In diesem Protokoll wir beschreiben Techniken für die richtige Zerlegung von Arabidopsis Blumen und Siliques, einige grundlegende Clearing-Techniken und Färbung Verfahren für ganz-Mount Beobachtungen der reproduktiven Strukturen ausgewählt.
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Methodenartikel
Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Aufgrund seiner gewaltigen Werkzeuge für Molekulare genetische Studien ist Arabidopsis Thaliana eines der prominentesten Modell Arten in Pflanzenbiologie und insbesondere Anlage Reproduktionsbiologie. Allerdings beinhalten Pflanzen-morphologische, anatomische und Ultrastrukturforschung Analysen traditionell zeitraubende einbetten und Verfahren für Hellfeld, Scannen und Elektronenmikroskopie-Schnitt. Jüngste Fortschritte in konfokale Fluoreszenzmikroskopie, State-of-the-Art 3-d-CAD-mikroskopische Analysen und die kontinuierliche Verbesserung der molekularen Techniken auf gering verarbeitete ganze-Mount Proben verwendet werden führte zu einer steigenden Nachfrage nach Entwicklung effizienter und minimale Probe Verarbeitungstechniken. In diesem Protokoll beschreiben wir Techniken für richtig sezieren Arabidopsis Blumen und Siliques, grundlegende Techniken, clearing und einige befleckenden Verfahren zur gesamten-Mount Beobachtungen der reproduktiven Strukturen.
Einleitung
Blumen sind eines der wichtigsten Organe der Angiospermen definieren. Blühende Pflanzen erschienen vor 90 Millionen Jahren1, und so schnell, dass ihre schnelle aussehen als eine "abscheuliche Geheimnis" von Charles Darwin2beschrieben wurde diversifiziert. Die Interessen der Pflanzenforscher Blütenentwicklung sind vielfältig. Einige Forschung konzentriert sich auf das Verständnis des evolutionären Ursprungs der Blume als Ganzes oder die Entwicklung der spezifischen anatomischen, strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Blumen3,4,
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Protokoll
1. Blume und Schote Fixierung
- Ernte Blumen und Siliques aus Pflanzen synchronisiert bei der Eröffnung der ersten Blüte.
Hinweis: Unter den experimentellen Bedingungen hier verwendete, Pflanzen blühen beginnen ungefähr 21 Tage nach der Transplantation von Murashige und Skoog (MS) Platten zu Boden. Samen sind geschichtete für 3 – 4 Tage bei 4 ° C und gekeimt/gewachsen auf MS-Platten bei 22 ° C/16 h Licht und 18 ° C/8 h dunkel für 8 bis 10 Tage vor der Verpflanzung der Sämlinge auf nährstoffreichen Böden in Töpfen gehalten unter den gleichen Bedingungen (Abbildung 1). Die Anzahl der Wiederholungen hängt von der spezifischen Fors....
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Ergebnisse
Arabidopsis gehört zur Familie Brassicacea, Lager Blütenstände mit bisexuell Blumen in einer doldentraube (Abbildung 1). Jede Blume hat vier Kelchblätter, vier Blütenblätter, sechs staubblätter (vier lange und zwei kurze) und ein syncarpous Gynoeceum, bestehend aus zwei Geburt an geschmolzenen Fruchtblätter (Abb. 1F-H) in vier konzentrische Umgänge25,2.......
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Diskussion
Die Existenz von vielen Blütenknospen innerhalb einer einzigen Blütenstand der Arabidopsis, überspannt alle Blume Entwicklungsstadien, bietet eine einzigartige Gelegenheit für Studien, die darauf abzielen, einen Effekt der Behandlung oder eine Entwicklungsstörung Funktion charakterisieren gleichzeitig über die verschiedenen Phasen der Blütenentwicklung. Ein guter Bezugspunkt zwischen verschiedenen Einzelpflanzen ist die Eröffnung der ersten Blüte der wichtigsten Blütenstand. Pflanzen werden behandelt, so dass Bl.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Universität Zürich, ein IEF Marie Curie Grant (keine zu gewähren. TransEpigen-254797, A.H.), ein Advanced Grant des Europäischen Forschungsrates (keine zu gewähren. Medea-250358, UG), und ein Projekt Forschung und Technologieentwicklung (Grant MecanX, UG) von SystemsX.ch, die Schweizer Initiative in Systembiologie.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenzien und Materialien | |||
| Ethanol | Scharlau | ET00102500 | |
| Essigsäure | Applichem | A3686,2500 | 100% Molekularbiologie |
| Gletscheressigsäure | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Molekularbiologie Methanol | Scharlau | ME03062500 | |
| Formaldehydlösung | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Propionsäure | Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
| Chloralhydrat | Sigma-Aldrich | 15307 | |
| Glycerin | Roth | 3783.1 | |
| Gummi arabicum | Fluka | 51198 | |
| Milchsäure | Fluka | 69773 | |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | Wir haben flüssiges Phenol verwendet (verwenden Sie die Dichte, um das erforderliche Volumen für Ihre Lösung zu finden) |
| Nelkenöl | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xylol | Roth | 4436.1 | |
| Jod | Fluka | 57665 | |
| Kaliumiodid | Merck | 5043 | |
| Malachitgrün | Fluka | 63160 | |
| Fuchsinsäure | Fluka | 84600 | |
| Orange G | Sigma | 7252 | |
| Natriumdodecylsulfat | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Natriumhydroxid | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Applichem | A1047,1000 | |
| Natriumphosphat zweibasisch | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| Kaliumphosphat | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | Fluoreszierender Aufheller 28 |
| Auramine | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | giftig |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anilinblau | Merck | 1275 | |
| MS medium | Carolina | 19-57030 | |
| Nährstoffreiches Substrat | Einheitserde | ED73 | |
| Uhrmacherglas | Keine Marke | ||
| 15 ml Falcon Zentrifugenröhrchen | VWR | 62406-200 | |
| Dumond Pinzette | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| Pinzette | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| Spritze | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
| Präparationsnadel | BD | BD Microlance 304000 | |
| Objektträger | Thermo Scientific | 10143562CE | Schnittkanten |
| Deckgläser | Thermo Scientific | DV40008 | |
| Feuchtbox | Eine Plastikbox mit feuchtem Papiertuch und Schiebestützen inside | ||
| Name | Unternehmen | Katalognummer | <>Kommentare |
| Lösungen< | |||
| strong>Fixatives | |||
| Carnoy (Farmer) | Absolutes Ethanol : Eisessig, 3:1 (ml:ml) | ||
| Methanol/Essigsäure-Fixiermittel | 50 % (v/v) Methanol, 10 % (v/v) Eisessig in deionisiertem Wasser | ||
| FPA50-Fixiermittel | Formalin, Propionsäure, 50 % Ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
| Reinigungslösungen | |||
| Chloralhydrat/Glycerin | Chloralhydrat : Glycerin : Wasser, 8:1:2 (g:ml:ml). Kann für alle Entwicklungsstadien der Blüte und für die silique-Entwicklung mit DIC-Mikroskopie verwendet werden. Das beste Fixiermittel ist das auf Formalin basierende FPA50 | ||
| Modified Hoyer | Gum arabicum 7,5 g, Chloralhydrat 100 g, Glycerin 5 ml, Wasser 30 ml. Kann für alle Entwicklungsstadien der Blüte und für die silique-Entwicklung mit DIC-Mikroskopie verwendet werden. Das beste Fixiermittel ist das auf Formalin basierende FPA50 | ||
| Herr's 4½ Reinigungsflüssigkeit | Milchsäure, Chloralhydrat, Phenolkristalle, Nelkenöl, Xylol; 2:2:2:2:1, nach Gewicht. Kann für alle Entwicklungsstadien der Blüten (insbesondere für die Staubblattentwicklung) und für die Siliqueentwicklung mit DIC-Mikroskopie verwendet werden. Das beste Fixiermittel ist die auf Formalin basierende FPA50 | ||
| SDS/NaOH-Lösung | Verdünnen Sie das SDS und die NaOH-Stammlösung auf 1% SDS / 0,2 N NaOH (10-fache Verdünnung). Für alle Stadien der Blüten- und Silique-Entwicklung. Das beste Fixiermittel ist das Methan/Essigsäure-Fixiermittel; Die beiden anderen Fixiermittel können ebenfalls verwendet werden. Kann mit Calcofluor-, Auramin-, DAPI- und Anilinblau-Färbelösung kombiniert werden. | ||
| SDS-Stammlösung | 10 % (w/v) Natriumdodecylsulfat. 10 g Natriumdodecylsulfat in 80 ml deionisiertem Wasser auflösen und mit entionisiertem Wasser auf 100 ml auffüllen. | ||
| NaOH-Stammlösung | 2 N NaOH-Lösung: 4 g NaOH in 40 ml entionisiertem Wasser auflösen und mit entionisiertem Wasser auf 100 ml auffüllen | ||
| Kombinierte Reinigungs- und Färbelösungen | |||
| Herr's IKI-4½ | Zu einem Standard 4½ (9 g insgesamt) fügen Sie hinzu: 100 mg Jod, 500 mg Kaliumjodid. Diese Reinigungslösung kann für alle Entwicklungsstadien der Blüten und für die Silique-Entwicklung verwendet werden, entweder zur Erhöhung des Kontrasts oder zur Charakterisierung der Stärkedynamik. Verwenden Sie FPA50 für die Strukturanalyse und Carnoy's Fixativ für die quantitative Stärkeanalyse. | ||
| Alexander-Färbung | Ethanol 95% 10ml, Malachitgrün (1% in 95% EtOH) 1 ml, Fuchsinsäure (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0,5ml, Phenol 5g, Chloralhydrat 5g, Eisessig 2ml, Glycerin 25ml . Diese Reinigung/Färbung allein oder in Kombination mit Herr's 4½ Die Lösung kann verwendet werden, um Pollenaborte bei Blüten mit reifen und dreizelligen Pollenkörnern zu bewerten. Es wird auf frisch geharvtem, nicht fixiertem Material verwendet. | ||
| FärbelösungenCalcofluor-Lösung | |||
| Calcofluor 0,007% in Wasser (g:ml). Ursprünglich als optischer Aufheller verwendet. Kann zum Färben von Cellulose, carboxylierten Polysacchariden und Callose in Zellwänden verwendet werden. Wird häufig verwendet, um das Intine des Pollenkorns zu färben. Alle drei Fixiermittel können mit dieser Lösung verwendet werden. | |||
| Auramin Lösung | Auramin 0,01% in Wasser (g:ml). Dieser lipophile Fluoreszenzfarbstoff kann unter anderem zum Färben von Nagelhaut, Cutin und Exin verwendet werden. Alle drei Fixiermittel können mit dieser Lösung verwendet werden | ||
| Calcofluor-Auramin Mischung | Auramin Lösung : Calcofluor Lösung, 3:1. Kann für eine kombinierte Färbung durch beide Lösungen verwendet werden. Andere Anteile können unter Beibehaltung eines geringeren Anteils von Calcofluor im Vergleich zu Auramin bestimmt werden. | ||
| DAPI-Lösung | DAPI 0,4 μg/ml, 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7), 0,1 % Triton-X-100, 1 mM EDTA. Diese Lösung kann zur Färbung von Chromosomenausbreitungen während der männlichen und weiblichen Meiose und von Zellkernen beliebiger Gewebe verwendet werden. Wird häufig zur Untersuchung der Entwicklung von Pollenkörnern verwendet. Carnoy und Methanol/Essigsäure sind die besten Fixiermittel für diese Lösung. Fixiermittel auf Formaldehydbasis wie FPA50 können die Färbung beeinträchtigen. Anregung im UV und maximale Emission um 461 nm. | ||
| Natriumphosphatpuffer (0,1 M) | Protonenrezeptor: 0,2 M Na2HPO4, Protonendonor: 0,2 M NaH2PO4, Verhältnis Protonendonor / Protonenrezeptor: 1,364 ( für einen pH 7) | ||
| Anilinblaulösung | 0,1% (w/v) Anilinblau, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% Glycerin. Diese Lösung kann zum Färben von Callose und Cellulose in vielen Entwicklungsstadien verwendet werden (z. B. Calloseablagerung in männlichen und weiblichen Teraden, Callose-Pfropfen in Pollenschläuchen). Anregung im UV und maximale Emission um 455. Es kann auch bei 514 nm angeregt werden, wobei die Emission im roten Bereich für die Färbung des Zellinhalts erfolgt. |
Referenzen
- Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
- Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
- Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z.
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Nachdrucke und Genehmigungen
