Summary
Beschrijven we een methode om te kwantificeren van de samenvoeging van misfolded eiwitten. Onze gegevens-protocol lentivirale geïnduceerde stabiele cel lijn generatie, geautomatiseerde confocal beeldvorming en beeldanalyse van eiwit-aggregaten. Als een illustratieve toepassing onderzocht we het effect van kleine molecules biij SOD1 aggregatie op een tijd - en dosis-afhankelijke manier.
Abstract
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is een fatale neurodegeneratieve ziekte die kan worden veroorzaakt door erfelijke mutaties in het gen coderen koper-zink superoxide dismutase 1 (SOD1). De structurele instabiliteit van SOD1 en de opsporing van SOD1-positieve inclusies in familiale-ALS patiënten ondersteunt een mogelijke oorzakelijke rol weggelegd voor misfolded en/of geaggregeerde SOD1 ALS pathologie. In deze studie beschrijven we de ontwikkeling van een cel-gebaseerde test ontworpen te kwantificeren van de dynamiek van SOD1 aggregatie in levende cellen door hoog gehalte screening benaderingen. Met behulp van lentivirale vectoren, wij stabiele cellijnen uiting van wild-type en mutant A4V SOD1 gelabeld met gele fluorescerende eiwit en vond dat beide eiwitten werden uitgedrukt in het cytosol zonder enig teken van aggregatie gegenereerd. Interessant, alleen SOD1 A4V stabiel uitgedrukt in HEK-293, maar niet in U2OS of SH-SY5Y cellijnen, gevormd aggregaten op proteasoom remmer behandeling. We laten zien dat het mogelijk is te kwantificeren van de samenvoeging op basis van de dosis / respons-analyse van diverse proteasoom-remmers, en voor het bijhouden van aggregaat-vorming kinetiek door time-lapse microscopie. Onze benadering introduceert de mogelijkheid van kwantificering van het effect van de mutaties ALS over de rol van SOD1 in statistische vorming, alsmede het screenen voor kleine moleculen waardoor SOD1 A4V aggregatie.
Introduction
Aggregatie van eiwitten is een biologisch proces waarbij eiwitten groep misfolded omhoog en kan fungeren als oorzakelijke agens in neurodegeneratieve ziekten (amyloidose). Karakterisering van de aggregatie van eiwitten is essentieel in het begrip van de rol van aggregaten in cellulaire disfunctie zo goed zoals het vergemakkelijken van de ontdekking van nieuwe factoren die invloed hebben op het ontstaan van de pathologie. De visualisatie van fluorescentie-gelabelde proteïnen in levende cellen is een krachtige methode die kan helpen bij de ontwikkeling van tests op hoog gehalte screening (HCS)1,,2,,3,4van toepassing.
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) wordt beschouwd als een ziekte van de proteopathic veroorzaakt door de aanwezigheid van misfolded eiwitten met de neiging om statistische en zich ophopen in de motorische neuronen in familiale ALS (fALS) zowel de sporadische ALS (sALS)5,6 . Een subset van ~ 20% van de gevallen van de fALS worden geassocieerd met dominante mutaties in het gen codering het cytosolische anti-oxidant enzym koper-zink superoxide dismutase type 1 (SOD1)7,8. Verschillende mogelijke oorzaken voor dit genetisch afgeleide dysfunctie zijn voorgesteld, met inbegrip van wijzigingen in de structuur en functie van SOD1 varianten, zoals de afwijkende stabiliteit, toegenomen ontvouwen tarief en neiging tot statistische9, 10. Met name de enige gecontroleerde en potentieel toxische eigenschap gedeeld door beide ALS alternerende SOD1-varianten en wild-type (WT) SOD1 is een verhoogde neiging tot het vormen van de verzuilde eiwit-aggregaten of eiwithoudende insluitsels11,12 . Misfolded mutant SOD1, is aanhoudend polyubiquitinated en afgebroken door het ubiquitin-proteasoom-systeem. Dientengevolge, leidt een laag niveau van remming van het proteasoom activiteit tot de opeenstapeling van mutant die sod113,14 aggregaten, welke vorm amorf structuren bestaat uit oplosbare onderdelen die kunnen worden uitgewisseld met oplosbare mutant SOD1 in het cytosol15. In bepaalde, SOD1 mutant A4V (alanine op codon 4 gewijzigd in valine) is de meest voorkomende ALS-veroorzakende mutatie, en leidt tot snelle neurodegeneratie met een gemiddelde overlevingstijd van minder dan 2 jaar na ziekte begin16. Biochemically, heeft SOD1-A4V een verhoogde neiging tot monomerize, statistische en vormen van amyloïde pores; de porie-achtige aggregaten zijn vergelijkbaar met amyloïde poriën van andere ziekte-linked mutant vormen, zoals synuclein-α en β-amyloid proteïne17. Studeren de dynamiek van SOD1-aggregaat accumulatie, blijven de methoden voor de controle van oplosbare en onoplosbare SOD1 statistische formulieren worden ontwikkeld.
Wij hebben eerder getoond, met behulp van live-cel imaging en HEK-293 cellen transfected Transient met TL proteïne-gelabeld SOD1, dat ALS-geassocieerde mutaties SOD1 dimerisatie en aggregatie11schaden. Hoewel Transiënte expressiesystemen nuttige informatie over de biologische uitkomst van kortlopende overexpressie van het gen bieden kunnen, is er wellicht methoden leveren stabiele integratie van gewenste genen voor test ontwikkeling de voorkeur. Als zodanig, bieden lentivirale vectoren de mogelijkheid om op lange termijn en gereglementeerde genexpressie op zoogdiercellen 18verlenen. In deze studie, richtten we ons op de generatie van stabiele cellijnen getransduceerde met recombinant lentivirus, rekening houdend met WT en mutant SOD1 gemarkeerd met gele fluorescerende eiwit (YFP). Met behulp van live-cel imaging microscopie en geautomatiseerde kwantificering van SOD1 aggregatie, wij geactiveerd en gekwantificeerd SOD1 aggregatie gebeurtenissen op remming van het proteasoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. lentivirus productie
Opmerking: de productie en manipulatie van lentivirale vectoren werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH) voor onderzoek waarbij recombinant DNA. Kim et al. de plasmide codering het wild-type en A4V mutant SOD1 gelabeld met verbeterde YFP (SOD1WT-YFP en SOD1A4V-YFP) worden beschreven. 11 beide gene fusion producten werden versterkt met behulp van de PCR primer paar 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ en 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ en de pTRIP-delta U3 CMV ingevoegd plasmide 19 met behulp van XhoI en BsrGI beperkingsplaatsen. In eerdere experimenten speelden de HEK-293T-cellen bij een verhouding van 1:4 tot en met 1:6 om de twee dagen. Vermijden van meer dan 20 passages en onderhoud van de cellen bij minder 60% confluency helpt om goede transfectie efficiencyverbeteringen.
- Op dag 1, HEK-293T cellen bij 30-40% samenvloeiing in een 10-cm doorsnede weefselkweek plaat (3 x 10 6 cellen/schotel) splitsen in cel kweekmedium (hoge-glucose DMEM met 10% FBS en 4 mM L-glutamine) voor virus productie 10 mL.
- Houden de 10-cm doorsnede weefselkweek plaat in een CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2) 's nachts.
- Op dag 2, bereid een DNA transfectie oplossing met 10 µg van lentivirale vectoren (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP of -SOD1A4V-YFP) samen met de lentivirale verpakking plasmiden (5 µg pVSVg; pCMV-dR8.71 10 µg) () figuur 2A) 20. Voeg 125 µL van 1 M CaCl 2 en pas het volume aan 500 µL met gedestilleerd water. Zachtjes Voeg 500 µL van 0,05 M HEPES in het mengsel en laat 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
- Vervangen HEK-293T cellen medium met 10 mL voorverwarmde verse kweekmedium antibioticum-gratis gemengd met 1 mL DNA transfectie en na een nacht bebroeden bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Op dag 3, vervangen door de cel supernatant verse kweekmedium.
- Op dag 4, oogsten de bovendrijvende substantie in een tube van 15 mL en Centrifugeer gedurende 5 min op 500 x g om de dode cellen en puin te verwijderen. Verder het supernatant te zuiveren door het passeren van een 0,45 µm filter door middel van een grote 60 mL spuit. Onmiddellijk afzien in eenmalig gebruik aliquots (300 µL), en opslaan bij-80 ° C. Maximale product om activiteiten te handhaven, te voorkomen dat een freeze-dooi cyclus.
2. Lentivirale transductie
- splitsen de cellijn besmet bij 60% samenvloeiing (HEK-293 cellen en SH-SY5Y; 5 x 10 5 cellen per putje en U2OS; 1 x 10 5 cellen per putje) in een bord 6-well weefselkweek in 2 mL zuiver DMEM media, aangevuld met 10% FBS.
- Houden de plaat 6-well weefselkweek in een incubator 37 ° C bij 5% CO 2 overnachting.
- Verwijderen van de bevroren lentivirus uit de diepvries-80 ° C en een aliquoot gedeelte op ijs vóór elk gebruik ontdooien; niet doen refreeze.
- Terwijl het virus is ontdooien, warm de cel-kweekmedium dat van het serum compatibel met de cellijn van belang. Zodra het virus is volledig ontdooid, bereiden een aantal verdunningen (1:3, 1:10, 1:30, en 1:100) in DMEM in een verse 1,5 mL microfuge buis.
- Het volume in de buizen tot 1 mL met verminderde serum media opvoeden.
- Toevoegen 2 µL van Polybrene (bij een voorraad van 4 µg/µL) tot 1 mL van virus/media. Meng goed door pipetteren en voeg 1 mL van het mengsel aan de cellen. Incubeer de cellen met het virus voor 24 h.
- De media van het virus te verwijderen en te vervangen met normale DMEM media aangevuld met 10% FBS. Handhaven van de cellen bij 37 ° C, 5% CO 2.
- De groei van de cellen controleren en wijzigen van de voedingsbodems om de twee dagen. Bij samenvloeiing, door de schotel 6-well uit te breiden in een 10-cm doorsnede weefselkweek plaat.
- Zodra de cellen voldoende zijn uitgebreid, gelabeld zaad 1.5 x 10 4 cellen per putje in 50 µL van DMEM media op 384-well assay platen te controleren van het niveau van de expressie van de YFP proteïne door microscopie. Als de YFP gelabeld cel eiwituitdrukking toont een signal-to-noise verhouding ≥ 3, cel voorraad voorbereiden op de overeenkomstige cellijn.
3. Tijd afhankelijk effect van proteasoom-remmers op eiwit aggregatie
Opmerking: uitvoeren met behulp van een geautomatiseerde Microscoop Beeldacquisitie (Zie materiaal).
- Afzien van 0,25 µL van DMSO of proteasoom-remmer opgelost in 100% DMSO (ALLN, 2 mM) op 384-well platte bodem platen.
- Handmatig zaad 1.5 x 10 4 cellen per putje in 50 µL van DMEM media op dezelfde assay plaat. De eindconcentratie van de Inhibitor van de omwenteling (ALLN) proteasoom moet 10 µM.
- Instellen in de systeemeenheid omgevingsbeheersing Microscoop op 37 ° C en 5% CO 2. Een screenshot van de experimentele opstelling wordt getoond in Figuur 3.
- Werken de Microscoop in breed veld fluorescentie modus, met behulp van de software met de volgende instellingen: LWD 20 X doelstelling, niet-confocale modus, 4 velden per putje, met een opname-interval van een uur. Aan het einde van elke run, opnames worden automatisch geüpload naar de server.
4. Tijd lapse imaging voor YFP expressie in levende cellen, en beeld analyse (enkellijns)
Opmerking: de volgende stappen beschrijven toepassing van de software (b.v., Columbus).
- Selecteer de juiste algoritme segmenten van de primaire objecten (cytosol en aggregaten). Indien nodig, aanpassen achtergrond drempel en contrast parameters ( Figuur 4).
- Cellen tellen met behulp van ' cellen zoeken ' met een individuele drempel van 0,1 voor het YFP intensiteit kanaal. Bepalen van aggregaten met behulp van een ' vinden plekken ' algoritme met een relatieve YFP plek intensiteit > 0,2 en een splitsing coëfficiënt voor 1.0.
5. Effect van het antwoord van proteasoom-remmers op eiwit aggregatie op levende cellen gekleurd voor hun kernen (twee kanalen) dosis
Opmerking: uitvoeren met behulp van een geautomatiseerde Microscoop Beeldacquisitie. Het concentratiebereik van proteasoom-remmers (ALLN, Epoxomicin en MG132) op basis van de verwachte IC 50 waarde om een optimale kromme pasvorm bepalen.
- Voorbereiden seriële verdunningen van verbindingen op een 384-well opslag polypropyleen plaat standaard verdunningsreeks van 1:3. Zorg ervoor dat u de samengestelde verdunningen meng goed om ervoor te zorgen dat de samengestelde concentraties kloppen.
- Doseer 0,25 µL van proteasoom-remmers op lege flat-onderste zwarte 384-well assay platen. We gebruiken een vloeibare handler uitgerust met een 384-capillair hoofd staat van de overdracht van de volumes.
- Zaad 1.5 x 10 4 cellen per putje 50 µL van DMEM Media op assay platen. Incubeer de platen assay bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 24 h.
- Voeg 10 µL van DMEM Media (vooraf opgewarmd bij 37 ° C) met een kleurstofoplossing (Hoechst 33342 bij een voorraad van 10 mg/mL) en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten
- Lanceren de microshoofd besturingssoftware. Een screenshot van de experimentele opstelling wordt getoond in Figuur 6. Selecteer de " configuratie " tab en selecteer 20 X de doelstelling en de juiste plaat type. Zorgen " kraag " is ingesteld op de juiste waarde op de juiste focus waardoor met verschillende plaat typen objectieve.
- Selecteer de " Microscoop " tab. definiëren blootstelling 1 als YFP (488 laser) en blootstelling 2 als Hoechst (405 laser). Activeren van het filter op beide posities en blootstelling 1 toewijzen aan camera 1 en Gasbedwelming met 2 camera 2. Belichtingstijden ingesteld op ~ 800 ms voor blootstelling 1 en ~ 40 ms voor blootstelling 2.
- Selecteer blootstelling 1. Focus hoogte ingesteld op 0 µm. Selecteer " Focus ". Zodra gericht, bloot camera 1. Aanpassen van de hoogte van de focus optimaliseren van het vliegtuig van de blootstelling en klik op " hoogte ". Wijzigen van de belichtingstijden en macht te geven een maximale pixel intensiteit van ~ 3.000 laser. Sla blootstelling parameters. Herhaal dit voor blootstelling 2.
- Selecteer " Experiment definitie " tab. Maak een lay-out en sublayout. Slepen en neerzetten van de relevante lay-out, belichting, referentiebeeld, skewcrop bestand en sublayout. Opslaan van het experiment.
- Selecteer " automatische Experiment " tab en beelden te verwerven. Aan het einde van elke run, opnames worden automatisch geüpload naar de server.
6. Afbeelding van de analyse van de twee afbeeldingen van het kanaal
- selecteert het algoritme van de software om te segmenteren van de primaire objecten (kernen cytosol en aggregaten) ( Figuur 7).
- Selecteer de methode die segmenten van de kernen nauwkeurig door visuele inspectie van de gesegmenteerde objecten. Hoechst gebeitste objecten in kanaal 1 (Ch1) zal worden gebruikt om te bepalen van het aantal cellen. De YFP kleuring van de mutant SOD1-A4V in kanaal 2 (Ch2) worden gebruikt voor het bepalen van de hoeveelheid aggregaten.
- Cellen tellen met behulp van de ' kernen vinden ' algoritme als Hoechst-kleuring regio's > 20 µm 2, met een split-factor van 7.0, een individuele drempel van 0,40 en een contrast > 0.10.
- Maken de gegevenstabel en EG 50 bepalen voor elk van de verbindingen met behulp van de ' Non-lineaire regressie ' vergelijking in de grafische software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stabiele cellijn genereren met behulp van lentivirus: De algemene strategie voor SOD1-eiwit-aggregaten toezicht wordt geïllustreerd in Figuur 1. In een eerste stap, we genereerden een vector lentivirale expressie voor SOD1 stabiele gene levering in cellijnen (stap 1). Twee lentivirale vectoren codering SOD1-WT YFP-gelabeld en SOD1-A4V (SOD1WT-YFP en SOD1A4V-YFP, respectievelijk) met de verpakking en envelop plasmiden werden voorbereid (figuur 2A). Op lentivirale transductie (stap 2) de cel bleef lijnen getest (HEK-293, U2OS en SH-SY5Y) gezond, bleek hoge expressie niveaus (figuur 2B), en op lange termijn YFP labeling ongeacht de SOD1-vorm. Interessant, WT noch mutant SOD1 uitgedrukt in de drie cellijnen die zichtbaar aggregatie, in tegenstelling tot de transiënte expressie cellulaire model toonde eerder getest11.
Validating stabiele cel lijnen voor SOD1 aggregatie en het bestuderen van een dynamiek: Als u wilt activeren SOD1 statistische vorming op cellulaire accumulatie van misfolded SOD1 mutant, gebruikten we proteasoom remmer ALLN (ook wel genoemd calpain I en II remmer; Ki = 190 en 220 nM respectievelijk), eerder gevalideerd met behulp van een voorbijgaande SOD1 expressie cellulaire model11. SOD1 aggregatie werd onderzocht met HEK-293, U2OS en SH-SY5Y cellijnen getransduceerde met SOD1WT-YFP en SOD1A4V-YFP. Behandeling met proteasoom-remmer ALLN (10 µM) voor 24 uur sterk bevorderd de accumulatie van SOD1A4V-YFP aggregaten in HEK-293 cellen (figuur 2C). Echter werd geen samenvoeging gevonden in SOD1WT-YFP getransduceerde cellijnen en zeer lage niveaus van aggregatie werd gevonden in U2OS en cellijnen SH-SY5Y SOD1A4V-YFP getransduceerde SOD1WT-YFP en SOD1A4V-YFP (figuur 2C). Op basis van deze opmerkingen, we gebruikten time-lapse microscopie te onderzoeken van de dynamiek van SOD1A4V-YFP aggregatie vorming geïnduceerd door proteasoom remming (stap 3, Figuur 3) en te kwantificeren van SOD1A4V-YFP-aggregatie met behulp van een enkele YFP-fluorescentie kanaal voor het opsporen van de waarin cellen en aggregaten in levende cellen (stap 4, Figuur 4). Cellen werden zaadjes in de aanwezigheid en de afwezigheid van ALLN en gecontroleerd voor een periode van 50 uur (figuur 5A). Onder onze proefomstandigheden vonden wij de totale vorming geïnduceerd door ALLN bereikt een plateau na 24 uur en bleef stabiel in de komende 12 uur. We laten zien dat de celdichtheid aanzienlijk na 28 uur als gevolg van de cytotoxische effect van ALLN, daalde terwijl celaantal steeg in het negatieve experiment met DMSO-behandeld.
Characterizing klein molecuul EG 50 voor aggregatie vorming met behulp van SOD1 cel model: Cellen uiten van SOD1A4V-YFP werden getrakteerd op een dosis-afhankelijke manier met klein molecuul proteasoom-remmers. We gebruikten een nucleaire marker om het label de cellijn van SOD1A4V-YFP, dat gunstig voor statistische opsporing binnen het cytosol compartiment is. Inderdaad, omdat elke cel een kern, bevat door segmenteren de kernen en ze te gebruiken als de zaden in de segmentering van de waterscheiding van de cellen, segmentatie van het cytoplasma is vereenvoudigde21. Wij gebruikte Hoechst kleuring, die bekend is om geen toxiciteit wanneer gebruikt voor een korte termijn en bij lage concentraties22, voorwaarden die werden niet gebruikt in de eerdere time-lapse imaging experiment. Na 24 uur cel kweken in aanwezigheid van het proteasoom-remmers, werden SOD1A4V-YFP cellen gekleurd met Hoechst oplossing (10 µg/mL) gedurende 10 minuten. Volgende verworven we fluorescentie beelden voor Hoechst en YFP met een 20 X 0.4 nb doelstelling (stap 5, Figuur 6). Met behulp van een afbeelding analyse algoritme dat rekening wordt gehouden met de celkernen en de distributie van de SOD1A4V-YFP, werden cellen geanalyseerd met behulp van de analysesoftware afbeelding (stap 6, Figuur 7). Hoechst gebeitste objecten exposeren de juiste TL intensiteit boven de achtergrond en de grootte van de morfologische kenmerken van een kernen (breedte, lengte en gebied) werden geïdentificeerd en ingedeeld door beeldsegmentatie. De nucleaire masker afgeleid van Hoechst kleuring werd gebruikt voor het bijhouden van de proximale SOD1A4V-YFP plek verdeling binnen de cel cytosolische gebied en om te bepalen van de aanwezigheid of afwezigheid van aggregaten. Gebaseerd op de detectie van kernen en vlekken, werd een verhouding van aggregaten gedetecteerd versus cellen berekend. Om te bepalen van de gevoeligheid van onze test, wij volgende gekwantificeerd samenvoeging van SOD1A4V-YFP-HEK-293 cellen behandeld met drie verschillende proteasoom-remmers (ALLN, MG132 en epoxomicin) in een dosis concentratie wijze waardoor de montage van de gekwantificeerde gegevens en We berekende EG50 waarden van 6.53 ± 1.17, 0,17 ± 0,06 en 0,03 ± 0,03 µM voor ALLN, MG132 en epoxomicin, respectievelijk (Figuur 8). De relatieve toxiciteit voor alle drie proteasoom-remmers werd gekwantificeerd door het meten van het aantal Adherente cellen blijven in de put aangeduid met Hoechst kleurstof. We vonden dat de cel Totaal aantal neiging te dalen in reactie op samengestelde effecten, zoals blijkt uit het soortgelijk EG50 waarden van 6.58 ± 1.06, 0,19 ± 0,03 en 0,05 ± 0,01 µM voor ALLN, MG132 en epoxomicin, respectievelijk.
Figuur 1. Workflow en tijdlijn voor cellijn generatie en hoge inhoudsanalyse (HCA) eiwit aggregatieniveaus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. SOD1 WT en A4V stabiele lijn generatie.
(A) schematisch diagram van de lentivirale en de verpakkingsindustrie vectoren (verpakking en Envelop plasmiden) voor wild type en mutant SOD1 A4V lentivirus generatie. (B) geselecteerd confocal beelden van drie cellen (HEK-293, U2OS en SH-SY5Y) getransduceerde met de lentivirus wild type SOD1 (WT) en mutant SOD1 (A4V). (C) representatieve beelden van drie stabiele cellen behandeld gedurende 24 uur met de proteasoom-remmer, ALLN (10µM). SOD1A4V-YFP-aggregaten bleken te zijn overvloedig aanwezig (rode pijlen) in HEK-293, maar dunbevolkte aanwezig in U2OS of SH-SY5Y cellen. Beelden werden verkregen met behulp van een 20 X doelstelling. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. De vier stappen die nodig zijn voor beeldanalyse van aggregatie met behulp van het YFP-kanaal om cellen en aggregaten te detecteren.
(1) afbeeldingen van de image data opslag en analyse systeem importeren. (2) Selecteer "cellen zoeken" voor het tellen van de cellen. (3) Selecteer "zoeken plekken" om te bepalen van aggregaten. (4) definiëren resultaten op basis van elk algoritme. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Proteasoom remming leiden tot de opeenstapeling van SOD1A4V-YFP aggregaten in HEK-293 cellen.
(A) geselecteerd confocal beelden van SOD1A4V-YFP-HEK-293 cellen met 10 µM van ALLN behandeld. (B) kwantitatieve analyse van statistische vorming geïnduceerde met ALLN (10µM) en cel telt in een tijd-afhankelijke manier. Beelden werden verkregen met behulp van een LWD 20 X doelstelling elke 60 min. schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Schermafdruk van de experimentele set up voor tweekanaals acquisitie (YFP en Hoechst). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7. De vier stappen die nodig zijn voor beeldanalyse van SOD1 aggregaten en cellen voorzien van YFP en Hoechst.
(1) invoerafbeeldingen uit het beeld gegevens gegevensopslag en -analyse-systeem. (2) Selecteer "find kernen" voor het tellen van de cellen. (3) Selecteer "zoeken plekken" om te bepalen van aggregaten. (4) definiëren resultaten op basis van elk algoritme. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8. Kwantitatieve analyse van SOD1 A4V aggregatie en dosisafhankelijk proteasoom remmer concentratie.
(A) hier presenteren we de afbeelding en kwantificering analysemethode voor vlekken en cel telt met behulp van het systeem van de analyse van het beeld van Columbus. Beelden die overeenkomt met twee fluorescerende kanalen specifiek voor Hoechst (Ch1) en YFP (Ch2) achtereenvolgens werden verworven. Hoechst gebeitste objecten (links) werden geïdentificeerd door beeldsegmentatie. De nucleaire masker (midden), afgeleid van het algoritme 'vinden kernen' werd toegepast om het aantal cellen, gevolgd door de plek masker (rechts) "vinden plekken" algoritme gebruikt voor het opsporen van aggregaten. (B) dosis respons studie van het proteasoom-remmers effect op samenvoeging van mutant SOD1-A4V, waarin een variabele EG50 ranglijst van 6.53 µM, ALLN, aan 0,17 µM voor MG132 en 0.03 µM voor Expoxomicin. Confocale beelden van mutant SOD1-A4V beschouwd proteasoom EG50 concentratie geselecteerd. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn twee belangrijkste benaderingen voor het genereren van stabiele cellijnen. De eerste duurt enkele weken en voorbijgaande transfectie en weerstand selectie van de genomic geïntegreerde plasmide DNA vectoren vereist. De tweede is een kwestie van uren door het gebruik van lentivirus, maken van dit protocol vatbaar voor de effectieve uitdrukking van doel eiwit in meerdere cellijnen met beperkte inspanning. De reis-CMV vector19 was een aanhoudende vector te gebruiken, met geconserveerde transductie efficiëntie en stabiele transgenic expressie. Tot onze verbazing bleek de drie cellijnen gegenereerd geen zichtbare aggregatie van de mutant SOD1, in tegenstelling tot de experimentele protocol op basis van voorbijgaande expressie eerdere11beschreven. Het is waarschijnlijk dat voorbijgaande expressie aggregatie van eiwitten, gunsten zoals het produceert hogere eiwit expressie in een relatief korte periode van tijd. Bij voorbijgaande transfectie bereikt de ubiquitin – proteasoom-systeem, dat een meerderheid van eiwitten degradeert, een punt van verzadiging waarin haar vermogen om te degraderen aggregaat-naar voren gebogen eiwitten volledig wordt gebruikt. We kampen echter dat stabiele lijnen hebben meer kans om te reproduceren de fysiologische situatie waarin eiwitten worden uitgedrukt op een relatief constant niveau dat overeenkomt met de afschaffing van de misfolded eiwitten via de proteasoom, autophagosome-lysosoom, en Exocytose. Hoewel de primaire gebeurtenissen die leiden tot ALS nog onbekend zijn, is in verband met de verminderde activiteit van het proteasoom ubiquitinesysteem, veroudering een significante risicofactor23. Zoals wordt geïllustreerd door onze cellulaire assay, bevordert proteasoom remming de aggregatie van misfolded eiwit (SOD1-A4V). Als zodanig schept deze assay nieuwe mogelijkheden om het scherm voor klein molecuul activators van de autophagy signalering traject of het netwerk van de chaperon. Inderdaad, deze laan voor chaperone inductie lijkt veelbelovend, zoals geïllustreerd door het verslag van Kieran et al. waaruit blijkt dat de behandeling met een co inductor van de warmte schok reactie bleek te hebben therapeutische voordelen door verlenging van de levensduur van SODG93A muizen24.
Het is belangrijk om te vermelden dat er een paar valkuilen die u moet overwegen voordat u deze test. Net als bij het protocol van de optimalisatie assay, vonden we dat de concentraties van DMSO op 1% of boven de gemiddelde intensiteit van de gemeten YFP in onze assay verhoogt. Het is daarom belangrijk om de concentratie van DMSO tot 0,5% om te voorkomen dat een dergelijke artefact. Bovendien, de selectie van de vergroting van de lens en de celdichtheid in de assay-plaat zijn belangrijk om te overwegen voor het optimaliseren van de robuustheid van de bepaling.
In onze studie, hebben we aangetoond dat met behulp van een lentivirale systeem, de SOD1A4V-YFP-HEK-293-cellijn geschikt voor monitoring van mutant SOD1 A4V totale vorming op inductie door proteasoom-remmers. De studie van misfolded eiwit en aggregatie is essentieel voor een goed begrip van de mechanismen van proteinopathies. Hoewel het onderzoek hulpmiddelen voor het analyseren van de aggregatie van eiwitten hebben uitgebreid in de afgelopen decennia, moeten efficiënte methoden voor het detecteren en kwantificeren van aggregatie scherm moleculen die totale vorming te verbieden. Dit werk biedt een gedetailleerd protocol voor test ontwikkeling en studies van aggregatie van eiwitten. Hopelijk, met de steun van HCS, HCA en gebruik van chemische of CRISPR/siRNA Bibliotheken, dit werk moet openen nieuwe mogelijkheden voor therapeutics of Roman doel ontdekking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie gefinancierd door de Koreaanse regering (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) en het nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) individuele wetenschapper support program (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
References
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy? J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a, et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a, Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
