Wir berichten über eine kleine Hairpin RNA (ShRNA) und die nächste Generation Sequencing-basiertes Protokoll zur Identifizierung von Regulatoren der X-Chromosom Inaktivierung in einem murinen Zelllinie mit Firefly Luciferase und Hygromycin-Resistenz-Gene verschmolzen, das Methyl CpG verbindliches Protein 2) MeCP2) gen auf dem x-Chromosom inaktiv.
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Methodenartikel
Gepoolte ShRNA Bildschirm für die Reaktivierung des MeCP2 auf dem inaktiven X-Chromosom
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Nach vorne genetische Bildschirme mit Reporter-Gene in das Heterochromatin eingefügt wurden ausgiebig zur epigenetischen Kontrollmechanismen in Modellorganismen untersuchen. Technologien einschließlich kurze Haarnadel RNAs (ShRNAs) und gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) haben solche Bildschirme in diploiden Säugetier-Zellen aktiviert. Hier beschreiben wir einen groß angelegte ShRNA-Bildschirm für Regulatoren der X-Chromosom Inaktivierung (XCI), mit einem murinen Zelllinie mit Firefly Luciferase und Hygromycin-Resistenz-Gene klopfte am C-Terminus von Methyl CpG verbindliches Protein 2 (MeCP2) gen auf dem inaktiven X-Chromosom (Xi). Reaktivierung des Konstrukts in der Reporter-Zellinie übertragenen Überlebensvorteil unter Hygromycin B Auswahl ermöglicht uns eine große ShRNA-Bibliothek und Haarnadeln, die die Reporter reaktiviert durch Messen, ihre Post-Auswahl Bereicherung zu identifizieren Sequenzierung der nächsten Generation. Die angereicherten Haarnadeln wurden dann einzeln testen ihre Fähigkeit zur Aktivierung der Luciferase Reporters auf Xi validiert.
Einleitung
Eine der häufigsten Formen der erblichen psychischen Beeinträchtigung bei Frauen, Rett-Syndrom, wird verursacht durch heterozygoten Mutationen im MeCP2, ein X-Chromosom-gen, das ein Protein wichtig für normale neuronale Funktion1kodiert. Eine mögliche Ansatz zur Behandlung dieser Erkrankung wäre Reaktivierung der Wildtyp MeCP2 Allel auf Xi, wie Wiederherstellung von MeCP2 Ausdruck zeigte umzukehrenden neurologische Defizite in einem Mausmodell der diese Krankheit1, 2 , 4. jedoch epigenetische silencing von einem der beiden X-....
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Protokoll
Alle Schritte, bei denen Tiere wurden durchgeführt mit Protokollen vom Fred Hutchinson Cancer Research Center institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt. Keine Reagenzien hier bekanntermaßen erhebliche menschliche Gesundheitsrisiken außer 5-Azacytidine (5-AZA) darstellen.
1. erzeugen eine Reporter-Zell-Linie mit MeCP2- LUC-HR Transgen auf der Xi
-
Vorbereitung der Maus Sehne Fibroblasten von einer Frau XMeCP2-LUC- HR/xMeCP2 Maus
- Einschläfern täglich 10-12-alt weiblich XMeCP2-LUC-HR/xMeCP2 Maus.
- Mit geraden Dissektion ....
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Ergebnisse
Maus Sehne Fibroblasten geerntet wurden aus einer zuvor beschriebenen XMeCP2-LUC-HR/xMeCP2 weibliche Maus, verewigt von retrovirale Transduktion von E6 und E7 Onkogene von HPV-16 virus7, geklont mit einschränkenden Verdünnung und getestet für Luciferase Aktivität und Expression von Wildtyp MeCP2 Protein (Abb. 1A und 1 b). Luciferase Aktivität war robust, wenn der Reporter auf Xa war und nicht nachweisbar wenn auf Xi; der native MeCP2 Ausdruck ausgestell.......
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Diskussion
In unserer letzten Studie6, erzielten wir eine murinen Zelllinie mit Luciferase und Hygromycin-Resistenz-Gene mit MeCP2 auf der Xi verschmolzen und mit einer Bibliothek von ausgestrahlt > 60.000 ShRNAs targeting > 25.000 Gene. Wir fanden 30 Gene deren Knock-down übertragenen Überlebensvorteil unter Hygromycin B-Auswahl, was ihre Rolle in der Steuerung von MeCP2 und X-Chromosom zum Schweigen zu bringen. Diese Ergebnisse wurden durch transducing die gemeldeten Zell-Linie mit einzel.......
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Offenlegungen
Dr. Leko trug zu diesem Artikel als Angestellter des Fred Hutchinson Cancer Research Center. Die geäußerten Ansichten sind seine eigenen und repräsentieren nicht notwendigerweise die Ansichten von den National Institutes of Health oder Regierung der Vereinigten Staaten
Danksagungen
Wir bedanken uns bei Ross Dickins von der University of Melbourne für die Bereitstellung von gnädig der ShRNA-Bibliothek auf dem Bildschirm verwendet. Diese Arbeit wurde durch die Rett Syndrome Research Trust (A.B) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 293FT Zelllinie | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidin | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2-Antikörper | Millipore | 07-013 | |
| Kollagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Festplatte aus weißem Polystyrol | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adaptierter retroviraler Vektor (pMSCV) | Offene Biosysteme | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retrovirale shRNAmir-Bibliothek | Offene Biosysteme | RMM3796 | |
| fötales Rinderserum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY– 401– 2501 | oder gleichwertiges |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogener Assay zum Screening von Kolonien |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Inhomogener Assay zum Testen einzelner Haarnadeln |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Oder ähnliches Luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Verwenden Sie ein mit Ihrem Gerät kompatibles Kit |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G Hüllkurvenvektor |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimin | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgen | #12260 | Verpackungsvektor |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot | Gibco | 25300-054 |
Referenzen
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett....
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Nachdrucke und Genehmigungen
