Die organoide Rekonstitution Assay (ORA) für die funktionelle Analyse von intestinale Stammzellen und Nische Zellen

Zusammenfassung

Intestinale organoide Kulturen werden aus ganzen Krypten und erlauben nicht die Analyse der Selbsterneuerung und Differenzierung in eine Zelle-spezifische Art und Weise. Dieses Protokoll beschreibt Rekonstitution der sortierten Stamm (Lgr5⁺) und Nische (Paneth) Zellen, die Organellen hervorrufen und ermöglicht ihre vorherige biochemische und genetische Modifikation und Funktionsanalyse.

Zusammenfassung

Das Darmepithel zeichnet sich durch eine extrem hohe Fluktuationsrate. Bei Säugetieren ist die gesamte epitheliale Auskleidung innerhalb von 4-5 Tagen erneuert. Intestinaler Stammzellen befinden sich am unteren Rand der Krypten Lieberkühn, sind bestimmt durch die Expression des Lgr5 -Gens und Homöostase durch ihre charakteristische hohe proliferative Rate¹erhalten. In den Dünndarm Lgr5⁺ Stammzellen sind vermischt mit spezialisierten sekretorischen Zellen Paneth-Zellen genannt. Paneth-Zellen sezernieren antibakterielle Verbindungen (d. h., Lysozym und Cryptdins/Defensine) und eine Kontrollfunktion auf die Darmflora ausüben. Vor kurzem wurde eine neue Funktion für Paneth Zellen, nämlich ihre Fähigkeit zur Nische unterstützen Lgr5⁺ Stammzellen durch mehrere wichtige Liganden Wnt3, EGF und Dll1²entdeckt.

Als Ex-Vivo isoliert und in Anwesenheit von bestimmten Wachstumsfaktoren und Komponenten der extrazellulären Matrix kultiviert, ganze Darm Krypten führen zu langlebigen und selbst erneuern 3D-Strukturen genannt Organellen, die Krypta-Villus sehr ähneln epitheliale Architektur des Erwachsenen Dünndarm³. Organoide Kulturen, wenn hergestellt aus ganzen Krypten, ermöglichen die Untersuchung der Selbsterneuerung und Differenzierung von der intestinalen Stammzellnische allerdings ohne Adressierung des Beitrags der einzelnen Komponenten, nämlich der Lgr5⁺ und Paneth-Zellen.

Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz zur organoide Assays, die die Fähigkeit der Paneth nutzt und Lgr5⁺ Zellen verbinden und Organellen bilden wenn Co kultiviert. Dieser Ansatz, hier als "organoide Rekonstitution Assay" bezeichnet (ORA), ermöglicht die genetische und biochemische Änderung Paneth oder Lgr5⁺ Stammzellen, gefolgt von der Rekonstitution in Organellen. So ermöglicht es die Funktionsanalyse der zwei Hauptkomponenten der intestinalen Stammzellnische.

Einleitung

Das Darmepithel ist das am schnellsten selbst erneuernde Gewebe im Säugetier-Körper und als solche wurde das Objekt von einer Vielzahl von Studien, die darauf abzielen, die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von adulten Stammzellen, die ihren Wohnsitz am unteren Rand der Krypta der Lieberkühn, zweckgebundene durch Expression des Lgr5 -Gens und kanonischer Wnt Signale¹abhängig. Insbesondere sind Lgr5⁺ Stammzellen flankiert und unterstützt durch spezielle Nische Zellen, d.h. Paneth-Zellen, die auch abhängig von Wnt signalisieren für ihre Reifung². Zusammen, diese beiden Zelltypen zugrunde liegen Selbsterneuerung der intestinalen epithelialen Auskleidung und die täglichen homöostatische Gleichgewicht zu bewahren: Lgr5⁺ Stammzellen schnell teilen und geben Anlass zu Vorläuferzellen und mehr spezialisierte intestinale epitheliale Zellen; Paneth-Zellen liefern wesentliche Nische Faktoren (z. B.Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5⁺ Stammzellen-². Die Kapazität der intestinalen Krypten wenn vergoldet ex Vivo , organisierte und selbst erneuernde Strukturen bilden Organellen oder "Mini-Mut", genannt wurde als ein experimentelles Werkzeug, um Einblick in Prozesse wie Selbsterneuerung ausgeschöpft und Differenzierung in normalen und pathologischen Bedingungen einschließlich Krebs⁴. Organoide Kulturen wurden aus mehreren Geweben, einschließlich der Darm, Bauchspeicheldrüse, Leber und Nieren, Maus-und Humanproben⁴eingerichtet. Der Extraktionsmethode und die Wachstumsfaktoren eingesetzt, um diese organoide Kulturen entwickeln sind gewebespezifisch und Multi-Linie Differenzierung und imitieren so nah wie möglich der ursprünglichen Stammzellnische in-vivo. Organellen können potenzielle Anwendungen, einschließlich der Behandlung von Erbkrankheiten, die Beurteilung der therapeutische Wirksamkeit bei Krebs, die Analyse der Medikamententoxizität oder das Studium der Organogenese in-vitro-⁵haben.

Insgesamt ist die wichtigste Einschränkung der organoide Kulturen als aus Gewebeproben einen Mangel der Zelle-Spezifität. Zum Beispiel Darm Organellen hergestellt aus ganzen Darm Krypten erlauben nicht die Analyse der einzelnen Zellbestandteile umfasste innerhalb der Gewebe-Quelle (z.B.ganze Krypten enthalten Lgr5⁺, Paneth, und Vorläuferzellen).

Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, genannt ORA, die die Vorzüge der intestinalen organoide Kulturen mit der Funktionsanalyse der grundlegendsten Komponenten, nämlich Stamm (Lgr5⁺) und Nische (Paneth) Zellen verbindet. Dies geschieht durch die einzigartige Fähigkeit der Paneth und Lgr5⁺ -Zellen um körperlich zu verknüpfen mit einander wenn Co inkubiert und Anlass zu Organellen^{2,6,10 geben}. Wir nutzten diese Funktion und vorbehandelt zwei Zelltypen einzeln vor, so dass sie Organellen zu rekonstruieren. Wenn Sie dies tun, kann jede Zelle-Komponente bestimmten Droge, Wachstumsfaktor, biochemische Inhibitor, Gentechnik oder chemische Behandlung vor der Rekonstitution und organoide Bildung ausgesetzt werden. Deshalb wird mit der ORA-Assay erlauben die Bestimmung, ob eine spezifische medikamentöse Behandlung oder gentechnische Veränderung hat eine spezifische Wirkung auf die Stammzellen oder ihre Nische Pendant.

Protokoll

Alle Verfahren wurden nach lokalen Tierschutz Gesetze und Richtlinien durchgeführt.

1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte

1. Autoklav 1 Satz Darm Schere, normalen Scheren und Pinzetten in einen sterilen Behälter.
2. Statt einer 96-Well (Flachboden) Gericht in einem Inkubator bei 37 ° C.
3. Bereiten Sie 10 mL komplette Kulturmedium mit den Reagenzien in Tabelle Materialien aufgeführt.
4. Inkubieren Sie das komplette Medium bei 37 ° C im Wasserbad.
5. Tauen Sie rekonstituierte Basalmembran, indem man sie in einen Eiskübel. Die rekonstituierte Basalmembran wird bei 4 ° C flüssig werden.
6. Füllen Sie 4 Petrischalen mit kalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung oder abgekürzt PBS (4 ° C).

2. Isolierung der kleinen Darm Krypten

1. Opfern von CO₂ Inhalation Lgr5- eGFP-IRES-CreER^t2 Maus auf einem C57BL6/J-Hintergrund. Zerlegen Sie das Peritoneum längs mit einer Schere.
2. Halten Sie den Magen mit der Zange und quer in zwei Hälften geschnitten.
3. Mit der intestinalen Schere von nun an, ziehen Sie den Darm und legen Sie sie in eine Petrischale mit PBS.
   Hinweis: Darm Scheren haben eine scharfe und eine stumpfe Spitze. Die stumpfe Spitze diese Schere soll nicht die Krypta-Villus Architektur beschädigt beim Öffnen des Darms.
4. Beginnen Sie damit die stumpfe Spitze in den Magen, und schieben Sie es durch den Pylorus. Fahren Sie fort, indem Sie mit der Schere schneiden und mit der Zange.
5. Sobald der gesamte Dünndarm längs geöffnet wird, indem Sie es mit der Zange halten in kaltem PBS waschen Sie und spülen Sie ihn sanft in die PBS-Lösung mit u-förmigen Bewegungen.
6. Sobald die Hocker Reste gerodet werden, fahren Sie mit den Darm auf ein Schneidebrett, luminalen Seite nach oben zu glätten. Die luminalen Seite ist leicht erkennbar durch das Fehlen der Blutgefäße und durch sein blasses Aussehen im Vergleich zu den äußeren Teil.
7. Entfernen Sie mit einer Glas-Folie vorsichtig die Zotten durch Abkratzen der abgeflachten Darms. Führen Sie diesen Schritt zweimal über die gesamte Länge des Gewebes.
8. Schneiden Sie der Dünndarm mit einer sterilen chirurgischen Klinge in 2-5 mm Stücke.
9. Legen Sie die kleinen Darm Fragmente in ein 50 mL-Tube mit 10 mL Eis kaltem PBS.
10. Reinigen Sie die Gewebefragmente, entfernen alle restlichen Verunreinigungen durch pipettieren sie rauf und runter in die PBS. Verwerfen Sie überstand und wiederholen Sie diesen Schritt, bis die PBS völlig klar ist.
11. Fügen Sie 15 mL kaltem PBS, um das endgültige Gesamtvolumen der PBS zu 25 mL. Fügen Sie 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) und 45 min auf einer Walze bei 4 ° c inkubieren
12. Entsorgen Sie die PBS/EDTA.
13. Fügen Sie 10 mL PBS und lösen Sie die Krypten, indem die Gewebefragmente Pipettieren hart nach oben und unten (mindestens dreimal). Den Überstand zu sammeln.
14. Wiederholen Sie Schritt 2.13 viermal. Fügen Sie zu einem Endvolumen von 50 mL Kulturmedium.
15. Pellet-Zellen durch Zentrifugation (300 X g für 5 min).
16. Das Pellet in 10 mL Kulturmedium Aufschwemmen und pellet die Krypten durch Zentrifugieren (80 X g für 3 min).

3. einzelne Zelle Vorbereitung

1. Verwerfen den überstand die gebeizte Krypten und ihnen in 1 mL Trypsin Like-Enzyme zusammen mit 50 µL Aufschwemmen DNAse (50 µg/mL).
2. Inkubieren Sie die Zellen in einem Wasserbad bei 32 ° C für 2 min.
3. 10 mL Kulturmedium hinzugeben. Die Krypten in Einzelzellen zu distanzieren, hart Pipettieren oben und unten mindestens 5 Mal.
4. Filtern Sie die Lösung durch ein 40 µm-Sieb (um Klumpen und andere Verunreinigungen zu beseitigen) und pellet-Einzelzellen 300 X g für 5 min.

(4) flow Cytometry und Beschichtung

1. 50 mL 1 X Hank gepufferte Salzlösung oder HBSS/2% fetalen Kuh Serum (FCS) Lösung vorbereiten und das Pellet in 1 mL für jeden 10⁶ Zellen Aufschwemmen
2. Hinzu kommt die Zellsuspension BV421 Lin^– (CD31, CD45, TER119) in einer Konzentration von 1: 100, und CD24-APC und CD117-PE sowohl bei einer Konzentration von 1: 250 Antikörper für 30 Minuten.
3. Art Lgr5⁺ Stammzellen und Paneth Zellen in separaten Low binden Röhren. Einzelheiten zur Sortierung Protokolle für Lgr5⁺ und Paneth Zellen, siehe Roth Et Al. ⁷ und Schewe Et al. ⁶
   1. Zentrifuge der sortierten Zellen bei 300 X g für 5 min. der Zellen in 100 µL Medium mit den Komponenten wie 1.3 beschrieben Aufschwemmen (siehe die Tabelle der Materialien).
4. Behandeln (z.B.durch chemische oder genetische Modifikation) Paneth-Zellen (n = 2000) oder die Lgr5⁺ -Stammzellen (n = 2000).
   1. Um Zellen zu behandeln, verwenden 5 µL der Liposomen-vermittelte Transfektion Reagenz in einem Gesamtvolumen von 100 µL Nährmedium und kleine interferierende RNA (SiRNA) in einer Konzentration von 100 nM. 30 min bei 37 ° C für SiRNA oder für die notwendige Zeit für die gewählten Modifikation inkubieren.
5. Waschen Sie die Zellen zweimal in 500 µL Kulturmedium.
6. 300 X g für 5 min Zentrifugieren und die Zellen in 10 µL Kulturmedium Aufschwemmen.
7. Bündeln die beiden zellulären Komponenten (Paneth oder Lgr5⁺ Zellen) in einer 20 µl Gesamtvolumen und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei RT
8. Gemeinsam brüten die Paneth und Lgr5⁺ Zellen für 10 min bei RT
9. 10 µL des Überstands und lassen ein Meniskus Flüssigkeit um sicher zu sein, nicht die Zelle Pellet Aspirieren.
10. Die Zellen für ein Gesamtvolumen von 40 µL 30 µL rekonstituierte Basalmembran hinzu, Aufschwemmen der Zellen und in eine vorgewärmte 96-well-Platte-Platte. Nach 10 min, 200 µL kompletten Medium hinzufügen (siehe die Tabelle der Materialien). Wechsel-Medium alle 48 h.
11. Graf organoide Multiplizität am 5. Tag.

Ergebnisse

Die organoide Rekonstitution Assay ermöglicht die separate funktionelle Analyse der wesentlichen Nische und Stammzellforschung Komponenten des Darmepithels, hier durch kleine interferierende RNA (SiRNA) des Apc -Gens nachgewiesen.

Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir zuerst verwendet Fluoreszenz aktivierte Zelle sortieren (FACS) um 8000 Lgr5⁺ und 6000 Paneth Zellen von Inzucht C57BL6/J Mäusen zu tr...

Diskussion

Die ORA ermöglicht die raffinierte funktionelle Analyse von zwei wesentlichen Komponenten der intestinalen Stammzellnische, nämlich Lgr5⁺ und Paneth Zellen. Dieser Ansatz wurde bisher von uns und anderen mit leichten Modifikationen^6,10,11eingesetzt. Hier präsentieren wir Ihnen das ORA-Verfahren als eine reproduzierbare und standardisierte Laborprotokoll. Außerdem berichten wir über die Auswirkungen der Ap...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Endkonzentration: 10 mM
Penicillin/Streptomycin *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Endkonzentration: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Endkonzentration: 10 mM
Rekombinanter Maus-EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Endkonzentration: 50 ng/ml
Rekombinanter Maus-Noggin *	Peprotech	250-38	Endkonzentration: 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Endkonzentration: 10 & Mikro; M
Zagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Endkonzentration: 1 &Mikro; M
Rekombinantes murines R-Spondin *	R& D systems	3474-RS-050	Endkonzentration: 1 mg/ml
Flexitube Genlösung siRNA APC	Qiagen	GS11789	Endkonzentration: 100 nM
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Low Binding Röhrchen	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* Die Kombination dieser Reagenzien stellt das vollständige Nährmedium

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