Methodenartikel

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

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DOI:

10.3791/56279

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20. Oktober 2017

 ,  ,  , 
1IFM-Department of Chemistry, Linköping University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Amyloid-Ablagerungen ist ein Markenzeichen von verschiedenen Krankheiten und viele andere Organe befällt. Dieses Papier beschreibt die Anwendung der leuchtenden konjugierte Oligothiophene Fluoreszenz Färbung in Kombination mit Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken. Diese Färbung Methode darstellt, ein leistungsstarkes Tool für die Erkennung und Erforschung von Proteinaggregaten in klinischen und wissenschaftlichen Einrichtungen.

Zusammenfassung

Proteine, die als Amyloid im Gewebe im gesamten Körper ablagern können die Ursache oder die Folge einer großen Anzahl von Krankheiten sein. Unter diesen finden wir neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson leidet vor allem das zentrale Nervensystem und systemische Amyloidose wo einzahlen Serum Amyloid A, Transthyretin und IgG Lichterketten als Amyloid in Leber, Karpaltunnelsyndrom Tunnel, Milz, Nieren, Herz und anderen peripheren Geweben. Amyloid ist bekannt und seit mehr als einem Jahrhundert oft mit Amyloid bestimmte Farbstoffe wie Kongo-rot und Thioflavin T (ThT) oder Thioflavin (ThS) untersucht. In diesem Beitrag präsentieren wir Heptamer-Formyl Thiophen Essigsäure (hFTAA) als Beispiel für neu entwickelte Ergänzungen zu dieser Farbstoffe lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes (LCOs) genannt. hFTAA ist einfach zu bedienen und ist kompatibel mit Co Färbung in Immunfluoreszenz oder anderen zellulären Marker. Umfangreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass hFTAA ein breiteres Spektrum von Proteinaggregaten Krankheit verbunden sind als herkömmliche Amyloid Farbstoffe entdeckt. Darüber hinaus kann hFTAA auch für optische Zuordnung der unterschiedlichen aggregierten Morphotypen Studien von Amyloid Fibrille Polymorphismus ermöglichen angewendet werden. Die bildgebende angewandte Methodik ist, zwar optional wir hier zeigen hyperspektralen Bildgebung (KIS), laser-Scan konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz-Lebensdauer-imaging (FLIM). Diese Beispiele zeigen einige der bildgebenden Techniken wo können LCOs als Werkzeuge verwendet werden, um mehr Detailkenntnisse über die Bildung und strukturellen Eigenschaften von Amyloiden zu gewinnen. Eine wichtige Einschränkung, die Technik ist wie bei allen konventionellen Lichtmikroskopie-Techniken, die Forderung nach mikroskopischer Größe der Aggregate um Erkennung zu ermöglichen. Weiterhin sollte das Aggregat umfassen eine sich wiederholende Struktur wie β-Sheet hFTAA Bindung zu ermöglichen. Übermäßige Fixierung und/oder Epitop Exposition, die die aggregierten Struktur oder Konformation ändern kann schlechte hFTAA verbindlich zu machen und daher Beschränkungen in Bezug auf genaue Bildgebung darstellen.

Einleitung

Ablagerung von Amyloid in Geweben ist eine pathologische Markenzeichen in einer Anzahl Krankheiten wie Alzheimer, Morbus Parkinson, systemische Amyloidose und Prion-Krankheiten. Trotz der Prävalenz von Amyloid-Erkrankungen und die Tatsache, die in der Nähe von 40 verschiedenen Proteinen bis dato als Amyloid Vorläufer in menschlichen1klassifiziert wurden, ist wenig über das Verhältnis von Amyloid-Ablagerungen und Krankheit Phänotyp bekannt. Histologie der Proben von menschlichen Patienten wurde sowohl für diagnostische und wissenschaftliche Zwecke verwendet. Eine große Anzahl von Tiermodellen eingerichtet, um die Korrelation zwischen Amyloid Belastung und Verhalten, Lebensdauer und etliche andere phänotypische lesen untersuchen Outs der Krankheit Fortschreiten2,3. In der Arzneimittelforschung und Design zu unseren am meisten gefürchteten Volkskrankheiten Kampf werden auch große Anstrengungen unternommen. Allerdings ist die Bewertung des Zusammenhangs zwischen Genotyp, Phänotyp, Amyloid-Plaques Belastung und Medikamentengabe nicht geradlinig. Die Werkzeuge zum Beizen und imaging von Amyloid in Geweben sind oft stumpf und niedriger Auflösung informieren über Amyloid Entstehung und Struktur.

Kongo-rot Doppelbrechung, ThT und ThS Fluoreszenz sind Beispiele für klassische Methoden zur Erkennung und Analyse von Amyloid Belastung in Gewebeproben von Patienten Biopsien und Post-Mortem-Proben und Tiermodellen der Krankheit4. Diese Techniken werden seit mehreren Jahrzehnten (Kongo-rot seit den 1920er Jahren und ThT und Derivate seit den 1960er Jahren), und obwohl Instrumentierung verfeinert wurde und eine detaillierte Analyse ermöglicht, die befleckenden Verfahren und Analysen werden noch durchgeführt auf die gleiche Weise wie vor fast einem Jahrhundert.

In diesem Artikel beschreiben wir die Nutzung eines hochsensiblen Roman Amyloid Farbstoffes, hFTAA5, die die Erkennung von kleinen unreifen Proteinablagerungen mit hoher Genauigkeit sowie die Erkennung von Reifen Amyloid ermöglicht. Im Vergleich zu konventionellen Farbstoffen, hFTAA nachweislich um ein breiteres Spektrum von Krankheit erkennen Protein Aggregate5,6,7verbunden. Darüber hinaus kann hFTAA auch für optische Zuordnung der unterschiedlichen aggregierten Morphotypen8angewendet werden. Hier beschreiben wir hFTAA Färbung und Analyse des Gewebes von etablierten Tiermodellen der Prion-Krankheit und Amyloid-β Precursor-Protein (APP) transgene Mäuse entwickelt, um Plaque-Entwicklung in der Alzheimer-Krankheit9,10 imitieren . Wir zeigen auch Analyse von Diagnose- und Post-Mortem-Proben von Patienten mit systemischer Amyloidose. Die LCOs haben intrinsische Eigenschaften, die ihnen ermöglicht, über Konformationsänderungen Unterschiede innerhalb einer Plakette zu berichten; und durch die Kombination von zwei LCOs mit unterschiedlichen Eigenschaften hinsichtlich Bindung und Fluoreszenz, der Unterschied noch deutlicher ist11. Einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit langen Pass Filter ausgestattet und ein hyperspektrale Kamerakopf wird verwendet, um objektive Klassifizierung der spektralen Eigenschaften und Aufzeichnung der Aufnahmen für die Spektral-Analyse zu ermöglichen. Konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit einem abstimmbaren Laser als die Anregungsquelle wird verwendet, um die dreidimensionale Eigenschaften eines Amyloid-Plaques im Detail zu bewerten. Durchstimmbare Laser ermöglicht Sammlung von Anregungsspektrums und eine stufenlose Auswahl von Emission Wellenlängen auf dem Mikroskop ermöglicht Co Bildgebung LCO Fluoreszenz und Immunfluoreszenz Co Lokalisierung von Zielprotein und Amyloid zu bestimmen. FLIM bietet beispiellose Empfindlichkeit gegenüber Konformationsänderungen Unterschiede der LCOs auferlegt und zeigen sich Unterschiede, die nicht auf der Fluoreszenz-Emissionsspektren erkannt werden könnte.

Die wichtigsten Ziele mit dem beschriebenen befleckenden Verfahren sind empfindliche Detektion von kleinen Amyloid-Ablagerungen zu erleichtern und Konformationsänderungen Polymorphismus innerhalb von Amyloid-Ablagerungen zu charakterisieren. Dieses Wissen ist wichtig für das grundlegende Verständnis von Protein Aggregation Krankheiten.

Protokoll

Hinweis: LCO Synthese seit mehr als einem Jahrzehnt in unserem Labor durchgeführt wurde. Durch die im wesentlichen Anwendung Protokolle für elektrophiler aromatischer Ersatz, Palladium katalysierte Kreuz-Kupplung, Amid Kupplung und Ester Hydrolyse, passen wir synthetisch Sonden für verschiedene Zwecke 5 , 12. nach Synthese, Charakterisierung und Reinigung, das LCO-Produkt ist lyophilisiert und bei Raumtemperatur gelagert. Einige der Sonden (darunter hFTAA) sind jetzt im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien).

1. LCO Färbelösung

Hinweis: Wenn hFTAA von einem gewerblichen Anbieter gekauft wird, folgen Sie bitte den Hersteller ' s-Anweisungen anstelle von Abschnitt 1.

  1. Aufschwemmen der gefriergetrockneten hFTAA in 2 mM NaOH zur Vorbereitung einer Stammlösung von 1 mg/mL. Lagern Sie in einer Glasflasche bei 4 ° C. Die Aktie kann für ein Jahr gespeichert werden.
  2. Am Tag der Färbung, bereiten Sie eine funktionierende Lösung durch Verdünnung der Lager 1: 10.000 in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).

2. Vorbereitung von Gewebeproben

Hinweis: viele Gewebetypen mit hFTAA als ein Amyloid Marker abgebildet werden können. Beispiele finden Sie in Abbildung 1. hFTAA reagiert empfindlich auf aggregierten Konformation. Die Färbung sollte daher vorzugsweise auf ungestörte Aggregate ohne Epitop Exposition durchgeführt werden. Optimale spektrale Qualität wird erreicht, wenn die Gewebe Fixierung auf ein Minimum reduziert ist. Frisches gefrorenes Material, sanft zum Zeitpunkt der Färbung, in Ethanol fixiert wird daher bevorzugt. Jedoch ist es möglich, auch Amyloide-Ablagerungen im Gewebe zu erkennen, die mit z. B. Formalin fixiert worden. hFTAA dringt das Gewebe in der Regel gut. Wählen Sie eine Probe-Stärke, die mit der beabsichtigten imaging Technik kompatibel ist.

  1. Wenn Formalin fixiert, Parafinembedded, die Bereiche verwendet werden, Deparafinize in Xylol über Nacht. Tauchen Sie die Abschnitte in aufeinander folgenden Bäder von 99 % Ethanol, 70 % Ethanol, dH 2 O und PBS, 10 min in jedem. Die Gewebeschnitte unter Umgebungsbedingungen trocknen lassen.
    Achtung: Xylol erfolgt immer in einem chemischen Abzug. Xylol und anderen organischen Lösungsmitteln sind schädlich.
    1. Cryosections Auftauen bei Zimmertemperatur. Die Gewebeschnitte in 10 % Formalin über Nacht zu beheben und durch Eintauchen in aufeinander folgenden Bäder von 99 % Ethanol, 70 % Ethanol, dH 2 O und PBS, 10 min in jedem rehydrieren. Die Gewebeschnitte unter Umgebungsbedingungen trocknen lassen.
  2. Die Gewebeschnitte zu decken Tropfen hFTAA Arbeitslösung (ca. 200 µL) hinzufügen. Die Tropfen sollten durch Oberflächenspannung bleiben. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur für das Beflecken.
  3. Spülen die Färbelösung mit 500 µL PBS mit einer Pipette und dann tauchen die Folie in der PBS-Bad für 10 min. zulassen Abschnitt unter Umgebungsbedingungen trocknen.
  4. Mit der Fluoreszenz-Eindeckmittel. Eindeckmedium Übernachtung begleichen lassen.
    Hinweis: hFTAA Färbung kann in Kombination mit anderen Färbung Methoden wie Immunfluoreszenz, Zelle oder Organellen spezifischer Marker, etc. durchgeführt werden. Um Co Färbung durchzuführen, führen Sie Ihre komplette Färbung Protokoll der Wahl und fügen Sie am Ende, ab Schritt 2.2 Färbung hFTAA. Beispiele finden Sie in Abbildung 2. Wählen Sie vorzugsweise für Immunfluoreszenz, einen sekundären Antikörper, die auf 640 angeregt wird nm oder höher. In diesem Wellenlängenbereich hFTAA nicht absorbieren und daher nicht aufgeregt und nicht fluoreszieren. Dies sorgt dafür, dass kein durchscheinen zwischen hFTAA und Antikörper zu sehen ist.

3. Mikroskopie

Hinweis: verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit langen Pass Filter ausgestattet. Alle folgenden Einstellungen wurden verwendet, um die Bilder in Abbildung 4 zu erzeugen. Anpassungen können je nach der Amyloid-Typ und Gewebe Probe vorgenommen werden müssen. Obwohl hFTAA verpflichtet, Amyloid stabil zu bleichen, es ist ratsam, die Lichtquelle auszuschalten, wenn der Prüfling nicht geprüft oder abgebildet ist.

  1. HIS
    Hinweis: der Versuch wurde durchgeführt mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit langen Pass Emission Filter und einem Kamerakopf für sein (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Verwendung einer standard Fluoreszenzmikroskop mit langen Pass Filter und eine hyperspektrale Kamera ausgestattet. Stellen Sie sicher, dass die spektrale Kamera kalibriert wird.
    2. In der Software, nennen Sie das Projekt, wählen Sie " spektralen Bild " und Übernahme starten.
    3. Wählen Sie das Objekt des Interesses durch das Okular mit Hilfe des Filters 436 nm Anregung und den Lichtweg auf die Kamera zu verlagern.
    4. In the Fall Data Manager (CDM), wählen Sie die Probenart Spectral, Bezeichnung der Probe und Presse erwerben. Das Erfassungsfenster öffnet.
    5. Im Fenster "Erwerb" " Spectral Imaging ", öffnen Sie das Menü "Einstellungen", wählen Sie Übernahmeeigenschaften und festlegen den Spektralbereich bis 460-700, geben Sie die Geschwindigkeit-Qualität mit maximaler Geschwindigkeit und die Messung am Gas/Laser/schmale Filter. Schließen Sie das Dialogfeld ".
    6. Im Menü "Bild" wählen Sie voller Leben. Deaktivieren Sie in der Bar Symbole Fransen. Auswählen oder Ändern der Größe einer Region zu Bild, das den Speicher Spitzenwert unter 800 MB hat. Legen Sie die Belichtungszeit auf einen Wert, der eine gesamte Bildhelligkeit zwischen 1.000 und 3.000 gibt. Drücken Sie in der Bar Symbole die farbigen Kamera. Übernahme wird gestartet. Bei der Bildaufnahme abgeschlossen ist, drücken Sie auf Speichern in der " Acquire spektralen Bild " Dialogfeld und " neue Zelle " in das Dialogfeld Falldaten Manager.
    7. Von CDM, öffnen die gesammelten Bild mithilfe der Analyse auf die Schaltfläche "Start". Die Daten-Analyse-Fenster öffnet sich.
    8. Spectral Informationen kann von jedem Pixel des Bildes ROIs Spektralanzeige im Dialogfeld Auswahl gesammelt werden. Wählen Sie " definieren, " und ROIs aus den relevanten Bereichen des Bildes auswählen.
    9. Die spektralen Daten speichern als Text-Datei über die Schaltfläche "Lib". Für die Analysesoftware der Wahl kann die gespeicherte .txt-Datei importiert werden. Die .slb-Datei kann für die Analyse im Rahmen der Datenanalyse-Software verwendet werden. Hyperspektrale Cube-Daten aus dem gesamten Bild können auch als eine raw-Datei exportiert werden, als " Schichten als Tif ", oder als " Schichten im Text-Format " für Daten- und Analyseanwendungen mit externer Software.
  2. Konfokalen Mikroskopie
    Hinweis: confocal Mikroskop ist mit einer abstimmbaren Laser als die Anregungsquelle ausgestattet. Für alle Fluoreszenz Emission Experimente, setzen die Laserstärke auf 0,2 % (entsprechend einer Durchschnittsleistung von 3 µW), der Lochkamera zu 1 luftig Einheit, die Rahmengröße auf 1.024 px X 1,024 px, die Scan-Geschwindigkeit als 7 und durchschnittlich über 16 Scans und die Bit-Tiefe als 8-Bit (siehe < s Trong > Tabelle der Materialien). Diese Einstellungen müssen für jedes einzelne konfokale System, Laserquelle und Probenart angepasst werden.
    1. Für das Emissionsspektrum sammeln die Daten mithilfe von Lambda-Modus und die Erregung mit Argon laser Set 488 nm. Emission von 503 bis 687 nm mit 22 Kanäle in der 32-Kanal KEUCHEN Detektor zu sammeln. Stellen Sie Gain auf 755.
    2. , Einkanalige Bilder zu erreichen verwenden der Smartcard einrichten Option. FITC (grün-Filter), stellen Sie Gain auf 750 und für Alexa 535 (Rotfilter) der Gewinn auf 845.
    3. Zu sammeln die Anregungsspektrums mit dem durchstimmbare Laser, Erregung mit 1 nm-Schritten zwischen 490 und 545 nm beim Sammeln von Emission zwischen 551 und 586 nm verwenden. Legen Sie die Laserintensität auf 2 % (entspricht einer Durchschnittsleistung von 30 µW) und der Gewinn um 774.
      4. Durch die Tiefe des Schnitts in Schritten von 0,96 µm Scannen
    4. Z-Stapel in der spektralen Modus zu sammeln. Dieselben Einstellungen wie in Schritt 3.2.1 Anregung und Emission können verwendet werden, jedoch stellen die Verstärkung auf 730.
  3. FLIM
    Hinweis: confocal Mikroskop ist ausgestattet mit einem FLIM-Einheit (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Die folgenden Parameter für confocal Mikroskop einrichten: Pinhole, 20; Erregung Wellenlänge, 490 nm; Laserintensität, 0,5 % (entspricht einer Durchschnittsleistung von 7,5 µW). Gepulste Laser verwenden, bei 40 MHz.
    2. In FLIM Software einrichten Photon zählen mehr als 550 nm. Folgen Sie im Fenster Anzeige-Parameter das Photon zählen, bis die max. Anzahl rund 4.000 Photon zählt.
    3. Die Datei speichern und exportieren Sie es als SPC Bild.
    4. Passen die Daten an ein 2-Komponenten exponentiellen Zerfall in der FLIM-Software. Eine Passform, die ein χ 2 gibt < 2 ist gut. Der Wert auf der y-Achse ist die Anzahl der für die angegebene Lebensdauer.
    5. Wählen Sie einen Schwellenwert für Grafen eingeschlossen werden, z. B. 100. Farbcode von T1 und markieren Sie leben. Der Zerfall ist der Amyloid Struktur abhängig wo die hFTAA gebunden ist. Fluoreszenz-Lebensdauer zwischen 300 und 1000 Ps sind beobachtet worden. Speichern Sie die Datei.
    6. Die raw-Daten mit den Exportoptionen exportieren und speichern Sie die gewünschten Daten in einen neuen Ordner.

Ergebnisse

Empfindliche und selektive Färbung des Amyloid-Ablagerungen aus einer Vielzahl von Proteinen in vielen verschiedenen Gewebetypen von menschlichen Patienten und Versuchstieren ist von entscheidender Bedeutung für die klinische Diagnostik sowie in der wissenschaftlichen Forschung. In diesem Papier, wir demonstrieren, wie dies mit LCOs, veranschaulicht durch hFTAA zum Beizen und multimodale Bildgebung von Amyloid aus einer Auswahl von Gewebetypen erreicht. Seit der ersten Veröffentlichung von Thiophen-basierte Amyloid Liganden vor über zehn Jahren13, Amyloid-Ablagerungen, bestehend aus einer Vielzahl von Proteinen in einer Vielzahl von Geweben haben mit LCOs6,7,11, abgebildet worden 14,15,16 (Abbildung 1). In Kombination mit Antikörpern oder anderen histologischen Marker bieten die LCOs hervorragende Werkzeuge für diagnostische und wissenschaftliche Zwecke (Abbildung 1a, Abbildung 2). Mit der Wahl eines geeigneten fluoreszierenden Marker können mehrere Fluorophore im selben Abschnitt (Abbildung 1a, hFTAA und DAPI, Figur 2a hFTAA Immunfluoreszenz Setup) abgebildet werden. Es ist auch möglich, aufeinander folgenden Abschnitte zum Beizen mit Hellfeld und Fluoreszenz (Abbildung 2 b, hFTAA und DAB Antikörper Färbung) zu verwenden. Vor kurzem hat hFTAA erwiesen eine vielversprechende Ergänzung zur Kongo-Rot Färbung in der klinischen Diagnostik7,15 (Abbildung 3).

Entwicklung bildgebender Verfahren in den letzten Jahrzehnten hat die Notwendigkeit von Amyloid Farbstoffen erhöht, die zwischen Minute, sondern auf die gleiche Zeit tief greifenden Unterschiede in Amyloidablagerungen in einer quantitativen Weise unterscheiden können. Das konjugierte System innerhalb der LCO bietet es eine einzigartige Fähigkeit, Bericht über Variation im Modus der Bindung. Verdrehen des Moleküls kann führen zu Verzerrungen in den Winkeln der Bindung im konjugierten System und behindern den Transport von Elektronen (Abb. 4a). Dies entspricht wiederum auf die fluoreszierenden Eigenschaften der LCO sowohl in Anregung und Emission Wellenlänge Emission Lebensdauer. Wir verwenden seine in eine aufrechte Fluoreszenzmikroskop mit langen Pass Filter für Emissionen ausgestattet. Für Anregung und Emission-Spektren in der konfokalen Mikroskopie und FLIM verwenden wir ein LSM780 mit gepulsten Laser. Um die verschiedenen Techniken zu veranschaulichen, abgebildet wir ein Objekt (Beta-Amyloid (Aβ) Plaque in einer APP transgenen Maus) (Abbildung 4 b–e). Hyperspektrale Fluoreszenz Spektren (Abbildung 4 b) ermöglicht die Bewertung der spektralen Verschiebungen und Intensität Variation innerhalb der verschiedenen Regionen der Plakette. Anregungsspektrums in der konfokalen Mikroskopie (Abb. 4 c) kann verwendet werden, um die optimale Erregung Wellenlänge für nachgeschaltete Experimente, z.B., Kombination mit mehreren Fluorophore Färbung bestimmen. Diese Methode kann auch zur Erkennung von Konformationsänderungen Unterschiede in den Bindungsmodus den LCO nützlich erweisen. Emissionsspektrum im konfokalen Modus kann verwendet werden, um die Fluoreszenz Emission Eigenschaften von hFTAA oder aus einer Kombination von mehreren Fluorophore auszuwertende NS1 in Kombination Experimenten mit mehreren LCOs oder LCO und Immunfluoreszenz bestimmen Kombinationen. Die Fluoreszenz-Lebensdauer der hFTAA ist stark beeinflusst durch kleine Abweichungen in den Bindungsmodus hFTAA. FLIM ist daher ein mächtiges Werkzeug in der Unterscheidung zwischen die Unterschiede auferlegt hFTAA vom Bindungsziel (Abbildung 4D). Dies kann zum Beispiel in die Unterscheidung zwischen verschiedenen Prion Stämme8verwendet werden. Confocal imaging und Verarbeitung Z-Stacks in dreidimensionale Bilder ist ein nützliches Werkzeug für Ausflüge in die Gesamtform des Amyloid Zuschlagstoff (Abb. 4e). Wiederum kann die Verwendung von zusätzlichen Fluorophore Hilfe für das Verständnis der Zusammensetzung einer Anzahlung.

figure-results-1
Abbildung 1: verschiedene Gewebe Arten Proteine Aggregate und zeigt h-FTAA Färbung von: (ein) Mallory-Denk Körper bestehend aus Keratin Aggregate in der Leber (counterstained mit DAPI), (b) p62-positiven R Einschlüsse in sporadischen Einbeziehung Körper Myositis (s-IBM) Muskelgewebe, (c) Amyloid der Insel Amyloid Polypeptid in menschlichen Bauchspeicheldrüse, Gehirn (d) Amyloid Immunglobulin Leichtketten im menschlichen Darm, (e) Schafen Scrapie (Prionen) bei Maus, (f ) Chronic wasting Disease (Prionen) im Gehirn der Maus, (g) Aβ-Plaques im Gehirn der Maus APP23, (h) Aβ Pathologie im Gehirn der Maus APP/PS1 und Biopsie (ich) Fett schmiert von diagnostischen Proben von Transthyretin Amyloid bei menschlichen Patienten 1-4 nach standard Kongo-rot (CR) scoring bewertet. Gelbe Bereiche zeigen hFTAA gebeizt Amyloide-Ablagerungen und blau ist Autofluoreszenz aus Fettgewebe. Die Mensur Bar wird in jedes Panel angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 2: Beispiele für Co Färbung mit Antikörper. (ein) Co-Färbung mit Anti-Serum-Amyloid-Protein A (AA) Immunfluoreszenz und hFTAA von menschlichen AA-Amyloid im selben Abschnitt. Oben links: AA Antikörper Emission 640 nm; oberen rechten hFTAA bei 488 nm; Bodenplatte-overlay-Bild zeigt NS1 in gelb. (b) Antikörper Färbung und hFTAA Fluoreszenz auf aufeinander folgenden Abschnitten. Oberseite: AA Antikörper DAB Färbung, Bodenplatte: hFTAA mit einem Langpass-Emission Filter abgebildet. Maßstab: 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 3: Fluoreszenz mit kurzen Pass Filter auf Transthyretin Amyloid im menschlichen Herzen gefärbt mit Mayers Hämatoxylin/Kongo rot (ein–d) und Mayers Hämatoxylin/hFTAA (e) zu vergleichen. (ein) Hellfeld-Bild (b) Hellfeld, Fluoreszenz, (c) Hellfeld + gekreuzten Polarisatoren, (d) Hellfeld Fluoreszenz + gekreuzten Polarisatoren, (e) hFTAA Fluoreszenz in 405nm + 480 nm Anregung (aufeinander folgende Abschnitte zu einer–d). Maßstab: 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 4: das gleiche Objekt mit hFTAA gebeizt und mit mehreren Techniken abgebildet wird demonstriert mit einem Aβ Plaque in einer gealterten APP23 Maus. (ein) die Fluoreszenz Eigenschaften des hFTAA richtet sich nach seinem conformational Zustand. Struktur der hFTAA in planarer und verdrehten Zustand wird angezeigt. (b) hyperspektralen Bildgebung für die Auswertung der kontinuierlichen Emissionsspektrum. Spektren im unteren Bereich sind farbcodiert nach geschachtelten Regionen von Interesse im Bild. (c) (i) Confocal Imaging für Erregung Bildgebung und (Ii und Iii) Spektrum und Emission Imaging im Filter oder (iv) spektrale Modus. (d) Fluoreszenz Lifetime Imaging zur Erkennung von Konformationsänderungen Unterschiede in das Amyloid, wo eine kürzere Lebensdauer befinden sich in der Peripherie der Aβ-Plakette und die Standzeiten sind länger in der Mitte der Plakette. Histogramm im unteren Bereich zeigt die Verteilung der Standzeiten für die gesamte Tafel. Das Bild wird entsprechend der Skala unterhalb des Histogramms eingefärbt. (e) konfokale Z-Stapel gesammelt im Filtermodus, die dreidimensionale Struktur von Objekten anzeigen lassen. Die Mensur Bar wird in jedes Panel angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Ablagerung von akzessorisch gefaltete Proteine in Amyloid ist ein zentrales Ereignis der vielen Krankheitsprozessen. Extrazelluläre Amyloid-Plaques aus Aβ-Peptide und intrazelluläre neurofibrillären Verschlingungen durch hyperphosphoryliertem Tau gebildet werden im Gehirn von Alzheimer-Patienten gefunden. Eine Auswahl der verschiedenen Proteinen, z.B., Transthyretin (TTR), Komponente Serum Amyloid A (SAA) und IgG Lichterkette Misfold und manifestiert sich als Amyloid-Ablagerungen im Gewebe außerhalb des ZNS. Obwohl Amyloid Ablagerungen wurden bekannt und studierte seit mehr als einem Jahrhundert, wir noch fehlen detaillierte Kenntnis der wie Amyloid wird Ablagerung auf molekularer Ebene und was kann getan werden, um zu verhindern, dass dieser Prozess initiiert. Für die Alzheimer-Krankheit ist es notwendig zu bestätigen, wie der Prozess der Amyloidose Neurodegeneration zugeordnet ist. Ein Schlüssel-Quest auf der Mission, Amyloidose zu behandeln ist, Entwicklung neuer Tools für die Überwachung von Amyloid Einleitung, Progression und Regression verfeinert; Daher ist die gezielte Amyloid Erkennung Schlüssel. Auf lange Sicht profitieren klinische Diagnostik erhöht die Empfindlichkeit und Selektivität von Amyloid Färbung Methoden7,15. Aktuelle Herausforderungen in dieser Hinsicht sind enorm und ist ein sehr aktives Forschungsgebiet. Ein Hauptproblem für die klinische Entwicklung und Studien ist prognostische Diagnose. Diese Krankheiten wahrscheinlich beginnen, lange bevor Symptome auftreten, aber mit zu beginnen Behandlung Identifizierung der Krankheit muss. Empfindlichkeit ist hier ein wichtiger Aspekt für neuartige Methoden. Darüber hinaus ist dieses Problem noch komplizierter, weil einige Protein-Aggregate giftig sind, einige sind Schutz- und einige sind neutral. Daher unbedingt die Möglichkeit, bestimmte aggregierte Morphotypen überwachen, da die Existenz von aggregierten Arten vorgeschlagen worden ist, um zu erklären, die heterogene Phänotyp für eine Vielfalt von neurodegenerativen Protein Aggregation Erkrankungen gemeldet. Zum Beispiel ist das Prion-Protein ein klassisches Beispiel dafür, wie eine identische primäre Sequenz der Aminosäuren in unterschiedliche Aggregat Morphotypen, misfold kann die spezifische Prion Belastungen hervorrufen. Ähnliche Polymorphismus wurde auch für die Aβ-Peptid, α-Synuclein und Tau berichtet. In diesem Zusammenhang wurden LCOs gezeigt, hervorragende Werkzeuge für optische Zuordnung der unterschiedlichen aggregierten Morphotypen sein. Prion-Stamm-spezifische Protein aggregiert, Proteinablagerungen in mehrere Arten von systemischen Amyloidose sowie polymorphe Aβ gefunden und Tau Aggregate durch die conformationally induzierte optische Erscheinung, beobachtet von der LCOs ausgezeichnet.

Amyloid-Ablagerung ist ein Ereignis, das im Gewebe, die schwer stattfindet zu durchdringen mit biochemischen und biophysikalischen Methoden der molekularen Präzision. Die Möglichkeit, Ereignisse ex Vivo, in Vivound in Vitro die gleichen LCO-Moleküle mit Sonde Bühnenbilder die für entwirren Ereignisse in Vivo mit Techniken, die nur möglich auf ex Vivo oder anzuwenden sind Vitro 11,17Proben. Ein kürzlich berichtet hochauflösende strukturelle Modell zeigt, dass die LCO Pentameric FTAA (pFTAA) in einem Hohlraum gebildet durch abgestimmte Seitenketten parallel zur Fibrille Achse umfasst 6 parallele Beta-Stränge in Register18 bindet, zeigt, dass es möglich, atomarer Auflösung wissen über die Elemente des Ziels LCO gewinnen. Im wesentlichen ähnelt der Bindungsmodus Hohlraum und Bindung des pFTAA der Kongo-rot19, diktiert durch eine Nut mit sich wiederholenden positiv geladenen Lys-Seitenketten ausgekleidet. Die Affinität der LCOs scheinen besser zu Kongo-rot wahrscheinlich wegen Kette Flexibilität und starke van der Waals Wechselwirkungen der Atome Schwefel der Thiophen Ringe gegenüber dem hydrophoben Hohlraum verglichen werden. Die Erkennung von prefibrillar Arten (vor ThT antwortet)5,20 erscheint abhängig von sich wiederholenden β Blätter, bestehend aus-Register Parallel-Beta-Stränge, die für hFTAA werden zwei Thiophen Einheiten länger als pFTAA wäre umfassen Sie Kreuzung von bis zu 8 Beta-Stränge.

Die Färbung Protokoll erfordert Aufmerksamkeit auf die folgenden Schritte zur Fehlerbehebung: (i) Fixierung: umfangreiche Fixierung von Gewebeproben stören die Amyloide-Struktur und begrenzen die Möglichkeit, in Fluoreszenz Spektren durch induzierte Variation erkennen kann Konformationsänderungen Verzerrung des Moleküls hFTAA. Milde Fixierung des Cryosections aus Tiefkühlfrische Material wird bevorzugt, um optimale spektrale Auflösung zu erreichen. Jedoch wird hFTAA beflecken und fluoreszieren Amyloid im festen Gewebe jedoch mit verminderten Wirksamkeit und weniger spektrale Variation. (Ii) Epitop Exposition: Vorbehandlung des Gewebes zu Epitop Belichtung zu erzielen, für die Antikörperbindung gelegentlich die Möglichkeit für hFTAA wegen der Bindung reduzieren könnte gestört Amyloid Struktur. Wenn dies ein Problem, und Epitop Exposition ein entscheidender Schritt in der Antikörper Färbeprotokoll ist, mit aufeinanderfolgenden Abschnitten für Antikörper und hFTAA, kann bzw. betrachtet werden. (Iii) overstaining: hFTAA ist extrem empfindlich. Funktionierende Lösungen sollten bei niedrigen nM Konzentration gehalten werden. Verringern Sie die Konzentration der hFTAA Hintergrundfärbung ist ein Problem. Wenn Elemente, die hFTAA binden spärlich im Gewebe sind, kann ein Übermaß an hFTAA aggregieren und reichern sich in der Montage-Medium. Dies wird als Fluoreszenz anerkannt, die nicht in der Fokusebene des Gewebes selbst. Wenn dies angezeigt wird, Tauchen Sie die angebrachte Folie mit PBS-Puffer bis das Deckglas des Abschnitts verschiebbar, waschen mit PBS und remount mit frischen Eindeckmittel und einem neuen Deckglas. (iv) Filter basierte Bildgebung: dieses Paper beschreibt meist spektral aufgelöst Fluoreszenz-Bildgebung mit langen Pass filtern oder mehrere Erkennung Kanäle. hFTAA kann auch mit kurzen Pass Filter überwacht werden. Bitte beachten Sie, dass dadurch verringert sich den Kontrast und Abschaffung der Möglichkeiten um mehrere Farben zu erkennen.

In den vergangenen Jahren hat gezeigt, dass als Werkzeuge, fluoreszierende LCOs Forschung und insbesondere hFTAA zeigen vielversprechende Eigenschaften. Ergebnisse haben gezeigt, für eine Vielzahl von Proteinen und Krankheitszustände, angefangen bei hFTAA Erkennung der Aggregate innerhalb der Zellen (Tau, Einbeziehung Körper Myositis), systemische Amyloid Serum Amyloid A, Transthyretin, Immunglobulin-Leichtketten (Kappa und Lambda) Seminogelin 1, Prion-Protein (einschließlich klinische Proben)21Islet Amyloid Polypeptid und Insulin7,15. Ein limitierender Faktor für die Umsetzung der hFTAA als diagnostisches Werkzeug ist, dass die Fluoreszenz-Mikroskopie nicht ausgiebig in Routine Amyloid Pathologie Labors verwendet wird. Darüber hinaus ist er in der Klinik nicht erhältlich. Allerdings hFTAA Amyloid Färbung und Fluoreszenz-Mikroskopie in klinischen Labors in einem Filter basierend Fluoreszenzmikroskop benutzt worden und sollteals ein kostenloses diagnostisches Verfahren betrachtet werden. Dies zeigte sich vor kurzem auf Karpaltunnel Biopsien mit Transthyretin-Amyloidose mit Grundeinstellungen für Fluoreszenz in einer automatisierten Weise22.

Darüber hinaus neben verschiedenen Proteinen hFTAA Fluoreszenz erkennt eine Vielzahl von Fibrille Typen und Pre fibrillären Amyloid Aggregate, z.B., Weg fibrillären Arten erkannt und gekennzeichnet wurden. In dieser Publikation haben wir eine LCO auf verschiedenen Probenarten mit drei Mikroskopiertechniken demonstriert. Die Verwendung von kontrollierten Synthese hat auch für die Entwicklung von LCOs für vielseitige Erkennung von biomolekularen Ziele, z.B.Erfassung von Interaktionen durch Surface Plasmon Resonance (SPR)23 und enzymatische für Positronen Emissions erlaubt. Tomographie (PET)24.

Bis heute wurden mehr als 25 verschiedenen LCOs mit veröffentlicht. Ein vermehrter Einsatz von LCOs für die Darstellung von Amyloidablagerungen erhöht sich das Wissen und Verständnis, wie diese Krankheit verbundenen Aggregate montieren, demontieren und stören die Organe und Personen, die in denen sie wohnen.

Offenlegungen

PH PN MB SN sind kleinere Aktionäre in Ebba Biotech, die hFTAA unter dem Markennamen Amytracker545 vermarktet.

Danksagungen

Die Autoren möchten Mikael Lindgren und Chanan Sluzny Danke für Ratschläge, Fluoreszenz-Mikroskopie und Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark pro Westermark und Kurt Zatloukal zur Verfügung gestellt Gewebeschnitte oder Aufnahmen, die in dieser Publikation angezeigt. Die Auflistung der hier präsentierten Daten durch Beiträge von schwedischen Brain Foundation (Hjärnfonden), der schwedischen Alzheimer Association (Alzheimerfonden), der schwedischen Forschungsrat (VR), der Verein Göran Gustafsson Georg finanziert wurde & Astrid Olsson, EU FP7 Gesundheitsprojekt LUPAS und Universität Linköping.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
hFTAA/Amytracker545Ebba Biotech
Dako Fluoreszenz-EindeckmediumAgilent technologiesGM304
LeicaDM6000Leica
Lumen 200Prior
Spectraview SystemASI Spectral Imaging
Spectraview SoftwareASI Spectral Imaging
LSM780Zeiss
Zen 2010b v6.0 SoftwareZeiss
FLIM SystemBecker & Hickl
Ar/ML 458/488/514Zeiss
Tunable Laser In TuneZeiss

Referenzen

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