Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Vor kurzem wurde CellCollector DC01, eine medizinische Leitung funktionalisiert mit Anti-EpCAM Antikörper zur Isolierung von CTCs aus dem peripheren Blut von Krebspatienten, das methodische Spektrum der CTC-Enumeration^{1,2,3 hinzugefügt} . In einer laufenden Studie mit nicht-metastatischem Prostatakrebs funktionalisierten Draht berichtet fast doppelt so viele Patienten CTC-positiv sein und höhere CTC zählt im CTC-positiven Patienten im Vergleich zu CellSearch, den Goldstandard in CTC-Enumeration³ . Aufgrund dieser erfreulichen Entwicklung Isolation von Zellen aus dem funktionalisierten medizinische Draht für einzellige Analyse wäre wünschenswert, aber weder enzymatische Behandlung mit Zelle Ablösung Lösungen (z.B. Trypsin) Laser Mikrodissektion ermöglicht die Wiederherstellung der intakten Zellen (Daten nicht gezeigt).

Um das Ablösen der erfassten Zellen zu ermöglichen, wurde eine neue Generation von funktionalisierten Drähte mit einem speziellen Polymer ausgestattet. Dieses Polymer, das die Capture-Antikörper auf den Draht verbindet, ist anfällig für eine Veröffentlichung Puffer Behandlung ermöglicht Ablösung der intakte Zellen (CellCollector DC03 bezeichnet als Gerät). Das neue funktionalisierten Gerät ermöglicht Isolation der Zielzellen aus verschiedenen Konzentrationen von Krebszellen Zelle Zeile versetzt in Rinderserumalbumin (BSA) / Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und peripheren Blut, beziehungsweise.

Um die visuelle Erkennung von Zellen auf dem Gerät und nach der Genesung zu erleichtern, sind die Krebszellen mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-) und eine DNA-Fleck vor der Wiederherstellung Behandlung beschriftet (i.e. Lade- und abnehmen). Die behandlungseffekte auf DNA-Qualität einzelner Zellen wurden zuvor nach WGA mittels einer Qualitätskontrolle PCR^4,5, Array-CGH^6,7 bewertet und gezielte Sequenzierung⁷ zeigen keinen Unterschied im Vergleich zu unbehandelten Zellen Micromanipulated Zelle Suspensionen⁷. Der Vorteil dieser Methode liegt in der Kombination von seltenen Zielzelle Voranreicherung und die Erholung der Zellen für einzellige nachgelagerte Analyse (Abbildung 1). Die aktuellen CE-Kennzeichnung in Vivo sammelvorrichtung dient in der Regel für die Enumeration von CTC nicht für einzellige molekulare Charakterisierung^2,8. Jedoch umfassendere Analyse zu untersuchen, Heterogenität unter CTCs lang für Analysen auf der Ebene der einzelnen Zelle (d. h. gezielte Sequenzierung der Ebene der einzelligen). Andere Zell-basierte Methoden basieren auf Immunomagnetic Isolierung von EpCAM-positiven CTCs und einzellige Handling basierend auf Dielektrophorese für nachfolgende molekulargenetisch analysiert^9,10. Molekulare Charakterisierung von CTCs ist eine wichtige Voraussetzung für ihre nützliche Umsetzung in einem klinischen Umfeld und ist ebenso wichtig für die Grundlagenforschung der metastatischen Kaskade. Parallel zur CTCs zirkulierenden Tumor-DNA (CtDNA) von großer Bedeutung geworden es DNA-Analyse der tumorlast mit minimalen technischen Isolierung Verfahren^11,12erlaubt. Die zellbasierte Ansätze als einen ergänzenden Beitrag dienen könnte, denn es ermöglicht eine RNA^13,14 und Eiweiß¹⁵ Expressionsanalyse und auch für CTC abgeleitet Zelle Kulturen oder Xenotransplantate^{16, 17}. Obwohl Hindernisse wie niedrige Zelle Erholung und Freiraum für die Anwendung bei Patienten noch überwunden werden müssen, die fangen und freilassen-Methode akzeptiert einen wichtigen nächsten Schritt zur Charakterisierung der seltenen Zielzellen.

Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der medizinischen Universität Graz (25-240 ex 12/13) genehmigt. Peripheren Blut für Spick Experimente wurde von gesunden Personen gesampelt.

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Isolation der HT-29 Zellen (menschliche Dickdarm Krebs Zell-Linie) von PBS oder von künstlichen Mischungen von HT-29 Zellen und peripherem Blut. Das gleiche Experiment wurde mit zwei zusätzlichen Zelllinien (LNCaP und VCaP, experimentellen Daten in Vertreter Ergebnissen) durchgeführt und kann theoretisch mit allen Zellen, die mit dem Ausdruck EpCAM durchgeführt werden.

1. Vorbereitung der Zielzellen

1. Zellkultur und Kennzeichnung von Zellen
   Hinweis: In diesem Protokoll sind Zellen in 75 cm ² Kulturflaschen kultiviert. Bitte die Mengen von Reagenzien entsprechend anpassen, wenn andere Zelle-Kultur-Geräte verwendet werden (z.B. 25 cm ² Kultur Geschirr, 6-Well Platten, usw.). Alle verwendete Flüssigkeiten sind auf 37 ° C in einem Wasserbad vorgewärmt. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Protokoll-Schritte bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt.
   1. Kultur HT-29 Zellen in McCoys 5a geändert Medium mit 20 mM Hepes, 2 mM L-Glutamin, 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 ° C in 5 % CO₂ Atmosphäre ergänzt.
   2. Wenn Zellen 90 % Zusammenfluss sind, entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit 10 mL 1 X PBS.
   3. Um Zellen zu ernten, die Zellen 2 mL der Zelle Ablösung Lösung (Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) hinzu und inkubieren die Zellen für ca. 5 min bei 37 ° c
      Hinweis: Die Ablösung Lösung enthält proteolytische und Collagenolytic Enzyme in 1 x PBS, 0,5 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) und 3 mg/L Phenol rot. Reduzieren Sie vor Erwärmung Zeit der Zelle Ablösung Lösung auf ein Minimum, da dies nach 1 h bei 37 ° c inaktiv sein wird Decken Sie die ganze Zellschicht um optimale Zelle Loslösung zu erhalten.
   4. Überprüfen Sie die Loslösung der Zellen mit einem inversen Mikroskop.
   5. Alle freistehende Zellen auf eine 50 mL-Tube vorausgefüllt mit 10 mL Zellkulturmedium (gleiche wie in Schritt 1.1.1.) übertragen und Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren.
   6. Legen Sie die restlichen Zellsuspension auf einem horizontalen Rolle Mixer bei RT und mit der Kennzeichnung Schritt fortfahren.
2. Zelle Kennzeichnung von Zielzellen zu leben
   1. 5 mM CFSE (im Lieferumfang enthalten in Dimethyl Sulfoxid, DMSO) in 1 mL 1 X PBS verdünnen 1 µL vorgewärmt bei 37 ° C, 5 µM Ready-to-Use CFSE-Kennzeichnung Lösung zu erhalten.
      Hinweis: Verwenden Sie für optimale Färbung Ergebnisse frisch zubereitete Lösungen.
   2. Bereiten Sie ein Ready-to-Use DNA Färbelösung (Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) mit 1 X PBS-Puffer und bei 2 bis 6 ° C, vor Licht geschützt aufbewahren.
      Hinweis: Verwenden Sie für optimale Färbung Ergebnisse frisch zubereitete Lösungen.
   3. Erhalten Sie die Zellen aus horizontalen Rolle Mischer (Schritt 1.1.6.) und Pellets, die die Zellen bei 300 X g für 10 min. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL 1 X PBS.
   4. Spülen Sie die Zellen wieder mit 1 X PBS und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 µL Ready-to-Use CFSE-Kennzeichnung Lösung.
   5. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 15 min und sammeln Sie die Zellen nach der Zentrifugation bei 300 X g 3 Minuten lang.
   6. Aufschwemmen Sie die markierten Zellen in 1 mL vorgewärmten Zellkulturmedium und lassen Sie die Zellen regenerieren bei 37 ° C für 30 min.
   7. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g 3 min und Aufschwemmen der Zelle Pellets in 1 mL Färbelösung bei 37 ° C für 10 min Ready-to-Use-DNA.
   8. Pellet-Zellen, Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen in 4 mL 1 X PBS. Beurteilen Sie die Zelldichte mit einem Hemocytometer und überprüfen Sie für Fluoreszenz Kennzeichnung mit einem Fluoreszenzmikroskop mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und Fluorescein erfolgt (FITC) Filter (Abbildung 2A und 2E) ausgestattet.
   9. Die Zellen bei 300 X g für 3 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellets nach den Zelldichten benötigt für das jeweilige Experiment wie im nächsten Abschnitt und Platz auf dem Eis.

2. Laden den Draht

Hinweis: Zellen können von Ziel Zelle/peripheren Blut Spikings an der Milliliter-Skala oder durch eine geringe Anzahl von Zellen in einem Mikroliter Maßstab isoliert werden. Während der ehemaligen Ansatz ermöglicht für die Nachahmung Zustand selten-Zellen im peripheren Blut, kann letztere die bevorzugte Methode für einige Zellen zum Zwecke der Optimierung/Protokolltests zu befestigen sein.

1. Laden den Draht mit einer großen Anzahl von Zellsuspensionen
   1. Bereiten Sie einen 2 % BSA Blockaden Lösung durch Auflösen von 0,8 g der BSA in 40 mL 1 X PBS (Zelle Kultur verwenden). BSA durch anfängliche aufschütteln und anschließenden Inkubation bei RT auf einem horizontalen Rolle Mixer für 10-20 min auflösen.
   2. Spülen leer EDTA Röhrchen/Natrium Heparin Röhrchen mit 2 mL 2 % BSA, Antikoagulans Rückstände entfernen und entsorgen Sie die Lösung. Blockieren Sie die Rohroberfläche durch Inkubation bei RT mit 5 mL von 2 % BSA auf einem horizontalen Rolle Mixer bei 15 u/min für 30 min und verwerfen Sie die Lösung zu.
   3. Verdünnen Sie markierte Zellen (Abschnitt 1.2) zu einer Dichte von 100 000 Zellen/mL und verwenden Sie 5 mL, um den Draht zu berechnen.
   4. Das Röhrchen 5 mL der markierten Zelle Suspension (500 000 Zellen insgesamt) hinzufügen. Vermeiden Sie Luftblasen, wenn die Zellsuspension hinzufügen.
   5. Entfernen Sie das Kabel aus dem Staufach sowie die Gummikappe hält den Draht und spülen Sie ihn mit 1 X PBS-Puffer (Abbildung 3).
   6. Dringen Sie die Gummikappe Rohr von EDTA-Röhrchen (Schritt 2.1.4.) mit Hilfe einer Spritze Nadel (20G) und stecken Sie das Kabel so, dass das Funktionsteil in der Zellsuspension vollständig eingetaucht ist, wenn die Kappe wieder auf das Rohr und das Rohr auf dem geneigten Walze Mischer befindet.
      Hinweis: Die Dreifach-spiralförmige Funktionsteil des Drahtes sollte mit Zellsuspension während der Aufladung abgedeckt werden.
   7. Drehen Sie die Rohre auf einem geneigten Walze Mixer 5 u/min für 30 min damit die Zellen an den Draht befestigen.
   8. Spülen Sie den Draht mit 5 mL 1 X PBS und speichern Sie es im Dunkeln bei 2 bis 6 ° C in einem 15 mL Röhrchen mit 1 X PBS bis Sichtprüfung.
      Hinweis: Das Funktionsteil des Drahtes muss immer mit PBS-Puffer zu vermeiden, schadet die Zellen getaucht werden.
2. Isolieren von Zielzellen aus künstlichen Mischungen mit peripherem Blut (Alternative Ladeverfahren zu: 2.1. Laden den Draht mit einer großen Anzahl von Zellsuspensionen)
   1. Verdünnen Sie markierte Zellen (Abschnitt 1.2) um Zellsuspensionen mit hoher Zelldichte zu erhalten (> 1 000 000 Zellen/mL), wodurch das Volumen der Zellsuspension hinzugefügt, um die peripheren Blut niedrig zu halten.
   2. 5 mL des peripheren Blutes fügen Sie 500 bis 500 000 Zellen hinzu und mischen sie durch das Rohr zu invertieren.
   3. Entfernen Sie das Kabel aus dem Staufach, entfernen Sie die Gummikappe hält den Draht zu und spülen Sie ihn mit 1 X PBS-Puffer.
   4. Dringen Sie eine neue Röhre Kappe mit dem nicht-funktionalen Teil des Gerätes mit Hilfe einer Spritzennadel (20G), so dass Funktionsteil im Spike Blut vollständig eingetaucht ist, wenn die Kappe wieder auf das Rohr und das Rohr auf dem geneigten Walze Mischer platziert wird.
      Hinweis: Die Dreifach-spiralförmige Funktionsteil des Drahtes sollte mit Zellsuspension während der Aufladung abgedeckt werden.
   5. Inkubieren Sie das Rohr auf den geneigten Walze Mixer 5 u/min für 30 min bei RT
   6. Spülen Sie den Draht 3 Mal in 1 X PBS und speichern Sie es im Dunkeln in einem 15 mL Röhrchen mit 1 X PBS bis Sichtprüfung.
      Hinweis: Das Funktionsteil des Drahtes darf immer getaucht werden, um zu vermeiden, die Zellen zu schädigen.
3. Laden den Draht von geringem Volumen Zellsuspensionen (Alternative Ladeverfahren zu: 2.1. Laden den Draht mit einer großen Anzahl von Zellsuspensionen)
   1. Die markierten Zellen bei 1 000 000 Zellen/mL in 1 X PBS aufzuwirbeln.
   2. Befestigen Sie ein 150 mm Einweg Glas Pasteurpipette horizontal auf einem Gestell.
   3. Entfernen Sie das Kabel aus dem Ablagefach, aber halten Sie die Gelbe Gummikappe hält den Draht.
   4. Legen Sie den Draht in die Pipette, derart, dass der funktionalisierten Teil befindet sich in der Spitze der Pasteurpipette das Glas nicht berühren.
      Hinweis: Die Spitze des Drahtes nicht aus der Pasteur PIPETTENSPITZE kleben sollte. Vermeiden Sie das hintere Ende des Pasteur-PIPETTENSPITZE mit der Gummikappe hält das Kabel einstecken. Wenn eng verbunden, können Zellsuspensionen von der anderen Seite in die PIPETTENSPITZE geladen werden.
   5. Laden Sie 15 µL Zellsuspension in der Spitze der Pasteurpipette für die funktionalisierten Teil des Drahtes.
   6. Inkubieren Sie dem Draht für 10 min. manuell Vierteldrehung der montierten Draht/Pasteur PIPETTENSPITZE jede Minute.
   7. Entfernen Sie das Kabel von der Pasteur PIPETTENSPITZE, spülen Sie es in 5 mL 1 X PBS und speichern Sie es im Dunkeln bei 2 bis 6 ° C in einem 15 mL Röhrchen mit 1 X PBS bis Sichtprüfung.
      Hinweis: Das Funktionsteil darf immer mit 1 X PBS-Puffer zu vermeiden, schadet die Zellen getaucht werden.

(3) zählen Zellen auf dem Draht

Hinweis: Halten Sie das Funktionsteil des Drahtes unter Wasser mit 1 X PBS-Puffer zu vermeiden, die Zellen zu schädigen.

1. Verwenden Sie einen Fett-Stift zeichnen einen Rechteckbereich auf einen Glasobjektträger und 500 µL 1 X PBS.
2. Biegen Sie den nicht-funktionalen Teil des Drahtes und legen Sie es auf den Objektträger, so dass das Funktionsteil in 1 X PBS eingetaucht ist.
   Hinweis: Passen Sie die Fläche des Rechtecks und Volumen von 1 X PBS Funktionsteil des Drahtes vollständig bedecken. Verwenden Sie eine doppelseitige Klebeband, um den nicht-funktionalen Teil des Drahtes auf der Folie zu montieren.
3. Überprüfen Sie beide Seiten des Drahtes, die erfassten Zellen (Abb. 2 b und 2F) aufzulisten.
   Hinweis: Das Vorhandensein von Zellen wird bestimmt mit einem Fluoreszenzmikroskop für DAPI und FITC mit Filtern ausgestattet. Beide Seiten des Drahtes können kontrolliert werden und die Anzahl der Zellen (für hohe Zellzahlen) bewertet oder gezählt (nur durchführbar, wenn niedrige Zahl von Zellen an den Draht befestigt sind). Dieser Schritt kann übersprungen werden, wenn die Aufzählung der Zellen nicht notwendig ist.
4. Nach dem Scannen, platzieren Sie das Kabel wieder in die 15 mL Röhrchen mit 1 X PBS (siehe Hinweis von 2.3.6. und Abschnitt 3.), speichern sie den Draht in Dunkelheit.
   Hinweis: Die meisten der nicht-funktionalen Teil des Drahtes können geschnitten (einschließlich der Kurve) und Lockerung Speicher entfernt.

4. Trennung und Verwertung von Zielzellen

Hinweis: Ablösung der Zellen innerhalb von 4 Stunden nach Isolierung erfolgt.

1. Lösen Sie der Freigabe Puffer Komponente (Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) 4 mg pro mL 1 X PBS auf und Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2 µm Sterilfilter, Ready-to-Use-Puffer zu erhalten.
   Hinweis: Das Polymer des Drahtes besteht aus einem Hydrogel die mit Anti-EpCAM Antikörper ermöglicht Bindung an Zielzellen EpCAM-präsentierenden funktionalisiert. Der Release-Puffer enthält eine proteolytische Enzym zur Spaltung der Hydrogel Kohlenstoff und Sauerstoff. Proteolytische Spaltung führt zu Abbau des Polymers und damit Ablösung der erfassten Zellen.
2. Vorwärmen des Freigabe-Puffers bei 37 ° C für 5 min.
3. Hinzugeben Sie 1,6 mL Version Puffer füllen eine 1,5 mL Reaktionsgefäß.
   Hinweis: Rohre ausgelegt für 1,5 mL Reaktion Volumen ermöglichen Anwendung von 1,6 mL, die für das Funktionsteil des Drahtes eintauchen.
4. Inkubieren Sie das Funktionsteil des Drahtes in der Release-Puffer bei 37 ° C (Wasserbad), 20 min. benutzen die Gummikappe ausgeliefert mit dem Draht statt Rohr Kappe um den Draht in der 1,5 mL Tube zur Vermeidung von Kontaminationen während der Inkubation im Wasserbad zu beheben.
5. Übertragen Sie Draht/Rohr-Montage auf einen Shaker für 15 min bei RT und 500 u/min.
   Hinweis: Der Shaker hat eine Umlaufbahn von 1,5 mm.
6. Legen Sie den Draht/Rohr-Montage in einer Zentrifuge und mit 300 X g für 10 min. drehen.
7. Entfernen Sie das Kabel aus der Tube, schließen Sie den Deckel und Zentrifugieren Sie das Rohr wieder auf 300 X g für 10 min.
   Hinweis: Der Draht kann in 1 X PBS bei 2 bis 6 ° C im Dunkeln zum Zelle zählen um Ablösung/Effizienzprüfung für Zellen, die noch auf den Draht zu beurteilen gespeichert werden.
8. Um das Volumen der Zellsuspension zu verringern, entfernen Sie alle bis auf 100 µL (Mikromanipulation) oder alternativ 300 µL des Überstands (Cytocentrifugation und anschließende Laser Mikrodissektion) und fahren Sie sofort mit einzelligen Probenahme.

(5) einzellige Probenahme

1. Mikromanipulation
   Hinweis: Einzelne Zellen werden 2 µL der Zelle Lysis master-Mix ermöglicht WGA hinzugefügt werden. Bereiten Sie master-Mix nach der Anzahl der Zellen, die verarbeitet werden, zusätzliche Mengen für Verlust durch pipettieren und Ort Zelle Lysis master-Mix auf dem Eis zu berechnen.
   1. Bereiten Sie die Zelle Lysis master-Mix (Komponenten der WGA-Kit, Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) gemäß dem Protokoll von Czyz Et al.¹⁸skizziert. Kurz, mischen 2.0 µL Reaktion Puffer, 1.3 µL des Octylphenoxypolyethoxyethanol (10 % ige Lösung), 1.3 µL 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) Phenyl-Polyethylenglykol (10 % ige Lösung), 2,6 µL einer Proteinase K-Lösung und 12,8 µL RNase/DNase-freie Wasser um zu erhalten eine Master-Mix für 10 Proben (Gesamtvolumen 20 µL).
      Hinweis: Für weitere Beispiele, erhöhen Sie die Mengen entsprechend. Die Zusammensetzung der Zelle Lysis master-Mix unterscheidet sich von der in das alternative Verfahren nutzt Laser Mikrodissektion Proben (siehe 5.2.).
   2. Verwenden Sie einen Fett-Stift zum Zeichnen einer Fläche die Zellsuspension in Position zu halten. Fläche und das Volumen einstellen, wenn die Zelldichte zu hoch ist (dh. Markieren Sie einen größeren Bereich auf der Glas-Folie, 1 x PBS und ein Aliquot der Zellsuspension zu laden).
   3. Pipette die gesamte gefärbten Zellsuspension (abgerufen im Schritt 4.8.) auf den Objektträger.
   4. Übertragen Sie den Objektträger an ein Mikroskop mit einem Mikromanipulator ausgestattet. Lassen Sie die Zellen, die für 5 min (Abb. 2D und 2 H) zu begleichen.
   5. Bereiten Sie 0,2 mL PCR-Röhrchen mit 2.0 µL Zelle Lysis Meisters geladen mischen (siehe Punkt 5.1.1.) und speichern Sie es auf dem Eis zu.
   6. Sammeln Sie einzelne Zellen in 1 µL 1 X PBS mit dem Mikromanipulator und übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen mit Zelle Lysis master-Mix.
      Hinweis: Für die Übertragung von Micromanipulated Zellen in der Zelle Lysis Puffer legen Sie die Kapillare direkt in die 2 µL Lyse-Lösung und werfen Sie bis Bläschen zu sehen.
   7. Kurz spin-down der Probe bei 2000 X g für 3 s mit einem Desktop-Microfuge, um alle Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Legen Sie die Proben auf Eis.
   8. Fahren Sie direkt mit einzelligen WGA (siehe Abschnitt 6. und Czyz Et Al. ( ¹⁹).
2. Laser-Mikrodissektion (alternative einzellige Sampling-Methode an: 5.1. Mikromanipulation)
   Hinweis: Die Zusammensetzung der in diesem Abschnitt verwendeten master-Mix unterscheidet sich von der in Abschnitt 5.1 für Mikromanipulation verwendet. Einzelne Zellen werden für WGA 4,5 µL Zelle Lysis master-Mix (Komponenten der WGA-Kit, Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) hinzugefügt.
   1. Bereiten Sie die Zelle-Lyse-master-Mix nach Czyz Et al. ¹⁹ durch das Mischen von 5,0 µL Reaktion Puffer, 1.3 µL des Octylphenoxypolyethoxyethanol (10 % ige Lösung), 1.3 µL 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) Phenyl-Polyethylenglykol (10 % ige Lösung), resp., 2.6 µL einer Proteinase K-Lösung und 34,8 µL RNase / DNase-freies Wasser, einen master-Mix für 10 Proben (Gesamtvolumen 45 µL) zu erhalten. Legen Sie die master-Mix auf dem Eis.
      Hinweis: Für weitere Beispiele, erhöhen Sie die Mengen entsprechend.
   2. UV-Behandlung Membran beschichtete Folien für Laser-Mikrodissektion geeignet. Daher legen Sie die Folien in eine DNA Kreuz Linker Gerät und setzen auf höchste UV für ca. 10 Minuten.
   3. Montieren Sie die Membran-beschichtete Folie in einer Cytocentrifuge und die gesamte Zellsuspension bei 300 X g für 5 min Cytospin.
      Hinweis: Bei Verwendung eine in Flüssigkeit-System, wo sind die Zellen Cytocentrifuged auf der Folie in Lösung Entfernen des Überstands nach Cytocentrifugation und einen trocken-Spin bei 1140 X g für 1 min.
   4. Fahren Sie direkt mit laser-Mikrodissektion oder lassen die Cytospins über Nacht an der Luft trocknen und Einfrieren der Proben bei-20 ° C für langfristige Lagerung.
   5. Pipette 4,5 µL Zelle Lysis-master-Mix in die Kappe einer 0,2 mL PCR-Röhre und einzelne Zellen mittels Laser Mikrodissektion zu ernten.
   6. Das PCR-Röhrchen aus dem Laser Mikrodissektion Mikroskop abrufen und das Röhrchen verschließen. Sammeln Sie alle Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres durch kurz-Spin und legen Sie die Probe auf dem Eis.
   7. Fahren Sie mit einzelligen WGA oder speichern Sie isolierten Proben bei-80 ° C bis zu 1 Monat vor der Weiterverarbeitung zu.

6. Adapter-Linker Sitz ganze Genom Verstärkung ^18,19

Hinweis: Stellen Sie sicher alle notwendigen master Mixe (Komponenten der WGA-Kit, Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) vorbereitet und gespeichert auf dem Eis einsatzbereit. Master Mix gehören den DNA Verdauung Mix 1 für Micromanipulated (siehe 5.1) Proben (mit 2,0 µL Reaktion Puffer, Mse2.0 µL ich Restriktionsenzym und 16,0 µL RNase/DNase-freies Wasser) oder DNA-Verdauung 2 für Laser-Mikrodissektion zu mischen (siehe 5.2.) Proben (mit 2,5 µL Mseich Restriktionsenzym und 2,5 µL RNase/DNase-freies Wasser), Pre-glühen master-Mix (mit 5,0 µL Reaktion Puffer, 5,0 µL der einzelnen preannealing PCR-Adapter und 15,0 µL RNase/DNase-freies Wasser), Unterbindung Master-Mix (mit 30,0 µL bereits geglühten PCR-Adapter, 10.0 µL Adenosintriphosphat Lösung und 10.0 µL T4-Ligase Lösung) und primärer PCR-Master-mix (mit 30,0 µL des PCR Puffer, 20,0 µL 10 mM Deoxynucleotide Mix Lösung, 10.0 µL einer Polymerase Mix und 340.0 µL RNase/DNase-freies Wasser). Alle Bände sind für die Zubereitung von 10 Proben gegeben. Passen Sie entsprechend der Anzahl der Stichproben.

1. Legen Sie für Zelle Lysis die Micromanipulated/Laser-Mikrodissektion-Proben in einem Thermocycler und einzellige Lyse von Zellen bei 42 ° C für 45 Minuten, 65 ° C für 30 min und 80 ° C für 10 min Inkubation geführt.
   Hinweis: Verwenden Sie ein Thermocycler mit einem beheizten Deckel. Lyse der Zelle kann für 10 bis 15 h O/N erfolgen. In diesem Fall lassen Sie inkubationsschritt bei 65 ° C Weg.
2. Führen Sie vor Glühen der PCR-Adapter. Daher vorab glühen master-Mix in einem Thermocycler bei 65 ° C für 1 min, gefolgt von weiteren 49 Zyklen, jeweils 1 min inkubieren mit schrittweise verringert die Temperatur um 1 ° C/Zyklus. Inkubieren Sie nach 50 Zyklen (bei 15 ° C) den master-Mix bei 15 ° C bis zur weiteren Verwendung.
   Hinweis: Dieser Schritt ist notwendig, um asymmetrische Adapter geeignet für Ligatur zu erzeugen (siehe Punkt 6.6.) mit einzelligen DNA ausgesetzt Mseich Beschränkungsauswahl.
3. Nach Lyse der Zelle, spin-down der lysierten Proben bei 2000 X g für 3 s zu sammeln alle Flüssigkeit unten und legen Sie ihn auf Eis.
4. Um DNA-fragment, jede lysierten Micromanipulated Probe 2 µL DNA-Verdauung-Mix 1 hinzufügen oder 0,5 µL DNA Verdauung mix 2 zum Beispiel Laser Mikrodissektion und Beschränkungsauswahl ausführen. Verwenden Sie ein Thermocycler mit einem beheizten Deckel bei 37 ° C für 5 min, gefolgt von einem Restriktionsenzym Inaktivierung Schritt bei 65 ° C für 5 Minuten.
   Hinweis: Verdauung bei 37 ° C, 3 h verlängert werden. Dies ist der einzige Protokoll zwischen Proben aus Mikromanipulation und Proben aus Laser-Mikrodissektion abweichend.
5. Spin-down die Proben zu sammeln alle Flüssigkeit unten und legen Sie ihn auf Eis.
6. Für Ligation Einschränkung verdaut DNA und bereits geglühten Adapter hinzufügen 5.0 µL der Ligatur Master mix zu jeder verdauten DNA-Probe und in einem Thermocycler bei 15 ° C für 1 h verbinden.
   Hinweis: Dieser Schritt kann auf 12 h verlängert werden oder durchgeführt O/N.
7. Spin-down die Proben zu sammeln alle Flüssigkeit unten und legen Sie ihn auf Eis.
8. 40,0 µL des primären PCR-master-Mix hinzufügen für WGA der Ligatur-Produkte und WGA in einem Thermocycler mit einem beheizten Deckel wie folgt: erste ausgeführt, die Proben bei 68 ° C für 3 min inkubieren. Zweitens-Zyklus für 15 Mal bei 94 ° C 40 s, 57 ° C für 30 s und 68 ° C für 1 min 30 s + 1 s/Zyklus. Fügen Sie dann 9 Zyklen bei 94 ° C 40 s, 57 ° C + 1 ° C/Zyklus für 30 s, 68 ° C für 1 min 45 s + 1 s/Zyklus. Danach radeln für 23mal bei 94 ° C 40 s, 65 ° C für 30 s, 68 ° C für 1 min 53 s + 1 s/Zyklus. Schließlich führen Sie eine letzte Verlängerung bei 68 ° C für 3 min 40 s und kühlen Sie die Proben auf 4 ° C.
9. Spin-down die Proben zu sammeln alle Flüssigkeit unten und überprüfen die DNA-Qualität oder speichern die Proben bei-20 ° C oder-80 ° C für die langfristige Lagerung.

(7) Qualitätskontrolle der WGA-Produkte

Hinweis: Überprüfen Sie die Qualität der WGA-Produkte basierend auf der DNA-Abstrich und die Anzahl der Amplifikationsprodukte nach dem Ausführen einer 4plex QC-PCR- ⁵. Führen Sie WGA Aliquote und jeweiligen QC-PCR Proben auf einem 1,0 % Agarose-Gel für die Bewertung.

1. Bereiten Sie 100 µM Stammlösungen alle Primer verwendet für 4plex Qualitätskontrolle PCR (Tabelle 1). 136.0 µL des PCR-Grade Wasser 200 µL Grundierung Pool generieren fügen Sie 8 µL jeder Grundierung hinzu. Wirbel die Lösung für 3 s, drehen Sie es bei 2000 X g für 3 s und aliquoten 20 µL zur Lagerung bei-20 ° C.
2. Verwendung standard PCR Kits zur Vorbereitung eines Multiplex-PCR-Meisters mischen mit 6,0 µL 2 X PCR Komponenten (außer Primer), 4,5 µL des PCR-Grade Wasser und 0,5 µL der Primer-Pool.
3. 1,0 µL der WGA Produkte hinzufügen, nach unten drehen und laufen PCR bei 94 ° C für 2 min gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung bei 94 ° C für 1 min, Grundierung Glühen bei 56 ° C für 1 min und Primer Extension bei 72 ° C für 1 min 30 s und eine letzte Verlängerung Schritt bei 72 ° C für 7 min. Chill es auf 4 ° C, drehen Sie es nach unten und die Proben auf Eis für Gelanalyse am selben Tag oder bei-20 ° C für eine spätere Analyse.
   Hinweis: In den Thermocycler kühlen kann bei 12 ° C Erhöhung der Langlebigkeit der Peltier-Elemente erfolgen.
4. Analysieren Sie WGA Erzeugnisse (von 6.8.) und entsprechenden 4plex QC-PCR-Produkte mit einer Agarose-Gel-⁵.

Zellen nach CFSE- und Nukleinsäuren Färbung können mit einem Immunfluoreszenz-Mikroskop ausgestattet mit Filter für DAPI und FITC ausgewertet werden. Kerne präsentieren mit einer hellen gegenfärbung im DAPI-Kanal während Zytoplasma der Zellen zeigen einheitliche Kennzeichnung mit CFSE mit heterogenen Inter Zelle Intensität (Abbildung 2A und 2E). Ähnliche Form und Färbung Intensitäten von Zellen mit dem Draht (Abb. 2 b und 2F) erwartet als auch losgelöst von den Draht und erholte sich auf einer Folie (Abb. 2D und 2 H).

Hohen Zelldichten (z. B. > 1 000 000 Zellen/mL) kann in vollständige Abdeckung des Drahtes mit Zellen führen, wenn die Drähte zu laden. Doch unteren Zelldichten, Veränderungen der Drehzahl während der Inkubation und den Einsatz von verschiedenen Zelllinien beeinflussen die Isolierwirkung und gesondert geprüft werden müssen. Wenn die Drähte wurden mit 5 mL von HT-29 Zellen auf 100 000 Einwohner Zellen inkubiert / mL als in Abschnitt 2.1 beschrieben., einen Mittelwert von 254 ± 103 Zellen (n = 5) auf den Drähten gefangen genommen wurden. Mit der gleichen Experimentieren mit LNCaP Zellen, einen Mittelwert von 440 ± 319 Zellen (n = 5) pro Draht gewonnen wurde.

Präsentieren 500, 5 000 und 50 000 HT-29 Zellen in einem Hintergrund von 5 mL des peripheren Blutes Drähte (laut Protokoll Abschnitt 2.2.) führte zu der Einnahme von 75 ± 18 Zellen, 25 ± 9 Zellen und 47 ± 57 Zellen (n = 3, jedes), beziehungsweise. Wenn der Draht mit 15 µL Zellsuspension (1 000 000 Zellen/mL) nach dem Protokoll in Abschnitt 2.3 aufgeladen ist., bis 1 000 (HT-29) Zellen zu einem Draht befestigen können.

Handy-Abteilung Wirkungsgrade zwischen 81 % in HT-29 Zellen (reichen 54,9 % 93,2 % und n = 5) auf 81 % (reichen 63.51 % 92,87 %, n = 6) und 91 % (reichen 84,7 95,3 %, n = 6) in LNCaP und VCaP Zellen, beziehungsweise. Ebenso unterscheidet sich die Erholung der freistehende Zellen zwischen Zell-Linien: ein Mittelwert von 28 % der freistehenden HT-29 Zellen wurden von Cytocentrifugation geborgen. Während die Wiederfindungsrate für LNCaP unter 10 % lag, war die mittlere Verwertungsquote für VCaP Zellen 55 %.

Etwa 75 % der Einzelzellen unterzogen WGA Ertrag WGA Qualitätsprodukte: Dies ist (1) Abstrich der WGA-Produkte von 0,1 bis > 1 kb (Abb. 4, oben) und (2) drei oder vier Bands in der 4plex Qualität kontrollieren PCR (Abbildung 4, Bodenplatte) . WGA-Produkte sind für 1) Array-CGH Profilierung erfüllt die Qualitätskriterien für einzellige Array-CGH profile 6,7 und 2) gezielte NGS nach erneuten Verstärkung WGA 7einsetzbar.

Abbildung 1: Workflow für die Isolierung und Wiederherstellung von Zielzellen für einzellige Analyse. (A) Zellen sind zu 90 % Konfluenz kultiviert und geerntet (B) um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Nach der Färbung mit CFSE- und Nukleinsäuren Fleck, (C) des funktionalisierten Drahts wird in Anwesenheit von Zellen in einem Volumen von 5 mL Reaktionsgefäße mit oder ein geringes Volumen mit einer Pasteur PIPETTENSPITZE inkubiert. Letzteres ermöglicht Anwendung der Zelle Aussetzung Bände so niedrig wie 15 µL., (D) Zellen müssen innerhalb von 4 Stunden nach der Aufladung loszubinden. Daher befindet sich der Draht in eine 1,5 mL Reaktionsgefäß mit Freigabe Puffer gefüllt. Nach 15 min Inkubation auf einer Wippe und 10 min zentrifugieren der Draht entfernt und die Zellsuspension wird zentrifugiert, um die Zellen zu Pellets. (E) Recovered Zellen sind entweder auf einen Glasobjektträger für einzellige Mikromanipulation (oben) oder Cytocentrifuged auf eine Membran-beschichtete Folie übertragen und weitergeleitet, um laser-Mikrodissektion (unten). (F) schließlich werden geerntete Einzelzellen durch ganze Genome Amplifikation (WGA) verstärkt. WGA-Produkte sind kompatibel mit Array-CGH und gezielte NGS nachgelagerte Analyse. EpCAM-Epitop: grüner Kreis auf der Zelloberfläche. Funktionalisiert Draht: Gerät, grauen Triple-spiralförmige Kabeln. Polymer: violette Linien. Anti-EpCAM-Antikörper: Orange. Lassen Sie Puffer Aktivität: roter Pfeil. Fett-Marker auf die Zellsuspension in Position zu halten: dunkel blaue Ellipse. Zellsuspension wiederhergestellt: hellblau. Kapillare für Mikromanipulation: schwarze Linie. Vergrößerung: wiederhergestellte Zelle durch Mikromanipulation geerntet, Cytospin auf Membran bedeckt schieben mit wiederhergestellten Zellen (grau gefüllte Ellipse). Vergrößerung: wiederhergestellte Zelle wird laser-Microdissected (graue Kreislinie: Membran Membran Folie dient als Rückgrat für Laser-Mikrodissektion), Objektive mit Laserstrahl (blaue Linie nähert sich die Membran Folie von unten). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Visualisierung von markierten Zellen. (A, E) Zellen vor dem Laden: Zellen sind gekennzeichnet mit CFSE und counterstained mit einer DNA verschuppen Farbstoff zeigt eine Reihe von CFSE-(grün)-Signalintensität. (B,F) Markierten Zellen auf den Draht festgehalten. (C,G) Draht nach Zelle-Ablösung Eingriff. (D,H) Zellen aus Draht getrennt und wiederhergestellt, indem Cytocentrifugation auf einer Folie. CFSE-: FITC Kanal (grün). DNA-Fleck: DAPI-Kanal (blau). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Draht und lagern. (A) Fächer des Drahtes. (B) Detail der funktionalisierten Teil. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Qualitätskontrolle WGA Produkte aus einzelnen Micromanipulated Zellen gewonnen. Oberseite: WGA-Erzeugnisse, die aus einzelnen Zellen in der Regel Ergebnis in DNA Abstriche von bis zu 0,2 kb > 1,0 kb mit einem Peak-Intensität bei rund 0,5 kb. Proben Nr. 1, 7 und 13 (mit Sternchen gekennzeichnet) suboptimale zeigen oder keine DNA schmiert. Bodenplatte: WGA Produkte sind von ausreichender Qualität, wenn die 4plex PCR drei oder vier von vier PCR Produkte ergibt (bei 100, 200, 300 und 400 bp). Proben 1, 7, 10 und 13 zeigen weniger als drei Bands und würde von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Lane M enthält eine 100 bp-Leiter und Sternchen geben die Proben nicht ausreichend WGA-Produktqualität. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: Primer-Sequenzen für 4plex Qualitätskontrolle PCR

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