitentriebe, junge Seitentriebe, Pfahlwurzel) und drei Bodenfarbklassen definiert.
      5. Für Graustufenbilder (UV-Beleuchtung) wählen Sie (i) Nach Grauwerten und (ii) Blaße Wurzel auf schwarzem Hintergrund im Menü Unterscheidung Wurzel & Hintergrund und verwenden Sie einen lokalen Lagarde-Intensitätsschwellwert für die Segmentierung.
      6. Öffnen Sie eine Datendatei, in der die Ergebnisse gespeichert werden.
      7. Führen Sie die Analyse durch und prüfen Sie anschließend, ob Bereiche (z. B. an den Rändern) falsch zugeordnet wurden. Definieren Sie in diesem Fall einen Ausschlussbereich und starten Sie die Analyse erneut. Für nicht klassifizierte Wurzeln fügen Sie zusätzliche Farbklassen hinzu und starten die Analyse erneut. Für Elemente, die fälschlicherweise als Wurzeln klassifiziert wurden, aktivieren bzw. verstärken Sie die Filteroptionen Trümmer & raue Kanten.

Aufbau zur Pflanzenbildgebung mit UV- und Halogenlampen; Halterung für Rhizoboxen, Kamerahalterungen zur Wurzel- und Kronenanalyse
Abbildung 4: Bildgebungskammer zur Aufnahme von RGB-Bildern von Rhizoboxen.
Ansicht von links der Vorderseite, an der die Rhizoboxen zur Bildaufnahme mit integrierten Lichtquellen befestigt sind; Ansicht von rechts der Rückseite, an der die Kamera montiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

  1. Hyperspektrale Wurzelabbildung
    1. Hardware-Setup
      1. Verwenden Sie ein hyperspektrales Wurzelabbildungssystem (Abbildung 5), bestehend aus (i) einer thermo-elektrisch gekühlten 14-Bit monochromen NIR-Kamera mit einem Spektralbereich von 900 nm bis 1700 nm, 320 mal 256 Pixeln und einer Bildrate von 100 Hz sowie (ii) einem Imaging-Spektrografen mit einem Spektralbereich von 900 nm bis 2500 nm und einer spektralen Auflösung von 3,6 nm. Ordnen Sie eine Halogen-Linieneinstrahlungsquelle (vier 50-W-Halogenspots) in einer 45°/-45°-Geometrie an. Befestigen Sie den Bildsensor an einem zweiachsigen Positioniersystem. Das Scan-Fenster hat eine Größe von 240 × 1000 mm, d. h. jeweils 30 mm an jeder Kante der Rhizobox werden nicht durch das Bild erfasst.
      2. Steuern Sie das System über ein Matlab-Skript für (i) die Aufnahme von Weiß- und Dunkelstandards, (ii) die Einstellung der Integrationszeit der Kamera, (iii) die Auswahl der räumlichen (Pixelgröße 0,1 mm; Pixelgröße 1,0 mm) und spektralen Auflösung (alle 222 spektralen Bänder mit einer Auflösung von 3,6 nm; geglättetes Spektrum mit 54 Bändern und einer Auflösung von 14,8 nm) sowie (iv) die Definition des Scanbereichs auf der Rhizobox.
      3. Speichern Sie die Bilder als SIF-Dateien. Um Probleme beim Speichern großer Dateien zu vermeiden, unterteilen Sie jeden gescannten Bildstrich (9 Striche pro Rhizobox) in vier Segmente (drei mit einer Länge von 300 mm, eines mit einer Länge von 100 mm) und speichern Sie diese separat mit einem eindeutigen Dateinamen, bestehend aus Strichnummer (1 bis 9), Teil (1 bis 4) sowie Datum und Uhrzeit (JJJJ.MM.TT HH:MM:SS). Ein vollständiger Rhizobox-Scan benötigt einen Festplattenspeicherplatz von 13,7 GB.
    2. Bildaufnahme und -analyse.
      HINWEIS: Abbildung 6 zeigt die Schritte der Bildaufnahme, Segmentierung und Analyse.
      1. Die Bildaufnahme umfasst die Auswahl der Kameraeinstellungen für optimale Bildqualität und die Definition der Scanparameter.
        1. Bestimmen Sie die Integrationszeiten der Kamera für den Rhizobox-Scan und den Weißstandard in der Kamera-Software.
          1. Öffnen Sie die Imaging-GUI und bewegen Sie die Kamera an eine Position der Rhizobox, an der Wurzeln vorhanden sind.
          2. Passen Sie die Integrationszeit der Kamera so an, dass ein helles Objekt (d. h. Wurzel) etwa 85 % des vollen dynamischen Bereichs der Kamera im vom Software angezeigten Histogramm ausnutzt. Wiederholen Sie dies für den Weißstandard, indem Sie das Kamera-Positioniersystem so bewegen, dass der Weißstandard im Fokus liegt. Schließen Sie danach die Kamera-Software.
        2. Öffnen Sie die Matlab Imaging-GUI und treffen Sie alle Einstellungen für den aktuellen Rhizobox-Scan. Für die hier berichteten Daten verwenden Sie folgende Einstellungen:
          Integrationszeit Weißstandard: 1000
          Integrationszeit Rhizobox: 4000
          Spektrale Auflösung: Volle Auflösung (d. h. 222 schmalbandige spektrale Bänder)
          Volle räumliche Auflösung (Pixelgröße von 0,1 mm)
          1. Nehmen Sie vor jedem Aufnahmedurchlauf den Dunkel- und Weißstandard auf, z. B. einmal täglich. Der Dunkelstandard repräsentiert das Kamerarauschen, während der Weißstandard die maximale Reflektivität angibt. Diese Daten sind für die Bildnormalisierung während der Vorverarbeitung erforderlich.
          2. Legen Sie fest, ob die gesamte Rhizobox oder nur ein Teil davon gescannt wird. Im vorliegenden Fall werden vollständige Rhizoboxen abgebildet. Starten Sie anschließend den Scan.
      2. Verarbeiten Sie das Bild mit einem Matlab-Skript. Die vom Skript durchgeführten Operationen werden beschrieben.
        HINWEIS: Die Skripte liegen derzeit in einer unkommentierten Version vor und können vom korrespondierenden Autor bezogen werden. Nach ordnungsgemäßer Dokumentation werden sie zum Download auf der Website der Institution des korrespondierenden Autors verfügbar sein (www.dnw.boku.ac.at/pb/).
        1. Setzen Sie einen gesamten Bildstrich aus der Rhizoboxmitte (mit Wurzeln) zusammen, indem Sie die vier Teile des Strichs verschmelzen.
          HINWEIS: An diesem Punkt ist es weder notwendig noch empfehlenswert, ein spektrales Bild einer gesamten Rhizobox (d. h. alle 9 Striche) zu verwenden, da die Dateigröße jeden Berechnungsschritt in Matlab sehr zeitaufwändig machen würde; die Informationen eines zentralen Strichs reichen für die ersten Schritte der Bildanalyse aus.
        2. Normalisieren Sie das Bild unter Verwendung der aufgenommenen Dunkel- und Weißstandards und berücksichtigen Sie dabei die unterschiedlichen Integrationszeiten von Weißstandard und Rhizobox-Scans, die automatisch während des Scans in einer Datei gespeichert werden.
        3. Optional: Wenden Sie einen Glättungsfilter an, um Rauschen aus dem Bild zu entfernen. Das Skript bietet derzeit einen 3×3-Kernel-Medianfilter und eine mehrfache Streukorrektur an. Für die hier präsentierte Bildauswertung werden keine Filter angewendet.
        4. Zeigen Sie das Bild in allen aufgezeichneten spektralen Bändern an, um einen ersten Überblick zu erhalten, und entscheiden Sie sich für eine Wellenlänge, die zur Auswahl von Interessenbereichen angezeigt werden soll (cf. Bildsegmentierung).
      3. Führen Sie die Segmentierung zwischen Wurzeln und Bodenhintergrund in einem separaten Skript mit den folgenden Schritten durch.
        1. Wählen Sie Interessenbereiche (ROI) für Wurzel und Boden, um spektrale Merkmale für die Segmentierung zu finden. Verwenden Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug, um einen ROI auf dem Bild bei einer zuvor identifizierten Wellenlänge mit gutem Kontrast zwischen Wurzeln und Boden zu markieren. Verwenden Sie hier drei ROIs an der Wurzel (alte und junge Seitenwurzeln, Pfahlwurzel) und zwei ROIs im Boden (trockene, feuchte Region).
        2. Zeigen Sie ein Rechteck mit den ausgewählten ROIs und dem verbleibenden Teil als schwarze Maske an und visualisieren Sie das ausgewählte ROI-Bild bei allen Wellenlängen.
        3. Entfernen Sie alle Zeilen in der Bildmatrix, die Pixel mit spektraler Intensität = 0 (schwarze Pixel) enthalten.
        4. Vereinigen Sie die Wurzel- und Boden-ROIs in eine Vordergrundmatrix (Wurzel) und eine Hintergrundmatrix (Boden) für die Segmentierung.
        5. Suchen Sie spektrale Bänder (Intensität einzelner Spektren oder spektrale Verhältnisse), die die beste Trennung zwischen Wurzel-Vordergrund und Boden-Hintergrund liefern27. Quantifizieren Sie den Unterschied zwischen den resultierenden Pixelhistogrammen für Wurzel und Boden mithilfe des Bhattacharyya-Abstands28.
        6. Wählen Sie einen Schwellenwert für die Intensität, der die Histogramme trennt.
        7. Erstellen Sie ein binäres Bild, indem Sie den ausgewählten Schwellenwert auf das Originalbild anwenden. Dadurch werden alle Pixel mit geringerer Intensität als der Schwellenwert auf null und alle mit höherer Intensität auf eins gesetzt (dies erfolgt automatisch durch das Skript).
        8. Speichern Sie das binäre Bild als TIFF-Datei.
      4. Öffnen Sie das binäre Bild und analysieren Sie Wurzelmerkmale. Wählen Sie (i) Basiert auf Graustufen und (ii) Bleiche Wurzel auf schwarzem Hintergrund im Menü Unterscheidung Wurzel & Hintergrund und verwenden Sie globale Intensitätsschwelle (das Bild ist bereits binarisiert).
      5. Um den Wassergehalt aus den hyperspektralen Daten abzuleiten, erstellen Sie einen Kalibrierungsdatensatz und wenden Sie eine Kalibrierungsgleichung auf ein Rhizobox-Bild an.
        1. Unterteilen Sie eine Rhizobox mithilfe von Polystyrolplatten in 5 cm große Fächer, um diese mit Boden (gleicher Substrat und db wie im Experiment verwendet) bei unterschiedlichem Wassergehalt zu befüllen (Abbildung 8).
        2. Berechnen Sie die jeweiligen Wassermengen, die mit dem Boden gemischt werden sollen, und füllen Sie die Fächer (gleiches Verfahren wie in 1.3. für die gesamte Rhizobox beschrieben).
        3. Scannen Sie die Kalibrierungs-Rhizobox mit denselben Einstellungen wie die bepflanzten Rhizoboxen.
        4. Führen Sie die folgenden Schritte mithilfe eines Skripts durch.
          1. Vereinigen Sie die vier Teile eines Strichs aus der Wasser-Kalibrierungsbox zu einem Strich und normalisieren Sie diesen mit Dunkel- und Weißstandards.
          2. Wählen Sie rechteckige Bereiche in jedem Fach mit unterschiedlichem Wassergehalt aus und speichern Sie diese in einem Struktur-Array.
          3. Bestimmen Sie das spektrale Merkmal, das die Fächer mit unterschiedlichem Wassergehalt am besten trennt. Dies erfolgt mithilfe eines Suchalgorithmus für das globale Maximum der Intensitätsunterschiede zwischen den Mittelwerten der Spektren benachbarter Wassergehalte.
          4. Berechnen Sie den mittleren spektralen Intensitätswert für dieses Merkmal für jedes Wassergehaltsfach der Kalibrierungs-Rhizobox.
          5. Passen Sie eine Regressionsgleichung durch die direkt gemessenen Wassergehalte und die jeweiligen spektralen Quantifizierer an.
          6. Wenden Sie die Regressionsgleichung auf jedes Pixel, das nicht als Wurzel klassifiziert wurde, auf einem Rhizobox-Bild und für das oben bestimmte spektrale Merkmal (Band) an, das am besten mit dem Wassergehalt korreliert.

Aufbau des Spektrografen für die optische Analyse; Halogenbeleuchtung, Rhizobox, Energie-/Bewegungssteuereinheit.
Abbildung 5: Hyperspektraler Wurzelscanner.
Die Hauptkomponenten des Scanners sind gekennzeichnet. Das kleine Bild zeigt die Kamera während der Aufnahme einer Rhizobox. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diagramm der hyperspektralen Bildanalyse: Aufbauten zur Datenerfassung, Segmentierung, Wasserkartierung, chemometrische Analyse
Abbildung 6: Schritte der hyperspektralen Wurzelbildgebung.
Die hyperspektrale Wurzelbildgebung umfasst drei Haupt­schritte: (i) Bildaufnahme, (ii) Bildsegmentierung und (iii) Analyse der spektralen Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Keimungsversuch; Feuchtigkeitsgradienten auf Polystyrol und Keimpapier.
Abbildung 7: Rhizobox zur Wasserkalibrierung.
Die Rhizobox enthält Kammern mit Substrat unterschiedlicher Wasserhaltigkeit, die durch Polystyrolplatten voneinander getrennt sind. Keimpapier in den trockenen Kammern verhindert, dass Bodenpartikel in benachbarte Kammern gespült werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

5. Anwendungsbeispiele

HINWEIS: Quantitative Wurzelinformationen werden im Kontext der Pflanzen-Phänotypisierung (Sortenvergleich) und für pflanzenphysiologische Forschung verwendet. Die folgenden oberirdischen Daten werden angegeben, um diese Anwendungsfälle zu veranschaulichen.

  1. Blattfläche: Messen Sie die Blattfläche im Verlauf des Experiments zu ausgewählten Zeitpunkten nichtdestruktiv über die Länge und Breite der Blätter als Proxy. Alternativ können Aufnahmen des Bestandes verwendet werden29.
    1. Am Ende des Experiments messen Sie die Blattlänge und -breite sowie die Fläche abgeschnittener Blätter mit einem Blattflächenmessgerät. Kalibrieren Sie die nichtdestruktive Methode, indem Sie eine Regressionsgleichung auf die Datenpaare anwenden.
  2. Trockenmasse: Messen Sie am Ende des Experiments die oberirdische Trockenmasse, indem Sie die Pflanzen mit einer Schere abschneiden und 24 Stunden lang bei 105 °C im Ofen trocknen.
  3. Stomatale Leitfähigkeit: Messen Sie die stomatale Leitfähigkeit mit einem Blattporometer. Bewahren Sie das Gerät vor der Messung mindestens eine Stunde lang in der Klimakammer auf, damit sich die Sensoren an die Umgebungsbedingungen anpassen können, und kalibrieren Sie das Gerät jedes Mal neu, wenn sich die Umgebungsbedingungen in der Klimakammer ändern. Nehmen Sie Messungen an mindestens drei Blättern pro Pflanze vor.

Ergebnisse

Beispielhafte Ergebnisse werden für die Wurzelsegmentierung basierend auf RGB- und HS-Bildgebung präsentiert. Bei der spektralen Bildgebung wird ein Beispiel für eine hochauflösende Wasserkartierung gezeigt. Abschließend werden Ergebnisse dargestellt, die den wissenschaftlichen Kontext veranschaulichen, in dem bildbasierte Wurzeldaten angewendet werden.

RGB-basierte Wurzelmessung

Abbildung 8 zeigt eine RGB-Wurzelbild-Zeitreihe der Zuckerrübensorte Ferrara. Die Bilder zeigen einige Artefakte aufgrund einer inhomogenen Beleuchtung der Rhizoboxen, mit helleren Bereichen entlang der linken Seite sowie unterschiedlicher Helligkeit im Überlappungsbereich zwischen oberen und unteren Bildern.

RGB-Wurzelwachstumsstudie, Zuckerrübe 'Ferrara', Tage 20–35, Zeitrafferauswertung, Wachstumsdiagramm.
Abbildung 8: Zeitreihe des Wurzelwachstums basierend auf RGB-Bildgebung.
Die Abbildungen zeigen die Zuckerrübensorte Ferrara an verschiedenen Tagen nach der Aussaat (DAS). Die Bilder weisen einige Artefakte aufgrund einer nicht homogenen Beleuchtung an der linken Bildseite sowie zwischen oberen und unteren Bildern auf. Maßstabsbalken: 2 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 9 zeigt Einzelheiten zur Wurzelsegmentierung basierend auf der Farbschwellenwertmethode für die Sorte Ferrara am 35. Tag nach der Aussaat (DAS). Als Referenz (Abbildung 9A) dient ein Binärbild, bei dem alle Wurzeln manuell mit einem Grafiktablett nachverfolgt wurden. Die für die manuelle Nachverfolgung des gesamten, voll entwickelten, dichten Zuckerrübenwurzelsystems benötigte Zeit betrug etwa vier Stunden. Abbildung 9B zeigt eine vergrößerte Ansicht eines ausgewählten Bereichs am oberen Bildrand, in dem alte Seitenwurzeln vorhanden sind. Hier werden mehrere Wurzelachsen durch den Farbschwellenwert nicht klassifiziert. Im Gegensatz dazu am unteren Bildrand (Abbildung 9C), wo hauptsächlich weiße, junge Wurzeln vorliegen, klassifiziert die farbbasierte Segmentierung alle Wurzelachsen korrekt. Das binarisierte Wurzelsystem (Abbildung 9D) weist auf der linken Seite eine schwarze Fläche auf, die durch einen Beleuchtungsartefakt verursacht wurde und vor der quantitativen Analyse als Ausschlussregion definiert wurde. Abbildung 9E zeigt die entsprechenden Pixeleinhistogramme ausgewählter Merkmale (Wurzeln vs. Boden) für den Rotkanal des RGB-Bildes von Ferrara am DAS 35. Die Wurzelpixel (blaue Farbe) zeigen deutlich drei Peaks, die hellen jungen Seitenwurzeln, dunklen alten Seitenwurzeln und der Pfahlwurzel entsprechen. Die Überlappung zwischen den alten Seitenwurzeln und dem Bodenhintergrund ist sehr stark, was zu nicht klassifizierten Wurzelachsen führt (vergl. Abbildung 9B).

RGB-Farbe basierendes Wurzelsegmentierungsdiagramm mit Histogrammanalyse von Wurzeltypen und Bodendifferenzierung.
Abbildung 9: Wurzelsegmentierung mithilfe einer Farbschwelle.
(A) Manuell segmentiertes Wurzelsystem unter Verwendung eines Grafiktabletts, (B) Bereich mit schlecht segmentierten alten Wurzelachsen im oberen Teil und (C) korrekt segmentierten jungen Achsen im unteren Teil des Bildes sowie (D) binäres Bild, das durch farbbasierte Schwellenwertbestimmung erhalten wurde. (E) Pixehistogramme für ausgewählte Merkmale des RGB-Bildes. Wurzeln werden durch die blauen Balken dargestellt, wobei verschiedene Wurzeltypen angegeben sind; Boden wird durch die roten Balken dargestellt. Maßstäbe in A und D: 2 cm; Maßstäbe in B und C: 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Die resultierende gesamte sichtbare Wurzellänge, quantifiziert für das manuell segmentierte Referenzbild, beträgt 1534,1 cm, während die automatisierte, farbbasierte Segmentierung eine Gesamtwurzellänge von 1427,6 cm ergibt.

Graustufenbilder aus der UV-Beleuchtung bieten in dem hier gezeigten Fall keinen Vorteil und schnitten im Vergleich zur Farbschwellenbildung schlechter ab (Wurzellänge: 1679,7 cm). Alte Wurzeln konnten nicht segmentiert werden, und das Bild wies mehr Rauschen auf, wahrscheinlich aufgrund der geringeren Lichtintensität der UV-Lampen. Bei jungen Wurzeln mit starker Autofluoreszenz und einem hellen Hintergrundsubstrat kann die UV-Beleuchtung jedoch weiterhin eine Option darstellen, wie ein Bild aus einem anderen Experiment zeigt, bei dem Sand als Hintergrundsubstrat verwendet wurde (Abbildung 10).

Fluoreszenzmikroskopie; Wurzelstruktur; links: bläuliche Konfokalaufnahme, rechts: Helligkeitsfeldbild.
Abbildung 10: UV-Beleuchtung zur Sichtbarmachung von Wurzeln auf hellem Hintergrund.
Beispiel eines Wurzelsystems von Hartweizen, das in einer Rhizobox mit Quarzsand wächst. Die Rhizobox wird abgebildet mit Beleuchtung für (A) UV-Licht und (B) fluoreszierendes (Tages-)Licht. Maßstäbe: 2 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

HSI-basierte Wurzelmessungen

Abbildung 11 zeigt die mittleren Spektren für drei Wurzel-ROIs (ältere und jüngere Seitenwurzeln, Pfahlwurzel) und zwei Boden-ROIs (Ober- und Unterseite der Rhizobox).

Graph der Wurzelspektralanalyse, normalisierte Reflexion vs. Wellenlänge, Vergleich von Boden und Wurzeln.
Abbildung 11: Mittlere Spektren von Wurzel und Boden.
Spektren von interessierenden Bereichen (ROIs) an der Wurzel (drei Wurzeltypen) und im Boden (oben und unten des Rhizoboxes). Die ROIs wurden ausgewählt, um ein optimales Segmentierungskriterium zwischen Wurzel und Boden zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Es ist offensichtlich, dass die Hauptwurzel und junge Seitenwurzeln sich bezüglich der Intensität der meisten Spektralbänder deutlich vom Hintergrund unterscheiden. Bei den alten Seitenwurzeln sind die Intensitätsunterschiede deutlich geringer. Ein visuell erkennbares Merkmal ist die unterschiedliche Steigung des Spektrums im Bereich der Wasseraufnahme (1450 nm). Hier ist die Steigung der Wurzelspektren im Vergleich zu den Bodenspektren höher. Darüber hinaus lässt sich eine Veränderung der Spektren von Haupt- und jungen Seitenwurzeln im Bereich um 1100 nm feststellen, die bei den alten Seitenwurzeln nicht auftritt.

Abbildung 12A zeigt das Ergebnis des Suchalgorithmus, der ein spektrales Verhältnis mit maximalem Vordergrund-Hintergrund-Kontrast identifiziert. Das Verhältnis der Spektren bei 1476 nm zu 1076 nm liefert die beste Trennung zwischen Wurzeln und Boden. Das resultierende Histogramm der Pixel von Wurzel-Vordergrund und Boden-Hintergrund ist in Abbildung 12B dargestellt. Obwohl eine gewisse Überlappung besteht, sind die meisten Pixel deutlich vom Boden-Hintergrund getrennt. Durch Anpassen einer bimodalen Gauß-Kurve an das Histogramm und Verwendung des Bhattacharyya-Abstands zur Quantifizierung ergibt sich ein Wert von 7,80. Ein Wert über 3,0 weist auf einen starken Bildkontrast hin, der eine zuverlässige Trennung ermöglicht28.

Spektrales Heatmap und Histogramm zur Wellenlängen-Intensitätsanalyse; Analyse von optischen Emissionsdaten.
Abbildung 12: Unterschiede in der Reflektanz zwischen Wurzel-Vordergrund und Boden-Hintergrund für verschiedene spektrale Bandverhältnisse und Pixel-Histogramm am zur Segmentierung verwendeten spektralen Verhältnis.
(A) Helle Farben (gelb) zeigen einen hohen Kontrast zwischen Vordergrund und Hintergrund, dunkle Farben (blau) einen geringen Kontrast. Die ersten 15 Bänder wurden aufgrund von Rauschen entfernt. Die roten Linien markieren das Bandverhältnis mit dem höchsten Kontrast. (B) Pixel-Histogramm der Wurzeln (blau) und des Bodens (rot) am spektralen Verhältnis für die Segmentierung. Die blauen Balken repräsentieren die Wurzeln und die roten Balken den Boden. Der Intensitätswert entspricht dem Verhältnis des spektralen Bandes 160 zum spektralen Band 49. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Das Binärbild (Abbildung 13) wird erzeugt, indem ein globaler Intensitätsschwellenwert des identifizierten spektralen Verhältnisses mit einem Wert von 1,008, berechnet aus der Histogrammdistanz27, angewendet wird. Die Analyse der Wurzellänge dieses Bildes ergibt eine Gesamtlänge von 1557,3 cm, was einem Fehler von lediglich 1,5 % im Vergleich zum manuell nachverfolgten Referenzbild entspricht.

Darstellung der neuronalen Netzwerkstruktur; dendritischer Baum; Mikroskopiebild; Visualisierung der Neuronenverbindungen
Abbildung 13: Binärbild des Wurzelsystems der Zuckerrübensorte Ferrara.
Das Bild wurde durch Anwendung eines globalen spektralen Schwellwerts erstellt. Maßstabsbalken (unten links), 2 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Obwohl die Wurzelsegmentierung durch den Einsatz spektraler Informationen im Vergleich zu farbbasierten Informationen verbessert wurde, liegt das Hauptziel der HS-Bildgebung in der Analyse chemometrischer Bildegenschaften. Dies wird durch die Kartierung des Wassergehalts eines Rhizobox-Bildes veranschaulicht.

Abbildung 14A zeigt die mittleren Spektren der Kompartimente in der Kalibrationswurzelbox (vergleiche Abbildung 7), die mit Boden unterschiedlicher Wasserinhalte gefüllt ist. Die Form der Spektren ist zwischen den Kompartimenten ähnlich, d. h. hier liefert ein spektrales Verhältnis nicht notwendigerweise ein stabileres Klassifizierungskriterium. Daher wird die Intensität bei einer einzelnen spektralen Bande (1680 nm), bei der der durchschnittliche Unterschied zwischen benachbarten Wasserinhalten maximiert ist, als bestes Trennkriterium identifiziert. Die sich ergebenden Pixeleinhistogramme für diese spektrale Wellenlänge sind in Abbildung 14B dargestellt.

Spektralanalyse-Grafiken; (A) Absorptionsspektren, (B) Intensitätsverteilung für nasse und trockene Zustände.
Abbildung 14: Spektrale Merkmale zur Kalibrierung des Wassergehalts.
(A) Mittlere Spektren von neun Wasser-Kompartimenten aus der Kalibrierungs-Rhizobox mit unterschiedlichem Wassergehalt; (B) Pixel-Histogramme für die Wasser-Kompartimente im Band 216, wo der durchschnittliche Abstand zwischen benachbarten Kompartimenten maximal ist. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Die Beziehung zwischen der durchschnittlichen Pixelintensität bei 1680 nm und dem gemessenen Wassergehalt ist in Abbildung 15 dargestellt.

Bodenfeuchte-Diagramm; exponentielle und lineare Anpassung. Wassergehalt vs. Reflexion; Feldkapazität, Welkepunkt.
Abbildung 15: Zusammenhang zwischen spektraler Reflexion und volumetrischem Wassergehalt.
Die Abbildung zeigt Messwertpaare aus gemessenem Wassergehalt und spektraler Reflexion mit empirischen Kurven (linear und exponentiell), die an die Daten angepasst wurden, wobei die höchsten Wassergehalte (rote Dreiecke) ausgeschlossen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Die Unterscheidung höherer Wassergehalte anhand der spektralen Intensität wird schwierig. Eine signifikante Regression (entweder linear oder exponentiell) mit hohem R2-Wert kann für Wassergehalte bis etwa 0,30 cm3 cm-3 angepasst werden. Feuchtere Bodenbedingungen können durch den Intensitätswert nicht zuverlässig vorhergesagt werden. Ein ähnliches Verhalten einer exponentiellen Beziehung zwischen Reflektivität und Wassergehalt mit abnehmender Empfindlichkeit bei Wassergehalten über 0,30 cm3 cm-3 wurde auch in anderen Studien beobachtet30.

Ein Rhizobox-Bild mit feiner Kartierung des Wassergehalts ist in Abbildung 16 dargestellt. Vier Aspekte sind hervorzuheben. Erstens ist im bewurzelten Bereich der Rhizobox ein Bereich mit geringerem Wassergehalt erkennbar. Zweitens konzentriert sich die stärkste Wasserausschöpfung in der Nähe einzelner Wurzelachsen. Drittens treten Entleerungszonen auch dort auf, wo keine Wurzelachsen an der Oberfläche sichtbar sind, was auf Bereiche hinweist, in denen sich Wurzeln im Boden verbergen. Viertens führt die Wasser-Kartierung ohne weitere Bildverarbeitung aufgrund des aggregierten Bodens zu einem fleckigen Erscheinungsbild. Dies kann auf eine inhomogene Verteilung des Wassergehalts auf der Skala der Aggregate hinweisen, aber auch auf Einflüsse der Oberflächenmorphologie auf die Bildqualität. Chemometrische Bildverarbeitungstechniken bieten eine Möglichkeit, solche morphologischen Effekte in spektralen Bildern zu überwinden31, wurden jedoch bisher nicht in die hier verwendeten Matlab-Skripte implementiert.

Neurondiagramm; Detail der dendritischen Verzweigungen bei der Analyse neuronaler Netzwerke.
Abbildung 16: Kartierung des Wassergehalts in einer Rhizobox.
Die dunkelblauen Farben stellen Bereiche mit hohem Wassergehalt dar, grüne bis rote Bereiche zeigen Gebiete mit niedrigem Wassergehalt. Die Pflanzenwurzel ist in Schwarz über das Bild gelegt. Maßstabsleiste (unten links), 2 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Anwendungsbeispiele

Abbildung 17 stellt quantitative Wurzelmerkmale aus der Bildanalyse in Beziehung zu Messungen des oberirdischen Pflanzenteils.

Analyse von Pflanzenwachstumsdaten; Graphen der Wurzellänge, Oberflächenverhältnis, Trockenmasse, Stomataleitfähigkeit.
Abbildung 17: Typische Anwendungsbeispiele für Wurzeldaten.
(A) und (B) zeigen Wurzelinformationen, die im Kontext der Phänotypisierung zur Charakterisierung ober- und unterirdischer Pflanzenteile verwendet werden. (A) stellt das Wurzelwachstum der Zuckerrübensorte Ferrara dar, (B) vergleicht sechs in Rhizoboxen kultivierte Zuckerrübensorten anhand des Blatt-zu-Wurzel-Oberflächenverhältnisses (Daten aus einer Wiederholung). (C) und (D) zeigen funktionale Zusammenhänge zwischen Merkmalen, wie sie in der pflanzenphysiologischen Forschung gefunden werden. (C) zeigt den Einfluss des Blatt-zu-Wurzel-Oberflächenverhältnisses auf die Produktion von Trockenmasse und (D) den Zusammenhang zwischen Wurzeloberfläche und stomataler Leitfähigkeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 17A und 17B sind für die Phänotypisierung relevant, die sich auf eine umfassende Charakterisierung der ober- und unterirdischen Pflanzenteile konzentriert. Abbildung 17A zeigt das Wurzelwachstum der Zuckerrübensorte Ferrara (cf. Abbildung 8 für Bilder). Die Ausdehnung des Wurzelsystems weist auf die Fähigkeit einer Sorte hin, innerhalb eines bestimmten Zeitraums der Vegetationsperiode das Bodenvolumen zu erschließen. Abbildung 17B zeigt das Verhältnis von Blatt- zu Wurzeloberfläche bei sechs Zuckerrübensorten und liefert damit einen Kennwert für das Gleichgewicht zwischen Versorgung (Wurzel) und Bedarf (Blatt).

Abbildung 17C und 17D zeigen Beispiele für funktionale Zusammenhänge, die in der physiologischen Forschung von Interesse sind. In Abbildung 17C steht das Verhältnis von Blatt- zu Wurzeloberfläche in Beziehung zur während des Experiments gebildeten Trockenmasse, was auf die vorherrschende Rolle der assimilierenden Oberfläche als limitierender Faktor für die Trockenmassenakkumulation hinweist. Das Fehlen einer statistischen Signifikanz trotz eines vergleichsweise hohen Bestimmtheitsmaßes R2 hängt mit der geringen Anzahl an gepaarten Daten (n=6) zusammen, die hier verwendet wurden. Abbildung 17D zeigt, dass Sorten mit größerer Wurzeloberfläche (verbesserte Aufnahme) im Verlauf des Experiments eine durchschnittlich höhere Stomataleitfähigkeit aufweisen. Die größere Wurzeloberfläche ermöglicht offenbar eine anhaltendere Wasseraufnahme, wodurch die Stomataöffnung verlängert wird.

Diskussion

Die Protokolle bieten zwei komplementäre Ansätze für Boden gewachsen Wurzelsystem Bildgebung. Ein entscheidender Schritt für die zuverlässige experimentelle Ergebnisse ist von der Rhizoboxes Füllung, die eine gleichmäßige und homogene Substratschicht an der Frontscheibe zu engen Wurzel-Bodenschluss an das Beobachtungsfenster und vermeiden Luftspalte zu gewährleisten. Dies ist der Hauptgrund für die vergleichsweise gut gesiebten Boden verwenden < 2 mm: höhere Oberflächenmorphologie am Sichtfenster mit Hohlräumen zwischen den Aggregaten führen zu größere Aggregaten. Neben ein höheres Risiko der Wurzel Tipp Dehydrierung erfordert dies auch komplexere Bildverarbeitungstechniken für Wasser Abbildung31.

Änderungen des Protokolls konzentrieren sich deshalb auf verbesserte und schnelle Befüllung des Rhizoboxes. Derzeit Füllzeit ist ca. 30 Minuten pro Box. Des weiteren Verwendung von Rhizoboxes mit zwei Glasfenster für die Bildgebung von beiden Seiten und Änderungen an Homogenität der Ausleuchtung für bessere RGB-Bilder optimieren werden getestet. Weitere Hardware-Erweiterung sollten auch Integration von planaren Optodes32 sowie Kapazität imaging33 in das Rhizobox-System. Dies ist jedoch darüber hinaus aktuelle Upgrade Aktivitäten.

Softwareänderungen konzentrieren sich auf automatische Bild-Registrierung zur Sicherung oben und unten RBG Bilder34. Bildgebendes erweiterte unbeaufsichtigt Merkmalsextraktion Ansätze für hyperspektrale28 sowie empfindlicher betreute Ziel Nachweismethoden, wie z. B. SVMs35 getestet. Dabei erlauben die hyperspektrale Daten möglicherweise für die Bewertung von mehreren Boden, Rhizosphäre und Wurzel Eigenschaften36. Außerdem soll es eine (Semi) entwickeln automatisierte Software für Rhizobox Wurzel Bilder basierend auf einer modifizierten Version des Root-System Analyzer37 , morphologische zu quantifizieren (Länge, Durchmesser, Fläche) sowie architektonische Merkmale (Verzweigung Frequenz, Verzweigung Winkel).

Die wichtigste Einschränkung des Protokolls im Vergleich zu 3D imaging Ansätzen ist die Beschränkung auf die Oberfläche sichtbare Wurzel und Rhizosphäre Eigenschaften. Jedoch wurde nachgewiesen, dass die sichtbare Wurzel Züge einen zuverlässigen Proxy für das gesamte Wurzelsystem21sind. Die Rhizobox Technik ist leicht mit traditionellen destruktive Probenahme (waschen) am Ende der Wachstumsdynamik imaging um das Verhältnis von sichtbaren vs. total Wurzelsystem Züge zu validieren kombiniert. Da diese Beziehung unter den Arten21variieren könnten, empfiehlt destruktive Probenahme zuverlässige Ableitung von sichtbaren Merkmale für jede neue Phänotypisierung Serie mit verschiedenen Kulturarten zu gewährleisten.

Der entscheidende Vorteil des hier vorgestellten Protokolls ist die Kombination von realistischen Wachstumsbedingungen (Boden), relativ hohen möglichen Durchsatz für die zeitlich aufgelöste RGB Bildgebung und Rückschlüsse auf die Wurzel Funktionalität (z.B. Wasseraufnahme) über die chemometrischen Wurzel und Rhizosphäre Daten aus hyperspektralen Bildgebung. Dabei überwindet die Methoden Inferenz Einschränkungen im Hochdurchsatz Sämling und nicht Boden Wurzel bildgebende Methoden14, während es teilweise tiefen Phänotypisierung Einblicke in funktionale Prozesse mit weniger experimentell Komplexität und höheren Durchsatz im Vergleich zu modernen 3D Methoden15ermöglicht.

In kommenden Experimenten das Protokoll wird verwendet, um die Wirkung der Mykorrhiza auf Root-Systementwicklung und Funktionalität von Leguminosen sowie für Phänotypisierung Wurzel Merkmale der Zwischenfrucht Arten in Bezug auf die Bodenstruktur, Stickstoff und Kohlenstoff zu studieren Radfahren.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren erkennen Mittel aus der Wissenschaftsfonds FWF über das Projekt Nummer P 25190-B16 (die Wurzeln der Dürreresistenz). Errichtung der hyperspektralen Bildgebung Infrastruktur wurde von der föderalen Regierung von Niederösterreich (Land Niederösterreich) über das Projekt K3-F-282/001-2012 finanziell unterstützt. Zusätzliche Mittel für die Zuckerrüben-Experiment von AGRANA Forschung empfangen wurde & Innovation Center GmbH (ARIC). Die Autoren danken Craig Jackson für den technischen Support während des Experiments und Englisch Korrektur des Manuskripts. Wir erkennen auch Markus Freudhofmaier, die zur Einrichtung der RGB Bildgebende Einrichtung beigetragen und Josef Schodl für den Bau der Rhizobox Montage.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RhizoboxTechnisches Bü ro fü r BodenkulturExperimentierbauer
LED-Lampen ATUM HORTI 600KlutronicAHI10600F
Leuchtstoffröhre HiLite T5 DayJuwel Aquarium86324
UV-Lichtröhre Eurolite 45cm slim 15 WConrad593384 - 62
Canon EOS 6DCanon Austria GmbH8035B024
Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 x 32Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro gegen 2013Regent Instruments Inc.
Xeva-1.7-320 SWIR-KameraXenicsXEN-000105
Spectrograph Imspector N25ESpecim
Hyperspectral Imaging ScannerCarinthian Tech Research AGExperimenteller ErbauerDesign und Montage von Hyperspectral Imaging Scanner und Software
Matlab R2106aMathworksInklusive Werkzeugkästen für Bildverarbeitung, Signalverarbeitung und Statistik sowie maschinelles Lernen
AP4 PoromoeterDelta-T-Geräte
LI-3100C FlächenmessgerätLI-COR
BASF Styradur StyroporplattenObi Baumarkt9706318Verschiedene Arten von Styroporplatten oder anderes Material, das unterschiedlich feuchte Böden trennt, können verwendet werden

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