Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten

Mithun Mitra; Ha Neul Lee; Hilary A. Coller

doi:10.3791/56423

Method Article

Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten

DOI:

10.3791/56423

⸱

January 2nd, 2018

Mithun Mitra¹^,² , Ha Neul Lee¹^,²^,³ , Hilary A. Coller¹^,²^,³

¹Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, ²Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, ³Molecular Biology Institute Interdepartmental Program, University of California, Los Angeles

Summary

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Wir beschreiben ein Protokoll für die Generierung von wuchernden und ruhenden primären menschlichen dermalen Fibroblasten, Überwachung Transkript Verfall Preise und differentiell verfallenden Gene zu identifizieren.

Abstract

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Ruhe ist eine temporäre, reversibel in die Zellen Zellteilung aufgehört haben, aber weiterhin in der Lage zu vermehren. Mehrere Studien, einschließlich der unsrigen, haben gezeigt, dass Ruhe weitverbreitete Änderungen in der Genexpression zugeordnet ist. Einige dieser Veränderungen entstehen durch Veränderungen in der Ebene oder die Aktivität der Verbreitung-assoziierten Transkriptionsfaktoren, wie E2F und MYC. Wir haben bewiesen, dass mRNA Zerfall auch auf Veränderungen in der Genexpression zwischen proliferierende und ruhende Zellen beitragen kann. In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren für die wuchernde und ruhende Kulturen der menschliche Vorhaut dermalen Fibroblasten. Wir beschreiben die Verfahren zur Hemmung der neue Transkription in proliferierende und ruhende Zellen mit Actinomycin D (ActD). ActD-Behandlung stellt einen einfache und reproduzierbaren Ansatz zu Wehre neue Transkription von Transkript Verfall dar. Ein Nachteil des ActD-Behandlung ist, dass der zeitliche Verlauf auf einem kurzen Zeitrahmen beschränkt sein muss, da ActD Zellviabilität auswirkt. Transkript-Spiegel sind im Laufe der Zeit zur Abschrift Zerfall bestimmen überwacht. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifikation von Genen und Isoformen, die differenzielle Zerfall im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten aufweisen.

Introduction

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Steady-State widerspiegeln Protokolle den Beitrag der Abschrift Synthese und Transkript Verfall. Reguliert und koordiniert Transkript Zerfall ist ein wichtiger Mechanismus zur Steuerung von biologischen Prozessen¹^,²^,³^,⁴. Zum Beispiel wurden Transkript Verfall Preise gezeigt beizutragen, die zeitliche Abfolge der Ereignisse, die nach Aktivierung durch inflammatorische Zytokin Tumor-Nekrose-Faktor⁵.

Wir haben bisher gezeigt, dass der Übergang zwischen Verbreitung und Ruhe im primären menschli....

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Protocol

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Alle beschriebenen Experimente stimmten institutionelle Review Boards an der Princeton University und der University of California, Los Angeles.

1. bereiten Sie wuchernde und Kontakt gehemmt Fibroblasten für ActD zeitlicher Verlauf

Hinweis: Dieses Protokoll verwendet eine Timecourse mit vier Zeitpunkte. Drei biologisch unabhängige Stichproben können pro Timepoint gesammelt werden, durch das Sammeln von verschiedenen Gewebekultur Platten in einem Experiment, oder das Experiment kann mehrere Male mit unterschiedlichen Kulturen der Zellen wiederholt werden. Nach unserer Erfahrung bietet eine 10 cm (Durchmesser) Gewebe....

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Results

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Zuvor haben wir die Ergebnisse der Microarray Analysen der Abschrift Zerfall Sätze in wuchernden und Kontakt gehemmt primären menschlichen Fibroblasten über einen 8-Stunden-Kurs¹²berichtet. Eine Liste von Genen mit eine signifikante Veränderung im Transkript Stabilität Vergleich wuchernde und Kontakt gehemmt Fibroblasten dient in ergänzenden Tabelle1. Die Fluoreszenz-Intensitäten zum Zeitpunkt Null und über einen zeitlichen Verlauf nach ActD Behand.......

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Discussion

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Stille kann durch externe Signale einschließlich Rücknahme Mitogene oder Serum, mangelnde Zelladhäsion und Kontakt Hemmung induziert werden. Kontakt-Hemmung, einer von mehreren möglichen Methoden zur Induktion der Ruhe, ist ein höchst evolutionär konservierte Prozess in dem Zellen der proliferativen Zellzyklus in Reaktion auf Zell-Zell-Kontakt beenden. Wir konzentrieren uns hier auf Kontakt Hemmung als Beispiel für eine Methode, um Ruhe zu induzieren. Frühere Studien haben berichtet, dass Zell-Zell-Kontakt MicroRNA Bioge.......

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Disclosures

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Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Acknowledgements

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HAC war der Milton E. Cassel Gelehrte von der Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse zu HAC vom National Institute of General Medical Sciences Center Excellence Grant P50 GM071508 (p.i. David Botstein), PhRMA Foundation Grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879, David August, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Nationales Institut der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM0866465, die Eli & Edythe breit Zentrum für Regenerative Medizin & Forschung an Stammzellen, die Iris Cantor Frauen Gesundheitszentrum/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, ....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Zentrifugen für Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Kapazität von 12.000 x g und 4°; C
Ausrüstung zum Verarbeiten von Agarose-Gelen
Sterile Gewebekulturplatten und konische Röhrchen
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11965-118
Fötales Rinderserum	VWR	35-010-CV
Sterile serologische Pipetten, Pipettieren und Pipettenspitzen für die Gewebekultur
Einzeln verpackte, Rnasefreie Einwegpipetten, Pipettenspitzen und Röhrchen für die RNA-Isolierung und -Analyse
Einweghandschuhe zum Tragen beim Umgang mit Reagenzien und RNA-Proben
RNaseZap	Invitrogen	AM9780	Zur Dekontamination von Arbeitsoberflächen aus RNase
2,0 ml Eppendorf-Röhrchen
Trypsin-EDTA Lösung 10X	Millipore Sigma	9002-07-07
Steriles PBS	Life Technologies	14190-250
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596018
Actinomycin D	Millipore Sigma	A1410-2 mg	hemmt die Transkription
Steriles DMSO	Fisher Scientific	31-761-00ML	Lösungsmittel für Actinomycin D
Chloroform	Thermo Fisher	Scientific ICN19400225	MP Biomedicals, Inc Produkt
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618500	molekularbiologisches
Ethanol	Fisher Scientific	BP28184	molekularbiologisches
RNasefreies Glykogen (20 mg/ml wässrige Lösung)	Thermo Fisher Scientific	R0551	Träger für die RNA-Fällung
TURBO DNA-free Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1907	entfernt DNA mit DNase und inaktiviert dann in einem nachfolgenden Schritt inaktiviert DNA und entfernt zweiwertige Kationen
Agarose	Thermo Fisher Scientific	ICN820721	MP Biomedicals, Inc Produkt
Ladefarbstoff für RNA-Gel	Thermo Fisher Scientific	R0641	auch für denaturierende Elektrophorese
geeignet Millenium RNA-Marker	Thermo Fisher Scientific	AM7150	RNA-Leiter
Einfarbige RNA-Spike-in-Kit	Agilent Technology	5188-5282	Beispiel für eine Spike-in-Kontrolle für die Agient-Microarray-Analyse
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152-1	Molekularbiologie-Qualität, für TAE-Puffer
Eisessig	Fisher Scientific	A38-500	für TAE-Puffer
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500	Elektrophorese-Qualität, für Gele
Ethidiumbromid	Millipore Sigma	E7637	für die Molekularbiologie
External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix	Thermo Fisher Scientific	4456740	Spike-in-Kontrolle für RNA Seq
TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 Proben, 12 Indexe)	Illumina	RS-122-2101	für RNA Seq
96-Well-PCR-Platte mit 0,3 ml	Thermo Fisher Scientific	AB-0600	für real-time qPCR
Microseal B Klebedichtungen	Bio-Rad	MSB1001	für real-time qPCR
Rnase/Dnase-freie Reagenzreservoire	VWR	89094-662	für real-time qPCR
Rnase/Dnase-frei Acht Röhrchenstreifen und -kappen	Thermo Fisher	Scientific AM12230	für real-time qPCR
SuperScript Reverse Transkriptase	Invitrogen	18090010	für die real-time qPCR
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	für real-time qPCR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R.

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