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Methodenartikel

In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

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DOI:

10.3791/56273

⸱

8. Oktober 2017

 ,  ,  ,  , 
1Cellular Biomedicine Group, China, 2Cellular Biomedicine Group, California, 3Department of Orthopedics, Shanghai TCM-Integrated Hospital, 4Department of Orthopedics, Shanghai East Hospital, Tongji University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Möglichkeit zur Überwachung der Zelle Persistenz und Bioverteilung des menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen (HaMSCs) durch dunkelrote Fluoreszenz Kennzeichnung in einem Rattenmodell Knie Arthrose (KOA) durch intraartikuläre Injektion (IA).

Zusammenfassung

Um die klinische Anwendung der menschlichen Fettgewebe gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (HaMSC) Therapie für Knie-Arthrose (KOA) zu unterstützen, haben wir die Wirksamkeit der Zelle Persistenz und Bioverteilung des HaMSCs in Tiermodellen untersucht. Wir zeigten eine Methode um die Zellmembran der HaMSCs mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoff zu beschriften. Anschließend wurde intraartikuläre Injektion der markierten Zellen bei Ratten mit chirurgisch induzierten KOA dynamisch durch ein in-Vivo imaging-System überwacht. Wir beschäftigten die lipophilen Carbocyanines haben (DilC18 (5)), eine dunkelrote fluoreszierende Dil (Dialkylcarbocyanines) Analog, die einen roten Laser zur Anregung der natürlichen grünen Autofluoreszenz vom umgebenden Gewebe zu vermeiden verwendet. Darüber hinaus rot-verschoben Emissionsspektren der zulässige tiefen Gewebe Bildgebung mit lebenden Tieren und die Kennzeichnung Verfahren keine zytotoxischen Effekte oder funktionellen Schaden HaMSCs verursacht. Dieser Ansatz hat sich gezeigt, um eine effiziente Überwachungsmethode für HaMSCs in einem Rattenmodell KOA werden. Die Anwendung dieser Methode könnte auch verwendet werden, um die optimale Verwaltung Weg und Dosierung von MSCs aus anderen Quellen in präklinischen Studien bestimmen.

Einleitung

Knie-Arthrose (KOA) ist eine degenerative Erkrankung, die durch Verlust von Gelenkknorpel und fortschreitende Entzündung, die eine große chronische Erkrankung bei älteren Menschen rund um die Welt1geworden ist. Aktuelle Therapien mit Anti-inflammatory Drogen, körperliche Ergänzungen und chirurgische Eingriffe können jedoch nur vorübergehende Linderung für symptomatische Schmerzen2vorsehen.

Menschlichen Fettgewebe mesenchymaler Stammzellen (HaMSCs) sind eine vielversprechende regenerative Heilmittel für Knie-Arthrose, aufgrund ihrer multipotenten Differenzierungspotenzial für Knorpelregeneration und immunmodulatorische Eigenschaften3geworden, 4. Im Vergleich mit pharmakologischen Routen, Mechanismen der Aktion in Vivozu untersuchen, ist das tracking live HaMSCs in kleiner KOA Tiermodelle derzeit lehrreich, die Begründung und die Machbarkeit der HaMSC Therapie vor der klinischen Anwendung zu etablieren. Für präklinische Tests, destabilisiert mediale Meniscectomy (MM) die mechanische Belastung des Gelenks zu induzieren KOA in Ratten, bietet ein relativ machbar Modell mit konsistenten Reproduzierbarkeit5. Das Auftreten von KOA induziert durch MM ist älter als Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes allein oder in Kombination mit partiellen medialen Meniscectomy6. Daher sind die langfristigen Wechselwirkungen zwischen eingespritzte HaMSCs mit der pathologischen Mikroumgebung von KOA oft bei Ratten induziert durch MM7,8bewertet.

Obwohl die therapeutische Wirksamkeit des HaMSCs wurde ausführlich berichtet, relevante Kenntnisse auf ist die in-Vivo -Persistenz von implantierten HaMSCs durch intraartikuläre Injektion (IA) knapp9,10. Daher sind verschiedene zelluläre Kennzeichnung Methoden entwickelt worden, einschließlich der Immunhistologie11, Luciferase12, grün fluoreszierendes Protein13 Transfektion Eisenoxid labeling für Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)14, , und zahlreiche fluoreszierende Zelle Farbstoffe8,15,16. Verglichen mit arbeitsintensiven Histologie Analysen, beschäftigt in Vivo nicht-invasive Bildgebung optische Geräte, die Echtzeit-Verteilung und Dynamik der Zellen beschriftet mit fluoreszierenden Signale10,17zu erkennen. Für funktionelle live Cell Imaging ist Cytocompatible fluoreszierenden Kennzeichnung eine anspruchsvolle radioaktiven kostenlose Tracking-Technik, um zelluläre Aktivitäten nach Stammzell-Transplantation18zu offenbaren. Darüber hinaus besitzen multicolor lipophile Fluoreszenzfarbstoffen Vorteile gegenüber amino-Reaktivfarbstoffe hydrophil oder fluoreszierende Proteine, einschließlich ihrer Zelle verbesserte Durchlässigkeit und verstärkten Fluoreszenz Quantum Erträge19.

So nutzen die Protokolle enthalten hier eine rote Laser beschriftet mit lipophilen Carbocyanines Zellen erregen haben (DilC18(5)), ist eine dunkelrote fluoreszierende Dil (Dialkylcarbocyanines) analog20. Die rot-verschoben Anregung und Emission Spektren von vermeidet Autofluorescent Störungen und tiefen Gewebe über einen langen Zeitraum hinweg in lebenden Tieren8Bildgebung ermöglicht. Diese Methode des Trackings Zellen in Vivo mit beschriftet habe ist gültig für die Überwachung der transplantierten Stammzellen, wie HaMSCs, in Tiermodellen, das zum Verständnis und zur Verbesserung der aktuellen regenerative Stammzelltherapie wesentlich ist.

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Protokoll

Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Probanden wurden genehmigt durch die lokalen institutionellen Animal Care und Ethik-Kommission, mit dem Bemühen, das Leiden der Tiere zu minimieren. Das folgende Protokoll wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) in Shanghai neunte People genehmigt ’ s Krankenhaus, Shanghai JiaoTong University School of Medicine mit dem Protokoll angegliedert Nummer [2017] 063.

1. Aufbau eines Surgically-Induced Ratte Knie Osteoarthritis Modells

  1. für dieses chirurgische Verfahren, Verwendung 8-12 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley (SD) Ratten mit einem Körpergewicht zwischen 250 und 300 g.
  2. Die Tiere mit 40 mg/kg Tiletamin und 40 mg/kg Zolazepam durch intramuskuläre Injektion zu betäuben.
  3. Legen Sie das Tier in einer linken seitlichen Position auf einer beheizten Bühne. Rasieren Sie das rechte Knie gründlich mit einem Rasiermesser. Desinfizieren Sie den OP-Bereich mit 10 % Providone-Jod-Lösung gefolgt von 70 % Ethanol, zwei weitere Male zu wiederholen und malen Sie dann mit 10 % Providone-Jod-Lösung und die nicht-chirurgische Fläche mit einem OP Pad.
  4. Mit einem chirurgischen Skalpell machen einen 2 cm Schnitt seitlich entlang der Patellasehne, setzen Sie die Jointcapsules.
  5. Verwenden ein chirurgisches Skalpell, um den medialen Seitenbandes Transekt. Reflektieren den Meniskus in Richtung Femur.
  6. Tropfen sterilen 0,9 % Natriumchlorid-Lösung auf der Oberfläche des Gelenkknorpels während des Betriebs zu verhindern, dass den Knorpel austrocknen.
  7. Der medialen Meniskus mit Zange greifen und Durchtrennung der Meniskus an der schmalsten Stelle aus der Tibia Beschäftigung mit einem Skalpell ( Abbildung 1A). Nicht zu verletzen, des Knorpels.
  8. Schließen die Gelenkkapsel mit einer resorbierbaren Naht 4: 0.
  9. Überwachen die chirurgische Ratten, bis sie wieder zu Bewusstsein kommen.
  10. Spritzen 20 mg/kg Gentamicin zur Vermeidung von Infektionen und 0,05 mg/kg Buprenorphin durch eine intramuskuläre Route zur Linderung von Schmerzen nach der Operation.
  11. Pflegen die Ratten in einer temperaturgesteuerten Tierhaus unter einem 12 h hell/dunkel-Zyklus für 3-8 Wochen zu Beginn KOA. Tiere weiterhin erhalten Schmerzmittel, einschließlich aber nicht beschränkt auf Buprenorphin (0,05 mg/kg, i.m.) und Gentamicin (20 mg/kg i.m.), wenn Symptome fortbestehen.

2. Histologie der Ratte KOA Bewertungsmodell

  1. Opfern, die Ratten mit übermäßigen CO 2 Inhalation (hinzufügen eine Füllrate von etwa 30 % des Kammervolumens pro Minute mit Kohlendioxid an die vorhandene Luft in der Kammer, um die tierischen Bewusstlosigkeit innerhalb von ca. 2-3 min. halten CO2-Fluss für ein Minimum von 1 min nach Atmung aufhört.) Zeitpunkten (Vertreter Ergebnisse werden angezeigt, nach 8 Wochen der KOA Induktion von 3 bis 8 Wochen) nach der Operation angegeben
  2. sezieren die Haut und Muskeln rund um die Kniegelenke und die Kniegelenke mit einem Skalpell abgeschnitten.
  3. Fix die Kniegelenke in 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 3 Tage bei Raumtemperatur. Danach die Proben in 20 % Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) für ca. 4 Wochen bei 4 ° C zu entkalken, und ändern Sie die EDTA alle 3 Tage.
    Achtung: Paraformaldehyd ist giftig, tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (PSA), wie Handschuhe und Brille.
  4. Entwässern die Proben unter Verwendung eines automatischen Gewebe-Prozessors. Menü zu einen bündigen Zyklus wie folgt starten: 70 % Ethanol für 1 h; dann 80 % Ethanol und 95 % igem Ethanol für 1 h; gefolgt von 2 Zyklen von 100 % Ethanol 1 h; Anschließend Xylol zweimal für 1 h jedes Mal und jedes Mal 3 Mal bei 58 ° C für 1 h paraffin.
    Achtung: Xylol ist giftig, so tragen Sie geeignete PSA, wie Handschuhe und Brille.
    Hinweis: Optional zur manuellen Entwässerung mit den gleichen Aufbau wie die automatische Gewebe-Prozessor verwenden Gläser Coplin.
  5. Den medialen Aspekt der intakten gemeinsame Fläche ablegen und Binde sie in der Paraffinblock mit Gewebe eingebettet in das Zentrum.
    Hinweis: Optional Zange verwenden, um die Proben in den Paraffinblock manuell einbinden.
  6. 5 µm sagittale Abschnitte vom medialen Rand des Gelenks für 30 µm Intervalle mit 2 Schnittserien durch rotary Mikrotom schneiden beginnen.
  7. Abschnitte auf Glasobjektträger montieren und deparaffinize Folien in Xylol. Zwischen den 2 Schnittserien Fleck eine Folie mit Hämatoxylin & Eosin (H & E) Färbung: 0,1 % Hämatoxylin für 15 min, 1 % Essigsäure-Lösung für 10 s und 0,5 % Eosin für 10 Minuten. Und Flecken auf die anderen Folie mit Safranin O/schnell grün Färbung: 0,1 % Hämatoxylin für 15 min, 0,02 % schnell grün für 3 min, 1 % Essigsäure-Lösung für 10 s und 0,1 % Safranin O für 3 min.
    Achtung: Xylol ist giftig, geeignete PSA, wie Handschuhe, Brillen zu tragen.
  8. Ergebnis der gefärbten Folien mit Osteoarthritis Research Society International (OARSI) Histopathologie Bewertungssystem in Ratten 6.

3. Kennzeichnung des menschlichen mesenchymalen Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoff hat

  1. Tat bereiten Zelle Kennzeichnung Lösung in 100 % igem Ethanol bei einer Konzentration von 1 mM. Die Zelle-Kennzeichnung Lösung vor Licht schützen und bei Raumtemperatur für 6 Monate lagern.
  2. Wachsen HaMSCs mit Standardzellen Kultur Verfahren in Dulbecco ' s geändert Eagle ' s Medium (DMEM) ergänzt mit 1 % Penicillin und Streptomycin und 10 % fetalen Kälberserum (FCS) in einer Petrischale 10 cm.
  3. HaMSCs mit 2 mL 0,25 % Trypsin mit 1 mM EDTA vor rund 80 % Zusammenfluss lösen.
  4. Trypsin mit 4 mL Kulturmedium zu neutralisieren und die Zellen bei 800 X g für 3 min bei Raumtemperatur spin.
  5. Unterbrechen die Zellen bei einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen/mL in 5 mL Serum-freien Kulturmedium.
  6. Kennzeichnen die Zellen durch Zugabe von 50 µL hat Zelle Kennzeichnung Lösung in 5 mL serumfreien Nährmedium bei 37 ° C 50 min.
  7. Drehen Sie die markierten Zellen 800 X g für 3 min.
  8. Waschen die Zellen zwei weitere Male mit 5 mL Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS) bei 800 X g für 3 min.
  9. Überprüfen Sie die gekennzeichneten HaMSCs mit einem fluoreszierenden Mikroskop mit einem Filtersatz Cy5.
  10. Zählen die Zellen mit Trypan blau Färbung und 2,5 x 10 6 entwicklungsfähigen Zellen in 100 µL PBS zur Injektion erhalten.

4. In Vivo Fluoreszierende Imaging Track HaMSCs

  1. acht Wochen nach der Operation (Schritt 1), betäuben die KOA Ratten durch intramuskuläre Injektion von 25 mg/kg Tiletamin und 25 mg/kg Zolazepam.
  2. Das rechte Knie rasieren gründlich mit einem Rasiermesser, die Lötstelle verfügbar zu machen. Die Lötstelle mit 70 % Ethanol zu desinfizieren.
  3. Mit einer 26 G Spritzennadel Spritzen 2,5 x 10 6 Zellen ausgesetzt in 100 µL PBS in der Mitte des Bereichs Dreieck gekennzeichnet von der medialen Seite der Patella Ligament, die medialen femoralen Kondylus und medialen Tibia Kondylus (gebildet Abbildung 1 b).
  4. Öffnen Sie die Software zur Abbilderstellung und initialisieren die Biolumineszenz in Vivo imaging-System.
  5. Position Ratten in der Rückenlage in die zentrale Bühne das Abbildungssystem positionieren und schließen Sie die Tür der Kammer.
  6. Überprüfen die " fluoreszierenden " Kontrollkästchen und wählen Sie fluoreszierende Filter Sätze von 640 nm für Anregung und 680 nm für Emission ( Abbildung 2A).
  7. Select Sichtfeld, D. einstellen Pixel binning auf Medium (8), F/Stop 2 und Belichtung Zeit automatisch. Aufrechterhaltung der optimalen Belichtungszeit konsequent, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten über die gesamte Studie ( Abbildung 2A).
  8. Entfernen Sie das Tier von der Bühne und Monitor für die Wiederherstellung aus der Narkose.
    Hinweis: Statt Tier auf ein Heizkissen mit 2-3 Schichten aus Frottee bedeckt.
  9. Wählen Sie die Einheiten der strahlende Effizienz für die Messung der Fluoreszenz ( Abb. 2 b). Wählen Sie Bereiche von Interesse (ROI) für die Analyse und Quantifizierung fluoreszierende Signale aus jedem Bild ( Abbildung 2).
  10. Wiederholen Sie den Vorgang der in-Vivo Bildgebung für jede Ratte sequenziell, HaMSCs längs Aufbewahrung im Gelenk zu studieren.
    Hinweis: Wir empfehlen die Tiere imaging ' fluoreszierenden Signale durch in-vivo imaging-System einmal alle zwei Tage für die erste Woche nach der Injektion und einmal pro Woche, bis das Signal nicht erkannt werden kann.

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Ergebnisse

Um KOA Modell zu induzieren, erfolgte MM im rechten Kniegelenk von SD-Ratten (Abbildung 3). Acht Wochen nach der Operation Ratten wurden geopfert und Schnittserien der Kniegelenke wurden ausgewertet, mit beiden H & E und Safranin O/schnell grün Färbung (Abbildung 4). H & E Färbung, die Oberfläche des Gelenkknorpels ausgestellt rauere Grenzen in der Chirurgie Knie als das normale Gelenk ohne Operation. Für Safranin-O/schne...

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Diskussion

Sicherheitsstandards und Bioverteilung Studien der Stammzell-Therapie sind dringend notwendig, bevor wir regenerative Stammzell-Therapie für KOA von der Bank ans Bett zu bringen. Die pathologische Umfeld der Krankheit spielt jedoch eine wichtige Rolle in der Ausdauer und der Bioverteilung des transplantierten HaMSCs10. Unsere Fraktion nachweislich vor kurzem intraartikulären Injektion von HaMSCs mehr in einer pathologischen KOA Umgebung beibehalten, als Injektionen unter normalen Bedingungen

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Offenlegungen

Meng Li, Ming-Hao und Wang Wen sind aktuelle Mitarbeiter und Stock-Option-Inhaber von zellulären Biomedizin-Gruppe (Nasdaq: CBMG). Die anderen Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Danksagungen

Die aktuelle Studie wurde unterstützt durch Shanghai Innovationsförderung (1402 H 294300) gesponsert von der Wissenschaft und Technologie Kommission von Shanghai Gemeinde (CN), Dr. Wen Wang. Wir möchten danken Dr. Guangdong Zhou (National Tissue Engineering Center of China) für seine technische Unterstützung und wissenschaftliche Beratung für diese Handschrift. Wir auch möchte Herr Huitang Xia (Shanghai neunten Volks Krankenhaus) danken für seine Hilfe im Bereich des Tierschutzes.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Matrx VMR TieranästhesiesystemMidmarkVIP3000
4-0 NahtShanghai JinhuanKC439
RasiererPritechLD-9987
GentamicinZhejiang Jindakang Tiergesundheitsprodukt Co., Ltd.Keine
0,9% NatriumchloridlösungHunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.
PenicillinShanghai Kangfu chemisch-pharmazeutische Co., Ltd.Verifizierter
BuprenorphinTianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd.Keine
ParaformaldehydSigma-Aldrich16005Verdünnung auf eine Endkonzentration von 10 % in PBS
EDTASigma-AldrichE9884Verdünnung auf eine Endkonzentration von 20 % in PBS
0,1 % Hämatoxylin-Lösung, Mayer' sSigma-AldrichMHS16
0,5% Eosin Y-Lösung, alkoholischSigma-AldrichHT110116
Safranin OSigma-AldrichS8884
Fast GreenSigma-AldrichF7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue ProcessorThermo FisherA78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding CenterThermo FisherB64100010
Vollautomatisches RotationsmikrotomLeicaRM2255
DiDMolekulare Sonden, Life
Technologies		V-22887
D-MEM High GlucoseSigma-AldrichD5648
PBSGIBCO, Life Technologies14190-144
0,25 % Trypsin-EDTAInvitrogen25200-114
10 cm PetrischaleCorningV118877
ZentrifugeBeckmanOptima MAX-TL
FluoreszenzmikroskopOlympusBX53
0,4% Trypanblau LösungSigma-Aldrich93595
TitetammeVirbac (Zoletil 50)1000000188
ZolazepamVirbac (Zoletil 50)1000000188
Sterile hyposermische Spritze zum Einmalgebrauch 26GShanghai Misawa Medical Industry Keine
IVIS-Spektrum In-vivo-BildgebungssystemPerkinElmer124262
Living Imaging 4.0 SoftwarePerkinElmerKeine
H43020455Lieferant -

Referenzen

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