Methodenartikel

Assay-Entwicklung für hohe Content Quantifizierung der Sod1 mutierten Proteins Aggregatbildung in lebenden Zellen

DOI:

10.3791/56425

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4. Oktober 2017

 ,  ,  , 
1Automation & Logistics Management, Screening Sciences & Novel Assay Technologies, Institut Pasteur Korea, 2School of Pharmacy, Sungkyunkwan University, 3Technology Development Platform, Institut Pasteur Korea

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben eine Methode zur Quantifizierung der Aggregation fehlgefaltete Proteine. Unsere Protokolldetails Lentivirale induzierte stabile Zellgeneration Linie, automatisierte konfokale Bildverarbeitung und Bildanalyse von Proteinaggregaten. Als anschauliche Anwendung haben wir untersucht die Wirkung kleiner Moleküle bei der Förderung der SOD1-Aggregation in einer Zeit und Dosis-abhängigen Weise.

Zusammenfassung

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Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine tödliche Neurodegenerative Erkrankung, die durch vererbte Mutationen im gen Kodierung Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) verursacht werden können. Die strukturelle Instabilität des SOD1 und die Erkennung von SOD1-positiver Einschlüsse in familiärer ALS-Patienten unterstützt eine mögliche ursächliche Rolle für fehlgefaltete und/oder aggregierte SOD1 ALS Pathologie. In dieser Studie beschreiben wir die Entwicklung eines zellbasierte Assays entwickelt, um die Dynamik der SOD1-Aggregation in lebenden Zellen zu quantifizieren durch hohen Gehalt screening Ansätze. Mit Lentivirale Vektoren, erzielten wir stabilen Zelllinien mit dem Ausdruck Wildtyp und Mutanten A4V SOD1 getaggt mit gelb fluoreszierende Protein und festgestellt, dass beide Proteine im Cytosol ohne Anzeichen einer Aggregation zum Ausdruck gebracht wurden. Interessanterweise nur SOD1 A4V stabil ausgedrückt in HEK-293, aber nicht in U2OS oder SH-SY5Y Zelllinien gebildet Aggregate Proteasom-Inhibitor Behandlung. Wir zeigen, dass es möglich ist, basierend auf Dosis-Wirkungs-Analyse der verschiedenen Proteasom-Inhibitoren Aggregation zu quantifizieren und Aggregat-Formation Kinetik von Time-Lapse Mikroskopie zu verfolgen. Unser Ansatz stellt die Möglichkeit der Quantifizierung des Effekts ALS Mutationen auf die Rolle des SOD1 in Aggregatbildung sowie screening für kleine Moleküle, die SOD1 A4V Aggregation verhindern.

Einleitung

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Proteinaggregation ist ein biologischer Prozess, durch den misfolded Proteine Gruppe auf und kann als Erreger bei neurodegenerativen Erkrankungen (Amyloidose) handeln. Charakterisierung von Proteinaggregation ist unerlässlich für das Verständnis der Rolle von Aggregaten in zellulären Dysfunktion ebenso wie bei die Entdeckung der neuen Faktoren, die Einfluss auf den Beginn der Pathologie, zu erleichtern. Die Visualisierung der Fluoreszenz-markierten Proteine in lebenden Zellen ist eine leistungsfähige Methode, die bei der Entwicklung von Assays für high Content screening (HCS)1,2,3,4unterstützen kann.

Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) gilt als eine Proteopathic Erkrankung, die durch die Anwesenheit von fehlgefaltete Proteine mit der Neigung zu aggregieren und reichern sich in motorischen Neuronen in familiäre ALS (fALS) und sporadisch ALS (sALS)5,6 . Eine Teilmenge von ~ 20 % der Fälle fALS sind verbunden mit dominanten Mutationen im gen Kodierung der cytosolischen antioxidative Enzym Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase Typ 1 (SOD1)7,8. Mehrere mögliche Ursachen für diese genetisch abgeleiteten Dysfunktion sind vorgeschlagen worden, einschließlich Änderungen in der Struktur und Funktion des SOD1-Varianten, z. B. abweichende Stabilität erhöhte sich entfaltenden Rate und Neigung zur aggregierten9, 10. Vor allem, die einzige geprüfte und potentiell toxische Eigenschaft geteilt durch beide ALS verknüpft SOD1-Varianten und Wildtyp (WT) SOD1 ist eine erhöhte Neigung zu unterteilte Proteinaggregaten oder proteinhaltige Einschlüsse11,12 . Fehlgefaltete mutierte SOD1, ist beharrlich Polyubiquitinated und durch das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut. Infolgedessen führt ein niedriges Niveau der Hemmung der Proteasom-Aktivität zur Anhäufung von mutierte SOD113,14, aggregiert die amorphe Strukturen der löslichen Komponenten zusammengesetzt, die mit löslichen mutierte SOD1 austauschen können in der Zellflüssigkeit15. In bestimmten, SOD1 Mutanten A4V (Alanin am Codon 4 geändert, Valin) ist die am häufigsten ALS verursachende Mutation und führt zu schnellen Neurodegeneration mit eine durchschnittliche Überlebenszeit von weniger als 2 Jahre nach Krankheit Beginn16. Biochemisch, hat SOD1 A4V eine zunehmende Tendenz zu monomerize, zu aggregieren und zu bilden Amyloide Poren; die Pore-ähnliche Aggregate sind ähnlich wie Amyloid Poren der anderen Krankheit verbunden mutierten Formen, wie z. B. α-Synuclein und β-Amyloid-Protein17. Um die Dynamik des SOD1-Aggregat Anhäufung zu studieren, noch Methoden zur Überwachung von löslicher und unlöslicher SOD1 zusammengefasster Forms entwickelt werden.

Wir haben bereits gezeigt, mit live Cell Imaging und HEK-293-Zellen transfiziert vorübergehend mit fluoreszierenden Protein-Tags SOD1, dass ALS-assoziierten Mutationen SOD1 Dimerisierung und Aggregation11beeinträchtigt. Obwohl transiente Expressionssysteme nützliche Informationen über den biologischen Ausgang des kurzfristigen gen Überexpression bereitstellen können, können Methoden, die eine stabile Integration der gewünschten Gene für Assay-Entwicklung vorzuziehen. Als solche bieten Lentivirale Vektoren die Möglichkeit, langfristige und regulierten Genexpression auf Säugerzellen 18verleihen. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Erzeugung von stabilen Zelllinien mit rekombinanten Lentivirus Lager WT ausgestrahlt und mutierten SOD1 getaggt mit gelben fluoreszierenden Proteins (YFP). Mit live Cell imaging Mikroskopie und automatisierte Quantifizierung der SOD1-Aggregation, wir ausgelöst und quantifiziert SOD1-Aggregation-Veranstaltungen bei der Hemmung des Proteasoms.

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Protokoll

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1. Lentivirus Produktion

Hinweis: die Produktion und Bearbeitung von Lentivirale Vektoren erfolgte nach den Richtlinien des National Institute of Health (NIH) für Forschung am rekombinanten DNA. Die Plasmid-Codierung, in denen der Wildtyp und A4V mutierte SOD1 mit verstärkten YFP (SOD1WT-YFP und SOD1A4V-YFP) markiert sind in Kim Et al. beschrieben. 11 beide Gene Fusion Produkte wurden verstärkt mit Hilfe der PCR Primerpaar 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ und 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ und in der pTRIP-Delta U3 CMV eingefügt Plasmid 19 mit XhoI und BsrGI Restriktionsschnittstellen. In früheren Experimenten wurden die HEK-293T Zellen in einem Verhältnis von 1:4 bis 1:6 alle zwei Tage aufgeteilt. Vermeidung von mehr als 20 Passagen und Wartung von Zellen weniger 60 % confluency hilft, gute Transfektion Effizienz zu gewährleisten.

  1. On Tag1, HEK-293T Zellen am Zusammenfluss von 30-40 % in einem Durchmesser von 10 cm Gewebekultur Teller (3 x 10 6 Zellen/Gericht) in 10 mL Zellkulturmedium (High-Glukose DMEM mit 10 % FBS und 4 mM L-Glutamin) für Virus Produktion teilen.
  2. Halten die 10 cm Durchmesser Gewebekultur Platte über Nacht in eine CO 2 Inkubator (37 ° C, 5 % CO 2).
  3. Am Tag2, bereiten Sie eine DNA-Transfektion Lösung enthält 10 µg Lentivirale Vektoren (pTRIP-Delta U3 CMV - SOD1WT-YFP oder -SOD1A4V-YFP) zusammen mit der Lentivirale Verpackung Plasmide (5 µg pVSVg; 10 µg pCMV-dR8.71) () Abbildung 2A) 20. 125 µL 1 M CaCl 2 hinzufügen und stellen Sie die Lautstärke auf 500 µL mit destilliertem Wasser. Sanft fügen 500 µL 0,05 M HEPES in die Mischung und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Ersetzen HEK-293T Zellen Medium mit 10 mL vorgewärmten frisches Kulturmedium antibiotikafreien gemischt mit 1 mL DNA-Transfektion Lösung und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO 2.
  5. Am 3. Tag, ersetzen Sie die Zelle überstand mit frischem Nährmedium.
  6. Am Tag 4, Ernte den Überstand in ein 15 mL Tube und Zentrifuge für 5 min bei 500 X g, die toten Zellen und Schutt zu entfernen. Weiter zu reinigen Sie den Überstand indem man es durch einen 0,45 µm-Filter mit einer großen 60 mL Spritze. Sofort in Einweg-Aliquote (300 µL), und bei-80 ° c lagern Damit maximale Produkt Tätigkeit, einen Gefrier-Tau-Zyklus zu vermeiden.

2. Lentivirale Transduktion

  1. die Zelle Trennlinie an 60 % Einmündung ansteckungsverdächtigen (HEK-293-Zellen und SH-SY5Y; 5 x 10 5 Zellen pro Bohrloch und U2OS; 1 x 10 5 Zellen pro Well) in einer Gewebekultur 6-Well-Platte in 2 mL DMEM Medien ergänzt mit 10 % FBS.
  2. Halten die Gewebekultur 6-Well-Platte in einem Inkubator 37 ° C um 5 % CO 2 Übernachtung.
  3. Entfernen Sie die gefrorenen Lentivirus von-80 ° C Gefrierschrank und eine aliquote auf dem Eis vor jedem Gebrauch auftauen; nicht wieder einfrieren.
  4. Während der Virus Auftauen ist, warm das Zellkulturmedium, enthält das Serum kompatibel mit der Zell-Linie von Interesse. Sobald das Virus vollständig aufgetaut ist, bereiten Sie eine Reihe von Verdünnungen (1:3, 01:10, 01:30 und 1: 100) in DMEM in einem frischen 1,5 mL Microfuge Rohr.
  5. Bringen Sie die Lautstärke in den Rohren zu 1 mL mit reduzierten Serum Medien.
  6. Add 2 µL des Polybrene (bei einem Bestand von 4 µg/µL) zu 1 mL der Virus/Medien. Mischen Sie gut durch pipettieren und die Zellen fügen Sie 1 mL der Mischung hinzu. Inkubation der Zellen mit dem Virus für 24 h
  7. Entfernen Sie die Virus-Medien und ersetzen Sie mit normalen DMEM Medien ergänzt mit 10 % FBS. Halten die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO 2.
  8. Das Wachstum der Zellen zu überwachen und ändern die Nährmedien alle zwei Tage. Am Zusammenfluss, erweitern die 6-Well-Schale in einer Gewebekultur 10 cm Scheibendurchmesser.
  9. , Wenn die Zellen ausreichend erweitert wurden, 1,5 x 10 4 Samenzellen pro Bohrloch in 50 µL DMEM Medien auf 384-Well-Assay Platten Ausdruck der die YFP zu überprüfen, das Protein von Mikroskopie getaggt. Wenn die YFP Proteinexpression Zelle markiert zeigt ein Signal-Rausch-Verhältnis ≥ 3, bereiten Sie Zelle bestand für die entsprechende Zellinie.

3. Zeit-abhängige Wirkung der Proteasom-Inhibitor auf Proteinaggregation

Hinweis: Bildaufnahme mit einem automatisierten Mikroskop durchführen (siehe Material).

  1. 0,25 µL DMSO oder Proteasom-Inhibitor, aufgelöst in 100 % DMSO (ALLN, 2 mM) auf Flachboden 384-Well-Platten zu verzichten.
  2. Manuell 1,5 x 10 4 Samenzellen pro Bohrloch in 50 µL DMEM Medien auf demselben assay Platte. Die Endkonzentration der Proteasom-Inhibitor (ALLN) sollte 10 µM.
  3. Richten Sie das Mikroskop Umwelt Anlagensteuerung auf 37 ° C und 5 % CO 2. Ein Screenshot von der Versuchsanordnung ist in Abbildung 3 dargestellten.
  4. Betreiben das Mikroskop im weiten Feld Fluoreszenz-Modus, mit Hilfe der Software mit den folgenden Einstellungen: LWD 20 X Ziel, nicht-konfokale Modus, 4 Felder/Brunnen, mit einem Capture-Intervall von einer Stunde. Am Ende jeder Fahrt aufgenommenen Bilder automatisch auf den Server hochgeladen werden.

4. Zeit Ablauf Bildgebung für YFP Ausdruck in lebenden Zellen und Bildanalyse (Einkanal)

Hinweis: die folgenden Schritte beschreiben die Anwendung der Software (z.B. Columbus).

  1. Wählen Sie den entsprechenden Algorithmus zur Segmentierung der Primärobjekte (Zytosol und Aggregate). Bei Bedarf passen Sie Parameter zur Schwelle "und" Kontrast von Hintergrund ( Abbildung 4).
  2. Anzahl Zellen mit ' Zellen finden ' mit einem individuellen Schwellenwert von 0,1 für die YFP Intensität Kanal. Bestimmen Aggregate mit ein ' Flecken zu finden ' Algorithmus mit einer relativen YFP spot Intensität > 0,2 und eine Spaltung Koeffizient der 1.0.

5. Dosis-Antwort-Wirkung von Proteasom-Inhibitoren auf Proteinaggregation an lebenden Zellen gebeizt für ihre Kerne (zwei Kanäle)

Hinweis: führen Sie mit einem automatisierten Mikroskop Bildaufnahme. Bestimmen den Konzentrationsbereich der Proteasom-Inhibitoren (ALLN, Epoxomicin und MG132) basierend auf dem erwarteten IC 50 Wert um eine optimale Kurve Sitz zu gewährleisten.

  1. Prepare Verdünnungsreihen von Verbindungen auf einem 384-Well Storage Polypropylen Platte durch den Standard Verdünnungsreihe 1:3. Achten Sie darauf, die zusammengesetzten Verdünnungen mischen gut um sicherzustellen, dass die zusammengesetzte Konzentrationen korrekt sind.
  2. Auf 0,25 µL Proteasom-Inhibitoren auf leere flach-Boden schwarz 384-Well-Assay Platten verzichten. Wir verwenden einen liquiden Handler, ausgestattet mit einem 384-Kapillare Kopf fähig Bände zu übertragen.
  3. Samen 1,5 x 10 4-Zellen pro Bohrloch in 50 µL DMEM Medien auf Assay Platten. Inkubieren der Assay-Platten bei 37 ° C und 5 % CO 2 für 24 Std.
  4. Fügen Sie 10 µL DMEM Medien (bei 37 ° C vorgewärmt) mit Färbelösung (Hoechst 33342 auf einen Bestand von 10 mg/mL) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 min.
  5. Starten die microsBetriebssoftware zu bewältigen. Ein Screenshot von der Versuchsanordnung ist in Abbildung 6 dargestellt. Wählen Sie die " Konfiguration " Registerkarte, und wählen Sie 20 X Objektiv und die richtige Plattenart. Stellen Sie sicher " Kragen " befindet sich auf den richtigen Wert auf das Ziel, so dass korrekte Fokussierung mit verschiedenen Plattenarten.
  6. Wählen Sie die " Mikroskop " tab. definieren Exposition 1 als YFP (488 Laser) und Exposition 2 als Hoechst (405 Laser). Aktivieren Sie den Filter auf beiden Belichtungszeiten und Kamera 1 und 2 gegenüber Kamera 2 weisen Sie Exposition 1 zu. Belichtungszeiten auf ~ 800 ms für Exposition 1 gesetzt und ~ 40 ms für Exposition 2.
  7. Select Exposition 1. Legen Sie Fokus Höhe auf 0 µm. Select " Fokus ". Nachdem sich konzentriert, setzen Sie Kamera 1. Die Fokus-Höheneinstellung zur Optimierung der Belichtung Ebene und klicken auf " Höhe ". Ändern Sie die Belichtungszeiten und laser-Kraft, um eine maximale Pixel-Intensität von ~ 3.000 geben. Belichtungsparameter zu retten. Wiederholte Exposition 2.
  8. Select " Experiment Definition " tab. erstellen Sie ein Layout und Sublayout. Drag & drop die entsprechenden Layout, Belichtung, Referenzbild, Skewcrop Datei und Sublayout. Speichern Sie das Experiment.
  9. Select " automatische Experiment " Registerkarte, und Bilder zu erwerben. Am Ende jeder Fahrt aufgenommenen Bilder automatisch auf den Server hochgeladen werden.

6. Bildanalyse von zwei-Kanal-Bilder

  1. Wählen Sie den Softwarealgorithmus zur Segmentierung der Primärobjekte (Kerne, Zellflüssigkeit und Aggregate) ( Abbildung 7).
  2. Wählen Sie die Methode, die Kerne genau durch Sichtkontrolle der segmentierten Objekte Segmente. Hoechst-gefärbten Objekte in Kanal 1 (Ch1) werden verwendet werden, um die Anzahl der Zellen bestimmen. Die YFP Färbung von das mutierte SOD1-A4V in Kanal 2 (Ch2) verwendet wird, um die Menge von Aggregaten bestimmen.
  3. Graf Zellen unter Verwendung der ' Kerne zu finden ' Algorithmus als Hoechst-Färbung Regionen > 20 µm 2, mit einem Split-Faktor von 7.0, eine individuelle Schwelle von 0,40 und einen Kontrast > 0,10.
  4. Die Datentabelle erstellen und bestimmen EG 50 für jede der Verbindungen mit den ' nicht-lineare Regression ' Gleichung in der Grafik-Software.

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Ergebnisse

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Generierung von stabile Zelllinie Lentivirus verwenden: Die Gesamtstrategie für die Überwachung der SOD1-Protein-Aggregate ist in Abbildung 1dargestellt. In einem ersten Schritt erzielten wir ein Lentivirale Expressionsvektor SOD1 stabile gen Lieferung in Zelllinien (Schritt 1). Zwei Lentivirale Vektoren Codierung YFP getaggt SOD1 WT und SOD1 A4V (SOD1WT-YFP und SOD1A4V-YFP, beziehungsweise) mit Verpackung und Umschlag Plasmide wurden vorbere...

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Diskussion

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Es gibt zwei Hauptansätze zur Erzeugung von stabilen Zelllinien. Die erste dauert mehrere Wochen und erfordert eine transiente Transfektion und Widerstand Auswahl der genomischen integriertes Plasmid DNA-Vektoren. Die zweite ist eine Sache von Stunden durch den Einsatz von Lentivirus, dieses Protokoll in mehreren Zelllinien mit geringem Aufwand für den Ausdruck des Zielproteins zugänglich machen. Die Reise-CMV-Vektor-19 war ein nachhaltiges Vektor mit konservierten Transduktion Effizienz und stabi...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der koreanischen Regierung (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) und der National Research Foundation of Korea (NRF) einzelnen Wissenschaftler Förderprogramm (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ALLN (C20H37N3O4)Millipore208719
MG132 (C26H41N3O5)Sigma-AldrichC2211
Epoxomicin (C 28H50N4O7)Sigma-AldrichE3652
Hoechst 33342InvitrogenH-3570
OperaPerkin ElmerOP-QEHS-01
Opera EvoShell softwarePerkin ElmerVer 1.8.1
OperettaPerkin ElmerOPRT1288
Harmony Imaging SoftwarePerkin ElmerVer 3.0.0
Columbus BildanalysesoftwarePerkin ElmerVer 2.3.2
CyBi Hummingwell Liquid HandlingCyBio AGOL 3387 3 0110

Referenzen

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Schlagwörter

SOD1 AggregationHigh Content ScreeningBehandlung mit Proteasom InhibitorenHEK 293 Zellenlentivirale TransduktionZeitraffer MikroskopieDosis Wirkungs AnalyseMarkierung mit fluoreszierenden Proteinenautomatisierte Mikroskopie

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