Die organoide Rekonstitution Assay (ORA) für die funktionelle Analyse von intestinale Stammzellen und Nische Zellen

Zusammenfassung

Intestinale organoide Kulturen werden aus ganzen Krypten und erlauben nicht die Analyse der Selbsterneuerung und Differenzierung in eine Zelle-spezifische Art und Weise. Dieses Protokoll beschreibt Rekonstitution der sortierten Stamm (Lgr5⁺) und Nische (Paneth) Zellen, die Organellen hervorrufen und ermöglicht ihre vorherige biochemische und genetische Modifikation und Funktionsanalyse.

Zusammenfassung

Das Darmepithel zeichnet sich durch eine extrem hohe Fluktuationsrate. Bei Säugetieren ist die gesamte epitheliale Auskleidung innerhalb von 4-5 Tagen erneuert. Intestinaler Stammzellen befinden sich am unteren Rand der Krypten Lieberkühn, sind bestimmt durch die Expression des Lgr5 -Gens und Homöostase durch ihre charakteristische hohe proliferative Rate¹erhalten. In den Dünndarm Lgr5⁺ Stammzellen sind vermischt mit spezialisierten sekretorischen Zellen Paneth-Zellen genannt. Paneth-Zellen sezernieren antibakterielle Verbindungen (d. h., Lysozym und Cryptdins/Defensine) und eine Kontrollfunktion auf die Darmflora ausüben. Vor kurzem wurde eine neue Funktion für Paneth Zellen, nämlich ihre Fähigkeit zur Nische unterstützen Lgr5⁺ Stammzellen durch mehrere wichtige Liganden Wnt3, EGF und Dll1²entdeckt.

Als Ex-Vivo isoliert und in Anwesenheit von bestimmten Wachstumsfaktoren und Komponenten der extrazellulären Matrix kultiviert, ganze Darm Krypten führen zu langlebigen und selbst erneuern 3D-Strukturen genannt Organellen, die Krypta-Villus sehr ähneln epitheliale Architektur des Erwachsenen Dünndarm³. Organoide Kulturen, wenn hergestellt aus ganzen Krypten, ermöglichen die Untersuchung der Selbsterneuerung und Differenzierung von der intestinalen Stammzellnische allerdings ohne Adressierung des Beitrags der einzelnen Komponenten, nämlich der Lgr5⁺ und Paneth-Zellen.

Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz zur organoide Assays, die die Fähigkeit der Paneth nutzt und Lgr5⁺ Zellen verbinden und Organellen bilden wenn Co kultiviert. Dieser Ansatz, hier als "organoide Rekonstitution Assay" bezeichnet (ORA), ermöglicht die genetische und biochemische Änderung Paneth oder Lgr5⁺ Stammzellen, gefolgt von der Rekonstitution in Organellen. So ermöglicht es die Funktionsanalyse der zwei Hauptkomponenten der intestinalen Stammzellnische.

Einleitung

Das Darmepithel ist das am schnellsten selbst erneuernde Gewebe im Säugetier-Körper und als solche wurde das Objekt von einer Vielzahl von Studien, die darauf abzielen, die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von adulten Stammzellen, die ihren Wohnsitz am unteren Rand der Krypta der Lieberkühn, zweckgebundene durch Expression des Lgr5 -Gens und kanonischer Wnt Signale¹abhängig. Insbesondere sind Lgr5⁺ Stammzellen flankiert und unterstützt durch spezielle Nische Zellen, d.h. Paneth-Zellen, die auch abhängig von Wnt signalisieren für ihre Reifung². Zusammen, diese beiden....

Protokoll

Alle Verfahren wurden nach lokalen Tierschutz Gesetze und Richtlinien durchgeführt.

1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte

1. Autoklav 1 Satz Darm Schere, normalen Scheren und Pinzetten in einen sterilen Behälter.
2. Statt einer 96-Well (Flachboden) Gericht in einem Inkubator bei 37 ° C.
3. Bereiten Sie 10 mL komplette Kulturmedium mit den Reagenzien in Tabelle Materialien aufgeführt.
4. Inkubieren Sie das komplette Medium bei 37 ° C im Wasserbad.
5. Tauen Sie rekonstituierte Basalmembran, indem man sie in einen Eiskübel. Die rekonstituierte Basalmembran wird bei 4 ° C flüssig werden.....

Ergebnisse

Die organoide Rekonstitution Assay ermöglicht die separate funktionelle Analyse der wesentlichen Nische und Stammzellforschung Komponenten des Darmepithels, hier durch kleine interferierende RNA (SiRNA) des Apc -Gens nachgewiesen.

Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir zuerst verwendet Fluoreszenz aktivierte Zelle sortieren (FACS) um 8000 Lgr5⁺ und 6000 Paneth Zellen von Inzucht C57BL6/J Mäusen zu tr.......

Diskussion

Die ORA ermöglicht die raffinierte funktionelle Analyse von zwei wesentlichen Komponenten der intestinalen Stammzellnische, nämlich Lgr5⁺ und Paneth Zellen. Dieser Ansatz wurde bisher von uns und anderen mit leichten Modifikationen^6,10,11eingesetzt. Hier präsentieren wir Ihnen das ORA-Verfahren als eine reproduzierbare und standardisierte Laborprotokoll. Außerdem berichten wir über die Auswirkungen der Ap.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Endkonzentration: 10 mM
Penicillin/Streptomycin *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Endkonzentration: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Endkonzentration: 10 mM
Rekombinanter Maus-EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Endkonzentration: 50 ng/ml
Rekombinanter Maus-Noggin *	Peprotech	250-38	Endkonzentration: 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Endkonzentration: 10 & Mikro; M
Zagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Endkonzentration: 1 &Mikro; M
Rekombinantes murines R-Spondin *	R& D systems	3474-RS-050	Endkonzentration: 1 mg/ml
Flexitube Genlösung siRNA APC	Qiagen	GS11789	Endkonzentration: 100 nM
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Low Binding Röhrchen	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* Die Kombination dieser Reagenzien stellt das vollständige Nährmedium

102424 dar