Method Article

Eine bequeme Methode für die Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie Katecholamin Neurotransmitter und deren Metabolite

DOI:

10.3791/56445

⸱

March 1st, 2018

 ,  ,  ,  , 
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

In This Article

Summary

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Wir präsentieren eine bequeme Festphasen-Extraktion gekoppelt an Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit elektrochemischen Detektion (ECD) für die gleichzeitige Bestimmung von drei Monoamin-Neurotransmittern und zwei ihrer Metaboliten im Urin von Säuglingen. Wir erkennen auch der Metabolit MHPG als potenzielle Biomarker für die Früherkennung von Schädigungen des Gehirns für Kleinkinder.

Abstract

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Die Extraktion und Analyse von Katecholamin Neurotransmitter in biologischen Flüssigkeiten ist von großer Bedeutung bei der Beurteilung der Funktion des Nervensystems und damit verbundenen Krankheiten, aber ihre genaue Messung ist nach wie vor eine Herausforderung. Viele Protokolle sind für die Messung der Neurotransmitter durch eine Vielzahl von Instrumenten, einschließlich Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) beschrieben worden. Allerdings gibt es Mängel, wie z. B. komplizierte Operation oder schwer zu erkennende mehrere Ziele, die nicht vermieden werden können, und derzeit die dominante Analysetechnik ist noch gepaart mit empfindlichen elektrochemische oder fluorimetrischen Erkennung durch HPLC seine hohe Empfindlichkeit und gute Selektivität. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Vorbehandlung und Erkennung von Katecholaminen mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit elektrochemischen Detektion (HPLC-ECD) in realen Urinproben von Säuglingen mit Electrospun zusammengesetzten Nanofasern komponierte beschrieben. Polymeren Krone Ether mit Polystyrol als Adsorbens auch bekannt als der Festphase verpackt-Faser-Extraktionsmethode (PFSPE). Wir zeigen, wie Urin, die Proben können leicht durch eine Nanofaser verpackt Festphase-Spalte, und wie die Analyten in der Probe schnell angereichert werden können, vorgereinigt werden desorbiert, und auf einem ECD-System erkannt. PFSPE vereinfacht die Vorbehandlung Verfahren für biologische Proben für verringerte Zeit, Kosten und die Verringerung des Verlustes der Ziele ermöglicht.

Insgesamt zeigt diese Arbeit eine einfache und bequeme Protokoll für die Festphasen-Extraktion, gekoppelt an ein HPLC-ECD-System für die gleichzeitige Bestimmung von drei Monoamin-Neurotransmitter (Dopamin (DA), Noradrenalin (NE), Adrenalin (E)) und zwei ihre Stoffwechselprodukte (3-Methoxy-4-Hydroxyphenylglycol (MHPG) und 3,4-Dihydroxy-Phenylacetic Säure (DOPAC)) im Urin von Säuglingen. Das etablierte Protokoll wurde angewandt, um die Unterschiede der Harn Katecholamine und deren Metabolite zwischen risikoreichen Säuglinge mit perinatalen Hirnschäden und gesunden Kontrollpersonen zu beurteilen. Vergleichende Analyse ergab einen signifikanten Unterschied im Harn MHPG zwischen den beiden Gruppen, die darauf hinweist, dass die Katecholamin-Metaboliten ein wichtiger Kandidat Marker zur Früherkennung von Fällen für Hirnschäden bei Säuglingen gefährdet sein können.

Introduction

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Katecholamin Neurotransmitter und deren Metaboliten Inhalte in Körperflüssigkeiten können neuronale Funktion beeinflussen und Auswirkungen auf das Gleichgewicht der Reaktion auf Anregung Staaten zu einem großen Teil1. Abnormities kann dazu führen, dass eine Vielzahl von Krankheiten, z. B. Ganglioneuroma, Pheochromacytoma, Neuroblastom und neurologischen Störungen1,2. Extraktion und Bestimmung der Katecholamine in Körperflüssigkeiten ist sinnvoll, die Diagnose der relevanten Krankheiten. Jedoch gibt es in geringen Konzentrationen Katecholamine in biologischen Proben und leicht oxidierbar....

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Protocol

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Einwilligung der Eltern war, und institutionelle Review Board Genehmigung wurde für die Studie. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Code of Ethics der World Medical Association (Declaration of Helsinki) für Experimente mit Menschen durchgeführt. Pflegende Angehörige von allen Teilnehmern zur Verfügung gestellt schriftliche Zustimmung für sein in die Studie aufgenommen. Ethikkommission Genehmigung von Zhongda Krankenhaus, affiliate mit Southeast University, wurde auch gewonnen.

1. Vorbereitung der Spalten und Lösungen für die Extraktion und Bestimmung der Katecholamine benötigt

  1. Bereiten Sie die PFSPE-Spalte. Unterteilen Sie....

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Results

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Dieses Protokoll ist eine einfache und bequeme PFSPE Methode zum Vorbehandeln Urinproben und bereichern fünf Katecholamine zur Erkennung über ein HPLC-ECD-System; eine Abbildung des Prozesses ist in Abbildung 1dargestellt. Das Protokoll enthält hauptsächlich vier Schritte aktivieren, laden, spülen, und eluting - gepaart mit einer kleinen Menge von PCE-PS Nanofasern und einem einfachen Festphasen-Extraktion-Gerät. Die Morphologie der PCE-PS Nanofasern wurde an.......

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Discussion

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Die vorgeschlagene PFSPE-Methode in diesem Artikel möglicherweise erhebliche und aussagekräftig in Bezug auf seine Schnelligkeit, Einfachheit und Bequemlichkeit. Die Adsorbentien im Protokoll verwendet werden Electrospun Nanofasern, die hohe Oberfläche Bereich-zu-Volumen-Verhältnis und der Analyten mit hohem Wirkungsgrad zu adsorbieren. Die Prozedur nur braucht ein paar Milligramm Nanofaser und ein kleines Volumen des Lösungsmittels Fließmittel und erfordert keinen Verdunstung Schritt Analyten zu konzentrieren. Hier habe.......

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Disclosures

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Die Autoren bestätigen, dass es kein Interessenkonflikt mit jeder finanzielle Organisation bezüglich des Materials in diesem Artikel beschriebenen gibt.

Acknowledgements

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Diese Studie wurde unterstützt durch die National Science Foundation of China (No.81172720, Nr. 81673230), die soziale Entwicklung Forschung Programm der Jiangsu Provinz Wissenschaft und IT-Abteilung (Nr. BE2016741), Wissenschaft & Technologie-Projekt der China General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine (2015QK055), das geöffnete Projekt Programm der Key Laboratory der kindlichen Entwicklung und das Lernen des Ministeriums für Bildung, Wissenschaft Southeast University (CDLS-2016-04). Wir erkennen mit freundlichen Grüßen Yuan Song und Ping Liu, die uns in Proben Sammlung unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
200 & Mikro; L Pipettenspitzensäulezur Aufnahme von Nanofasern
PCE-PS Nanofasermaterialfür die PFSPE-Extraktion
Stahlstab (ca. 0,5 mm Durchmesser)Füllen Sie die Nanofasern in die
Säule gasdichte Kunststoffspritze (5 ml)Komprimieren Sie die Lösung in das Ende der Spitze
MethanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd67-56-1
Diphenylborinsäure-2-aminoethylester (DPBA)Sigma-Aldrich.IncA-106408Komplexreagenz
Noradrenalin (NE)Sigma-Aldrich.IncA-9512Analyt
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglykol (MHPG)Sigma-Aldrich.IncH1377Analyt
Adrenalin (E)Sigma-Aldrich.Inc100154-200503Analyt
3, 4- Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC)Sigma-Aldrich.IncD-9128Analyt
Dopamin (DA)Sigma-Aldrich.IncH-8502Analyt
3, 4-Dihydroxybenzylaminhydrobromid (DHBA)Sigma-Aldrich.Inc858781Innenetikett
AcetonitrilSigma-Aldrich.Inc75-05-8Eluriant und
Phosphorsäurein der mobilen PhaseSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7664-38-2Eluriant
HarnsäureSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd69-93-2künstliches Urinkreatinin
Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd60-27-5künstliches
Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd6132-04-3künstlicher Urin
KClSinopharm Chemisches ReagenzCo. , Ltd7447-40-7künstlicher Urin
NH4ClSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd12125-02-9künstlicher Urin
NaHCO3Sinopharm Chemical ReagenzCo., LtdSWC0140326künstlicher Urin
C2Na2O4Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd62-76-0künstlicher Urin
NaSO4Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd7757-82-6künstlicher Urin
DinatriumhydrogenphosphatSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10039-32-4künstlicher Urin
HarnstoffSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd57-13-6künstlicher Urin
NaClSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd7647-14-5künstlicher Urin
MgSO4.7H2OSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10034-99-8künstlich Urin
CaCl2Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10035-04-8künstlicher Urin
HClSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd7647-01-0künstlicher Urin
ZitronensäureSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd77-92-9künstlicher Urin und mobile Phase
EDTA DinatriumsalzSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd34124-14-6mobile Phase
monometallisches NatriumorthophosphatSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd7558-80-7künstlicher Urin und mobile Phase
1-Heptansulfonsäure NatriumsalzSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd22767-50-6Phase
NatriumhydroxidSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd1310-73-2mobile Phase
Phenylboronsäuresäule (PBA-Säule)Aglilent12102018PBA-Extraktion
Inertsil® ODS-3 5 & Mikro; m 4.6&fach; 150 mm SäuleDikma5020-06731HPLC-Säule zur Trennung
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SHIMADZU L-ECD-60A elektrochemischer DetektorShimadzu Corporation, JapanL-ECD-60A-Detektorfür die Analyten
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry SystemMicromeritics, USAOberflächen- und Porositätsanalysator 
Urintrinatriumcitrat mobile

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376(2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H.

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