Wir beschreiben eine Methode zur Quantifizierung der Aggregation fehlgefaltete Proteine. Unsere Protokolldetails Lentivirale induzierte stabile Zellgeneration Linie, automatisierte konfokale Bildverarbeitung und Bildanalyse von Proteinaggregaten. Als anschauliche Anwendung haben wir untersucht die Wirkung kleiner Moleküle bei der Förderung der SOD1-Aggregation in einer Zeit und Dosis-abhängigen Weise.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Assay-Entwicklung für hohe Content Quantifizierung der Sod1 mutierten Proteins Aggregatbildung in lebenden Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine tödliche Neurodegenerative Erkrankung, die durch vererbte Mutationen im gen Kodierung Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) verursacht werden können. Die strukturelle Instabilität des SOD1 und die Erkennung von SOD1-positiver Einschlüsse in familiärer ALS-Patienten unterstützt eine mögliche ursächliche Rolle für fehlgefaltete und/oder aggregierte SOD1 ALS Pathologie. In dieser Studie beschreiben wir die Entwicklung eines zellbasierte Assays entwickelt, um die Dynamik der SOD1-Aggregation in lebenden Zellen zu quantifizieren durch hohen Gehalt screening Ansätze. Mit Lentivirale Vektoren, erzielten wir stabilen Zelllinien mit dem Ausdruck Wildtyp und Mutanten A4V SOD1 getaggt mit gelb fluoreszierende Protein und festgestellt, dass beide Proteine im Cytosol ohne Anzeichen einer Aggregation zum Ausdruck gebracht wurden. Interessanterweise nur SOD1 A4V stabil ausgedrückt in HEK-293, aber nicht in U2OS oder SH-SY5Y Zelllinien gebildet Aggregate Proteasom-Inhibitor Behandlung. Wir zeigen, dass es möglich ist, basierend auf Dosis-Wirkungs-Analyse der verschiedenen Proteasom-Inhibitoren Aggregation zu quantifizieren und Aggregat-Formation Kinetik von Time-Lapse Mikroskopie zu verfolgen. Unser Ansatz stellt die Möglichkeit der Quantifizierung des Effekts ALS Mutationen auf die Rolle des SOD1 in Aggregatbildung sowie screening für kleine Moleküle, die SOD1 A4V Aggregation verhindern.
Einleitung
Proteinaggregation ist ein biologischer Prozess, durch den misfolded Proteine Gruppe auf und kann als Erreger bei neurodegenerativen Erkrankungen (Amyloidose) handeln. Charakterisierung von Proteinaggregation ist unerlässlich für das Verständnis der Rolle von Aggregaten in zellulären Dysfunktion ebenso wie bei die Entdeckung der neuen Faktoren, die Einfluss auf den Beginn der Pathologie, zu erleichtern. Die Visualisierung der Fluoreszenz-markierten Proteine in lebenden Zellen ist eine leistungsfähige Methode, die bei der Entwicklung von Assays für high Content screening (HCS)1,2,3<....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Lentivirus Produktion
Hinweis: die Produktion und Bearbeitung von Lentivirale Vektoren erfolgte nach den Richtlinien des National Institute of Health (NIH) für Forschung am rekombinanten DNA. Die Plasmid-Codierung, in denen der Wildtyp und A4V mutierte SOD1 mit verstärkten YFP (SOD1WT-YFP und SOD1A4V-YFP) markiert sind in Kim Et al. beschrieben. 11 beide Gene Fusion Produkte wurden verstärkt mit Hilfe der PCR Primerpaar 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ und 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ und in der pTRIP-Delta U3 CMV eingefügt Plasmid 1....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Generierung von stabile Zelllinie Lentivirus verwenden: Die Gesamtstrategie für die Überwachung der SOD1-Protein-Aggregate ist in Abbildung 1dargestellt. In einem ersten Schritt erzielten wir ein Lentivirale Expressionsvektor SOD1 stabile gen Lieferung in Zelllinien (Schritt 1). Zwei Lentivirale Vektoren Codierung YFP getaggt SOD1 WT und SOD1 A4V (SOD1WT-YFP und SOD1A4V-YFP, beziehungsweise) mit Verpackung und Umschlag Plasmide wurden vorbere.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Es gibt zwei Hauptansätze zur Erzeugung von stabilen Zelllinien. Die erste dauert mehrere Wochen und erfordert eine transiente Transfektion und Widerstand Auswahl der genomischen integriertes Plasmid DNA-Vektoren. Die zweite ist eine Sache von Stunden durch den Einsatz von Lentivirus, dieses Protokoll in mehreren Zelllinien mit geringem Aufwand für den Ausdruck des Zielproteins zugänglich machen. Die Reise-CMV-Vektor-19 war ein nachhaltiges Vektor mit konservierten Transduktion Effizienz und stabi.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der koreanischen Regierung (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) und der National Research Foundation of Korea (NRF) einzelnen Wissenschaftler Förderprogramm (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239) finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C 28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging Software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Bildanalysesoftware | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell Liquid Handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
Referenzen
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841(2011).
- Honarnejad, K., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
