Fehlanpassungen in human Leukocyte Antigen (HLA) Sequenzen zwischen Organspender und Empfänger-Paare sind die Hauptursache der Antikörper-vermittelten Ablehnung im Organ-Transplantation. Hier präsentieren wir Ihnen die Verwendung von benutzerdefinierten Antigen-Arrays, die auf einzelnen Spendern HLA Sequenzen, Anti-Spender HLA Alloantibodies in Organempfängern Sonde basieren.
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Methodenartikel
Personalisierte Peptidarrays für die Erkennung von HLA Alloantibodies in Organtransplantation
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Im Organ-Transplantation verlassen die Funktion und Langlebigkeit des Transplantats kritisch auf den Erfolg des Controllings immunologische Ablehnung Reaktivität gegen humanen Leukozyten-Antigene (HLA). Histocompatibility Leitlinien basieren auf Labortests der Anti-HLA-Immunität, die entweder als bereits bestehende präsentiert oder de Novo generierte HLA-Antikörper, die eine große Transplantation Barriere darstellen. Aktuelle Tests basieren auf einer Single-Antigen Perlen (SAB) Plattform mit einem festen Satz von ~ 100 vorausgewählten rekombinante HLA-Antigene Transplantation Sera zu untersuchen. Beim Menschen gibt es jedoch eine weit größere Vielfalt an HLA-Typen, mit keine zwei Personen als eineiige Zwillinge, die die gleiche Kombination von HLA-Sequenzen teilen können. Während fortschrittliche Technologien zur HLA-Typisierung und direkte Sequenzierung genau Fehlanpassungen in DNA-Sequenz zwischen des Spenders erfassen können und des Empfängers HLA, SAB-Assay, wegen seiner begrenzten Vielfalt in Sequenz Darstellung nicht in der Lage ist, genau zu erkennen Alloantibodies speziell gegen die Spender-HLA-Fehlanpassungen. Wir wollten eine ergänzende Methode durch eine andere Technik zu erkennen und charakterisieren Anti-Spender-HLA-Antikörper auf einer persönlichen Basis zu entwickeln. Die Screening-Tool ist eine benutzerdefinierte Peptid-Array der Spender HLA-abgeleitete Sequenzen zum sondieren nach der Transplantation Sera von der Orgel-Empfänger zur Bewertung des Risikos für die Antikörper-vermittelten Ablehnung. Auf einem einzelnen Array für ein Geber-Nehmer-paar sind bis zu 600 einzigartige Peptide auf Basis des Spenders HLA Proteinsequenzen, jedes Peptid tragen mindestens eine nicht übereinstimmende Rückstand in einer 15-amino Acid Sequenz getroffen. In unseren Pilotversuchen Antigen Muster für vor und nach der Transplantation Sera auf diese Arrays vergleichen konnten wir Anti-HLA-Signale mit der Auflösung zu erkennen, die auch uns erlaubt, die immun Epitope beteiligten genau zu bestimmen. Diese personalisierte Antigen Arrays ermöglichen hochauflösende Detektion von Spender-spezifischen HLA Epitope in Organtransplantation.
Einleitung
Orgel-Ersatz-Therapie, die routinemäßig in der ganzen Welt durchgeführt wird, hat Millionen von Menschenleben gerettet. Solide Organtransplantationen tritt in etwa 100 Patienten pro million Einwohner in den USA jährlich, während eine größere Anzahl noch auf Wartelisten Spenderorgane durch eine starke Verknappung des Angebots (nach Angaben der Orgel zu erhalten Beschaffung und Transplantation Netzwerk - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Organtransplantation ist stark reguliert, um Orgel Abfall zu reduzieren und Leben zu retten, aber die wissenschaftlichen Werkzeuge verwendet, um diese Vorschriften zu informieren sind in ihrer Wirksamkeit begrenzt. Zum Beispiel, die....
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Protokoll
Alle hier beschriebene Methoden zugelassen von der Northwestern University Institutional Review Board (IRB-Protokoll #: STU00104680). Ein gesamter Workflow des Protokolls in Abbildung 1 dargestellt ist.
1. bioinformatische Analyse von Spender und Empfänger HLA Sequenzen
- Sequenzen aus IMGT/HLA-Datenbank abgerufen 15.
- Erhalten HLA Typisierung Berichte der Organspender und seine/ihre Empfänger.
Hinweis: Sicherstellen Sie, dass geeignete Verfahren zum Schutz der vertraulichen medizinischer Aufzeichnungen genutzt werden. In der Regel ist eine institutionelle Review B....
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Ergebnisse
In der ursprünglichen Studie mit dem Array screening-Methode17schrieb wir insgesamt 5 Niere Transplantation Fächer. Wir erhalten die HLA Typisierungsergebnisse unserer Kohorte und ihre jeweiligen Geber. Ihre Krankengeschichte und Allele Antikörpertiter von SAB Tests waren auch uns zur Verfügung. In unserer Pilotstudie von diesen 5 Patienten, haben wir zwei verschiedene Methoden entwickelt: ein standard-Array bestehend aus einem Festteil Peptide und personalisierte .......
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Diskussion
Das Design des hier beschriebenen Ort Arrays ist für experimentelle Studie über Alloantibody Spezifität in der Transplantationsmedizin gegen ein Organspender HLA-Antigene. Im Gegensatz zu den bestehenden SAB-Assay weitgehend verwendet in Klinik hat die Antigen-Array-Methode einen großen Vorteil im flexiblen Design, das die wahre HLA-Sequenzen des einzelnen Spenders aufnehmen können. Die neue Plattform nutzt die Potenziale der rasant fortschreitenden Technologie DNA-Sequenzierung, der bald in der Lage, genaue HLA Allelen .......
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Offenlegungen
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir bedanken uns bei DRS. Shawn Li und Xing Li der Western University in Kanada für ihre freundliche Unterstützung mit SPOT array Produktion. Wir sind dankbar für die Mitarbeiter der Histocompatibility Kern und an der umfassenden Transplant Center der Northwestern University für die Probe Dienstleistungen. Diese Arbeit wurde teilweise durch Hilfskräfte der Northwestern Memorial Hospital und durch eine Fakultät Gründerfonds zur Verfügung gestellt von der Northwestern University, j.j. unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Peptid-Array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S Lösung | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Fettfreie Milch | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Ziege Anti-Human-IgG HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrat | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc Gel Imaging System | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
Referenzen
- Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
- Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
- Tait, B. D.
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Nachdrucke und Genehmigungen
