Method Article

Quantifizierung von Mikroorganismen in geringen Konzentrationen mit Hilfe digitalen holographischen Mikroskopie (DHM)

DOI:

10.3791/56343

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November 1st, 2017

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1Department of Medical Engineering, California Institute of Technology, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Jet Propulsion Laboratory, California Institute of Technology

In This Article

Summary

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Digitaler holographischer Mikroskopie (DHM) ist eine volumetrische Technik, die können bildgebende Proben, die 50-100 X dicker als Hellfeld Mikroskopieren mit vergleichbarer Auflösung, mit der Fokussierung durchgeführt Nachbearbeitung. Hier DHM dient zur Identifizierung, zählen, und verfolgen Mikroorganismen bei sehr niedrigen dichten und verglichen mit optischen Dichtemessungen, Keimzahl und direkte Zählung.

Abstract

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Genau erkennen und zählen spärliche bakterielle Proben hat viele Anwendungen in der Lebensmittel-, Getränke- und pharmazeutischen Industrie, in der medizinischen Diagnostik und für die Lebens-Erkennung von unbemannten Missionen zu anderen Planeten und Monde des Sonnensystems. Derzeit sind spärliche bakterielle Proben von Kultur-Beschichtung oder Epifluoreszenz Mikroskopie gezählt. Kultur-Platten erfordern lange Inkubationszeit Zeit (Tage bis Wochen) und Epifluoreszenz Mikroskopie erfordert umfangreiche Färbung und Konzentration der Probe. Hier zeigen wir wie einfallenden digitalen holographischen Mikroskopie (DHM) zum Auflisten von Bakterien in sehr verdünnter Kulturen (100-104 Zellen/mL). Erstens ist der Bau von benutzerdefinierten DHM zusammen mit detaillierten Anweisungen auf den Aufbau einer kostengünstigen Instrument diskutiert. Die Grundsätze der Holographie werden besprochen, und ein statistisches Modell wird verwendet, um abzuschätzen, wie lange Videos sollte sein, Zellen, basierend auf die optische Leistungsmerkmale des Instruments und die Konzentration der bakterielle Lösung (Tabelle 2) zu erkennen . Videoerkennung von Zellen bei 105, 104, 103und 100 Zellen/mL zeigt sich in Echtzeit mit UN-rekonstruierten Hologrammen. Rekonstruktion von Amplitude und Phase Bildern zeigt sich mit einer Open-Source-Software-Paket.

Introduction

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Bestimmung der genauen bakteriellen zählt in sehr verdünnten Proben ist in vielen Anwendungen von entscheidender Bedeutung: einige Beispiele sind Wasser und Nahrung Qualität Analyse1,2,3; Nachweis von Krankheitserregern in Blut, Liquor cerebrospinalis oder Sputum4,5; Herstellung von pharmazeutischen Produkten, einschließlich steriles Wasser6; und Umwelt-Community-Analyse in oligotrophen Umgebungen wie das offene Meer und Sedimente7,8

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Protocol

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1. Wachstum und Aufzählung der Bakterien

Hinweis: Dies gilt für fast jeder Bakterienstamm in die entsprechende mittlere 36 angebaut. In unserem Beispiel verwenden wir drei Sorten: Serratia Marcescens als eine gemeinsame, leicht identifizierbare Lab Belastung; und ein kleiner, sehr bewegliche Umweltbelastung, Shewanella Oneidensis MR-1. Um die Erkennung von vergleichen bewegliche vs. nicht-bewegliche Zellen, nicht bewegliche Shewanella Mutant, Δ FlgM, dient auch zum Vergleich 37. Alle Sorten werden angebaut, in Lysogeny Brühe (LB).

  1. Prepare sterile LB-Med....

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Results

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Die Ergebnisse sollten die Möglichkeit, lebende und tote Bakterien auf einem sehr niedrigen Niveau von DHM zu erkennen geben. Die Anzahl der Bakterien gezählt sollte mit der erzielten Ergebnisse mit Petroff-Hauser zählen Industrie- und Platte Grafen übereinstimmen. Statistische Standardmethoden bieten Informationen über die Genauigkeit der verschiedenen Nachweismethoden bei verschiedenen bakteriellen Konzentrationen.

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Discussion

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Numerische Rekonstruktion von Hologrammen: für die numerische Rekonstruktion von Hologrammen, die eckige Spektrum-Methode (ASM) verwendet. Dies beinhaltet die Faltung des Hologramms mit dem Grün-Funktion für die DHM. Die komplexe Wellenfront des Bildes an eine bestimmte Brennebene kann durch den Einsatz der Fourier-Convolution-Theorem wie folgt berechnet werden:

figure-discussion-1(1)

Wo

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Die Autoren erkennen die Gordon und Betty Moore Foundation Stipendien 4037 und 4038, California Institute of Technology für die Finanzierung dieser Arbeit.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bacto HefeBD Biosciences212750
Bacto TryptonBD Biosciences211705
NatriumchloridSigma-Aldrich7710Viele Optionen zum Kauf
Bacto AgarBD Biosciences214010
10 cm PetrischalenVWR10053-704
15 mL KulturröhrchenFalcon ( Corning Life Sciences)352002Petroff-Hauser-Kammer mit losem Deckel
Elektronenmikroskopie Sciences3920
10-mL-SpritzenBD Biosciences309604Luer-Lok-Spitze nicht erforderlich
Männlicher Luer auf 1/16" WiderhakenverschraubungMcMaster-Carr51525K291
Autoklavierbar 1/16" ID PVC-Schlauch für DurchflussNalgene8000-0004Verkauft nach Länge, entsprechend kaufen
SpritzenpumpeHarvard ApparatusPHD 2000
ProbenkammerCustomn/aSiehe Materialbereich
Holographisches MikroskopCustomn/aSiehe Wallace et al.
Open-Source-SoftwareBenutzerdefiniertehttps://github.com/bmorris3/shampoo

References

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  1. Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
  2. Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
  3. Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R.

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