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Eine bequeme Methode für die Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie Katecholamin Neurotransmitter und deren Metabolite

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DOI:

10.3791/56445

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1. März 2018

 ,  ,  ,  , 
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine bequeme Festphasen-Extraktion gekoppelt an Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit elektrochemischen Detektion (ECD) für die gleichzeitige Bestimmung von drei Monoamin-Neurotransmittern und zwei ihrer Metaboliten im Urin von Säuglingen. Wir erkennen auch der Metabolit MHPG als potenzielle Biomarker für die Früherkennung von Schädigungen des Gehirns für Kleinkinder.

Zusammenfassung

Die Extraktion und Analyse von Katecholamin Neurotransmitter in biologischen Flüssigkeiten ist von großer Bedeutung bei der Beurteilung der Funktion des Nervensystems und damit verbundenen Krankheiten, aber ihre genaue Messung ist nach wie vor eine Herausforderung. Viele Protokolle sind für die Messung der Neurotransmitter durch eine Vielzahl von Instrumenten, einschließlich Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) beschrieben worden. Allerdings gibt es Mängel, wie z. B. komplizierte Operation oder schwer zu erkennende mehrere Ziele, die nicht vermieden werden können, und derzeit die dominante Analysetechnik ist noch gepaart mit empfindlichen elektrochemische oder fluorimetrischen Erkennung durch HPLC seine hohe Empfindlichkeit und gute Selektivität. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Vorbehandlung und Erkennung von Katecholaminen mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit elektrochemischen Detektion (HPLC-ECD) in realen Urinproben von Säuglingen mit Electrospun zusammengesetzten Nanofasern komponierte beschrieben. Polymeren Krone Ether mit Polystyrol als Adsorbens auch bekannt als der Festphase verpackt-Faser-Extraktionsmethode (PFSPE). Wir zeigen, wie Urin, die Proben können leicht durch eine Nanofaser verpackt Festphase-Spalte, und wie die Analyten in der Probe schnell angereichert werden können, vorgereinigt werden desorbiert, und auf einem ECD-System erkannt. PFSPE vereinfacht die Vorbehandlung Verfahren für biologische Proben für verringerte Zeit, Kosten und die Verringerung des Verlustes der Ziele ermöglicht.

Insgesamt zeigt diese Arbeit eine einfache und bequeme Protokoll für die Festphasen-Extraktion, gekoppelt an ein HPLC-ECD-System für die gleichzeitige Bestimmung von drei Monoamin-Neurotransmitter (Dopamin (DA), Noradrenalin (NE), Adrenalin (E)) und zwei ihre Stoffwechselprodukte (3-Methoxy-4-Hydroxyphenylglycol (MHPG) und 3,4-Dihydroxy-Phenylacetic Säure (DOPAC)) im Urin von Säuglingen. Das etablierte Protokoll wurde angewandt, um die Unterschiede der Harn Katecholamine und deren Metabolite zwischen risikoreichen Säuglinge mit perinatalen Hirnschäden und gesunden Kontrollpersonen zu beurteilen. Vergleichende Analyse ergab einen signifikanten Unterschied im Harn MHPG zwischen den beiden Gruppen, die darauf hinweist, dass die Katecholamin-Metaboliten ein wichtiger Kandidat Marker zur Früherkennung von Fällen für Hirnschäden bei Säuglingen gefährdet sein können.

Einleitung

Katecholamin Neurotransmitter und deren Metaboliten Inhalte in Körperflüssigkeiten können neuronale Funktion beeinflussen und Auswirkungen auf das Gleichgewicht der Reaktion auf Anregung Staaten zu einem großen Teil1. Abnormities kann dazu führen, dass eine Vielzahl von Krankheiten, z. B. Ganglioneuroma, Pheochromacytoma, Neuroblastom und neurologischen Störungen1,2. Extraktion und Bestimmung der Katecholamine in Körperflüssigkeiten ist sinnvoll, die Diagnose der relevanten Krankheiten. Jedoch gibt es in geringen Konzentrationen Katecholamine in biologischen Proben und leicht oxidierbar. Darüber hinaus sind sie sehr schwierig, wegen der großen Menge der Einmischung in die mittleren3eluieren. Simultane Detektion von Katecholaminen in biologischen Flüssigkeiten ist somit nach wie vor eine Herausforderung.

Es wurden Bewertungen zeigen, dass Harn Katecholamine ein gewisses Maß an Stress sein können und ihre Ebenen sind wichtige biologische Marker reagieren auf taktile Stimulation, die Verarbeitung in Neugeborenen-5. Den Untersuchungen zufolge alle Kinder, die von der vorzeitigen Vorfälle litten sind mit einem Risiko für Gehirn Verletzungen4,5,6, und abnorme Freisetzung von Katecholaminen und damit zusammenhängende Fragen in den Flüssigkeiten kann zu Verletzungen führen. Es gibt erweiterte Magnet-Resonanz-Techniken, die Schädigung des Gehirns in früheren Phasen7,8erkennen können. Jedoch innerhalb der ersten 48 h verursacht ein abnorme Neurodevelopmental Prozess permanent-Hirn-Trauma, das zeigt sich in medizinische Bilder11wird nicht. Außerdem hohe Kosten und knappen Instrument Ressourcen, zusammen mit anderen Faktoren macht es unmöglich für alle Neugeborenen Einheiten Zugriff auf diese speziellen Neuro-Imaging-Techniken zu. Jedoch die Verwendung von eine leicht zugängliche und praktische Biomarker (z.B. Katecholamine und deren Metabolite) konnte diese Mängel überwinden, und die Vorführung eines Biomarkers in menschlichen Flüssigkeiten kann helfen bei der Früherkennung von Hirn-Trauma und führen zu veranlassen Kennung des Neugeborenen benötigen Neuroprotektion9. Die Katecholamine im Urin können ein einfach und klar Index durch die direkte Korrelation zwischen der Höhe der ihnen in Flüssigkeiten und Neuroactivity Funktion freigegeben sein.

Unter biologischen Flüssigkeiten, zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) und Plasma-Proben sind nicht leicht zu bekommen über bestehenden traumatische Verfahren, und es ist auch sehr schwer loszuwerden, Störungen durch Klebstoff Protein und andere Verunreinigungen, führt zu einer lästigen und zeitraubende Probenahme Prozess, für wiederholte Erkennung ungeeignet ist. Auch für Kinder ist es fast unmöglich, die Proben auf traumatische Weise zu bekommen. Harn Probenahme deshalb besser als die anderen Formen der Probenahme, wie es ist, nicht-invasive, einfach zu bedienen, und kann immer wieder durchgeführt werden. Urinproben sind reichlich vorhanden und leicht zu verstauen, und zeigen große Vorteile gegenüber anderen Formen der biologischen Proben.

Die wichtigsten Methoden zur Quantifizierung von Katecholaminen in biologischen Flüssigkeiten gehören Radioenzymic Assays10, Enzym-linked immun-sorbent Assays11, Voltammetrie12 und thermische Linse Spektrometrie13. Aber Mängel vorhanden sind, wie z. B. komplizierte Vorgänge und schwer zu erkennende mehrere Ziele. Heute ist die dominierende Analyseverfahren Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)14, gepaart mit sensiblen elektrochemische15 oder fluorimetrischen Erkennung16, wegen seiner hohen Empfindlichkeit und gute Selektivität. Mit Tandem-Massenspektrometrie Technologie, wie flüssige Chromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) und flüssige Chromatographie/Masse Spektrometrie/Massenspektrometrie (LC/MS/MS), die Analyse und Quantifizierung der Neurotransmitter erreichen hohe Genauigkeit und Spezifität17,18. Der MS-Technik erfordert jedoch teuer Instrumentierung sowie wesentlich qualifizierte Arbeitskräfte, erschwert die Methode allgemein in den meisten herkömmlichen Labors anzuwenden. HPLC-ECD-Systeme sind häufig in konventionellen und klinischen Laboratorien ausgestattet und haben somit eine gemeinsame und gute Wahl für Forschungsgruppen für chemische Bestimmung verwenden, aber sie erfordern die Probe eingeführt in das System sauber zu sein und der Microscale Volumen19. Daher ist es von großer Bedeutung, zu reinigen und die Probe vor der Analyse zu kondensieren. Die klassische Methode für den Reinigungsschritt ist flüssig-flüssig-Extraktion14,15,20 und off-line Festphasen-Extraktion, einschließlich aktivierte Tonerde Spalte21,22 und Diphenylborate (DPBA) Komplexierung23,24,25,26.

Myeongho Lee Et al. haben chemisch modifiziert mit Krone Äther als das Adsorbens Polymer-Harz verwendet, um selektiv Katecholamine aus menschlicher Urin seit 200727zu extrahieren. Auch in 2006 Haibo He Et Al. bewies eine einfache Synthese für Boronate Affinität Extraktion Sorbens Byutilizing ein functionalizable Nanomagnetische polyedrischen Oligomere Silsesquioxane (POSS) auf der Grundlage Nanomagnetische Composite und zur Bereicherung der Katecholamine in Anwendung menschlicher Urin (Noradrenalin, Adrenalin und Isoprenalin)28. Sie nutzte die Gelegenheit der Nanomaterialien, die Arbeit mit einer Technologie namens Nano-Elektrospinnen und bilden das Polymer Fasermaterial im Nanobereich zu erfüllen. Elektrospinnen Prozess kann der Durchmesser, die Morphologie und die räumliche Ausrichtung des Produktes anpassen, durch die Steuerung der Arbeitsspannung und Änderung des Inhalts der Spinnlösung zusammen mit anderen Parametern29. Im Vergleich mit der konventionellen SPE Patrone, Electrospun Nanofasern eignen sich hervorragend zu extrahieren und zu bereichern Ziel Analyten aus einer komplexen Matrix, da sie mit hoher Oberfläche-Bereich-zu-Volumen-Verhältnis ausgestattet sind, um die Analyten mit hohem Wirkungsgrad zu adsorbieren und weisen Sie mehr leicht kontrolliert Oberfläche chemische Eigenschaften auf, so dass praktische Befestigung der Ziel-Verbindungen. Diese Eigenschaften machen sie gute Möglichkeiten für SPE Adsorbentien, reduziert die feste Phase und Desorption Lösungsmittel Betrag30,31,32,33. Für Katecholamine in Urinproben wurden Electrospun Nanofasern bestehend aus Apolymeric Krone Äther mit Polystyrol (PCE-PS) verwendet, um gezielt drei Katecholamine ("NE", "E" und "DA")34extrahieren. Das Papier darauf hingewiesen, dass die selektive Krone Äther die Ziele von NE, E, und DA, basierend auf seine korrekte Geometrie zum Binden von Katecholaminen adsorbiert über Wasserstoffbrückenbindungen bilden. Die Ergebnisse angezeigt den materiellen Krone Äther effektiv entfernen andere störenden Verbindungen enthalten in biologischen Proben. Inspiriert von diesem Bericht, wurde eine neuartige Methode für den selektiven Abbau der Katecholamine durch Verwendung von Electrospun zusammengesetzte Nanofasern bestehend aus PCE-PS entwickelt

In diesem Papier berichtet die Methode bisher34 wurde verbessert und beschäftigt nicht nur um E, NE, und DA, sondern auch deren Metaboliten, MHPG und DOPAC, im Urin erfolgreich analysieren. Auch Möglichkeiten neue für den Mechanismus der Adsorption-Prozess. Die Methode zeigt befriedigende Extraktionseffizienz und Selektivität für die fünf Analyten, und die Methode wurde in der Analyse des Urins von risikoreichen Säuglinge mit perinatalen Hirnschäden und gesunden Kontrollen überprüft.

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Protokoll

Einwilligung der Eltern war, und institutionelle Review Board Genehmigung wurde für die Studie. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Code of Ethics der World Medical Association (Declaration of Helsinki) für Experimente mit Menschen durchgeführt. Pflegende Angehörige von allen Teilnehmern zur Verfügung gestellt schriftliche Zustimmung für sein in die Studie aufgenommen. Ethikkommission Genehmigung von Zhongda Krankenhaus, affiliate mit Southeast University, wurde auch gewonnen.

1. Vorbereitung der Spalten und Lösungen für die Extraktion und Bestimmung der Katecholamine benötigt

  1. Bereiten Sie die PFSPE-Spalte. Unterteilen Sie 1-2 mg von PCE-PS Nanofasern in 5-6 Aliquote, und verwenden Sie einen feinen Stahldraht mit 0,5 mm Durchmesser zu, um sie ordentlich in das Ende einer Pipettenspitze mit einem Volumen von 200 µL komprimieren.
  2. Bereiten Sie die künstliche Urin durch Wägung 2,427 g Harnstoff, Harnsäure 0,034 g, 0,09 g Kreatinin, 0,297 g Trinatrium Citrat, 0,634 g Natrium-Chlorid, 0,45 g Kaliumchlorid, 0,161 g Ammoniumchlorid, 0,089 g Calciumchlorid-Dihydrat, 0,1 g Magnesiumsulfat Heptahydrat, 0,034 g Natriumbicarbonat 0,003 g Natrium Oxalat, 0,258 g Natriumsulfat, 0,1 g Natrium Dihydrogen Phosphat und 0,011 g Binatrium Wasserstoff Phosphat und lösen sich die oben genannten Chemikalien in 200 mL entionisiertem Wasser.
  3. Bereiten Sie 2 mg/mL Stammlösung der Diphenylborate (DPBA) Lösung durch 2 mg der Verbindung in 1 mL destilliertem Wasser auflösen. Speichern Sie die Lösung im Dunkeln bei 4 ° C.
  4. Analyten standard
    Hinweis: Die chemische Struktur und Eigenschaften von Katecholaminen sind instabil, und sie leicht zersetzen. Der Ausarbeitung der Normen muss sehr schnell sein und muss direkte Sonneneinstrahlung vermeiden.
    1. Wiegen Sie 1,0 mg NE, E, DA, MHPG, DOPAC und internen standard 3,4-Dihydroxybenzylamine Hydrobromide DHBA in separate 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Die DHBA-Lösung in Wasser bis 100 ng/mL vor Gebrauch zu verdünnen.
    2. Schwingen Sie den vorbereiteten Standards in der Dunkelheit mit hoher Geschwindigkeit, bis Analyten vollständig auflösen. Dies ist der primäre bestand; Lagerung bei-20 ° C bis zu mehreren Wochen.
    3. Bereiten Sie die sekundäre 1.000 ng/mL Analyten Bestände. NE, E, DA, DOPAC und MHPG 5 µL der einzelnen primären Analyten Aktien in 4.975 µL destilliertes Wasser in eine 5 mL Zentrifugenröhrchen übertragen und bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 ° C lagern. Diese Lösungen täglich frisch zubereiten. Für DHBA 5 µL des primären Lager in 4.995 µL destilliertes Wasser in eine 5 mL Zentrifugenröhrchen, und speichern Sie es im Dunkeln separat bei 4 ° C.
    4. Weitere Verdünnungen mit dem sekundären Analyten bestand erstelle ich eine Standardkurve machen (zB., ergänzende Tabelle 2). Lösungen im Dunkeln bei 4 ° C lagern und täglich frisch zubereiten.
    5. Testen Sie die optimale Spannung des ECD-Detektors mit standard Lager mit richtige Konzentration. Variieren Sie die Spannung um einen Wert zu ermitteln, wo die Analyten haben das beste Spitze aussehen.
  5. Laufmittel enthält 30 % Phosphorsäure, 15 % Acetonitril, vorbereiten und 55 % destilliertem Wasser. Verwenden Sie für 10 mL des Lösungsmittels Laufmittel 5,5 mL destilliertes Wasser zu, und fügen Sie 1,5 mL Acetonitril und 3 mL Phosphorsäure tropfenweise ins Wasser.

2. Vorbereitung des realen Urinproben und mobilen Phase

  1. Haben Sie Mütter, die den ersten Morgenurin ihre Säuglinge mit aseptischen Urin Cups sammeln. Übertragen Sie die Proben sofort in Polypropylenröhrchen und Label. Speichern Sie dann die Proben in einem Gefrierschrank-20 ° C.
  2. Wirbel und Zentrifuge Urin Proben bei 1.510 x g für 10 min bei Zimmer-Temperatur (RT) get rid of die meisten Partikel Störungen. Das Sediment zu verwerfen und die Überstände für weitere Experimente zu sammeln. Um effektiv Analyten zu extrahieren, gehen Sie zu PFSPE Vorbehandlung (Schritt 3) sofort nach dem Zentrifugieren.
  3. Vorbereiten der mobilen phase
    1. Bereiten Sie eine saubere Flasche, mindestens 1 L. Die Zusammensetzung der mobilen Phase ist im ergänzenden Tabelle1aufgeführt; für 1 L mobile Phase, Maßnahme 6,7242 g Zitronensäure, 93,06 mg Ethylen Diamin Tetra Acetic Acid (EDTA) Binatrium Salz, 7,02 g monometallic Natrium Orthophosphat, Hydrat 404,5 mg 1-Heptanesulfonic-saures Natriumsalz und 3,5 g Natrium in die Flasche. Fügen Sie 40 mL Acetonitril und destilliertes Wasser bis 1.000 mL. Schütteln Sie und vibrieren Sie Ultraschall für 15 min, bis die Angelegenheit in der Lösung alle aufgelöst ist.
    2. Mit dem pH-Meter mit einer Glaselektrode, der mobilen Phase auf 4.21 mit einer gesättigten Natriumhydroxid-Lösung einen pH-Wert einstellen.
    3. Filtern Sie die mobile Phase mit einer 0,45 µm Polyvinylidene Fluorid mikroporösen Membran und eine Vakuumsauganlage get rid of Verunreinigungen.
    4. Verwenden Sie Ultraschallschwingungen für 15 min zu entgasen die mobile Phase jedes Mal vor dem Gebrauch.

3. PFSPE-Extraktion und HPLC-Analytik

  1. Die Nanofasern zu aktivieren. Drücken Sie 100 µL von Methanol und 100 µL Wasser nacheinander durch die PFSPE-Spalte mit einer 5 mL Spritze langsam und tropfenweise.
  2. Mix 100 µL Urin Probe mit 100 µL 2 mg/ml DPBA Lösung und 30 µL 100 ng/ml DHBA-Lösung (IS, interner Standard) in einem Rohr 0,5 mL EP, dann übertragen die gemischte Lösung auf die PFSPE-Spalte. Drücken Sie die Mischprobe Lösung durch die PFSPE-Spalte mit einer gasdichten Plastik Spritze 5 mL mit der Kraft des Luftdrucks.
  3. Auslaugen der Spalte dreimal 100 µL der DPBA Lösung (2 mg/mL) in der SPE-Spalte geladen, und drücken Sie die Lösung langsam durch die Patrone mit Luftdruck mit einer gasdichten Kunststoff 5 mL-Spritze.
  4. Laden Sie 50 µL Fließmittel auf der PFSPE-Spalte, und schieben Sie es durch die Spalte, das Eluat mit einem Schlauch 0,5 mL EP sammeln.
  5. Schalten Sie die HLPC Degasser zu entgasen die Luft im System. Vor der Analyseergebnisse läuft das System länger als 0,5 h mit der mobilen Phase zu equilibrate und Grundlinie Bildrauschen zu reduzieren. Siehe zusätzliche Tabelle1 zeigt die Setup-Parameter von der HPLC-Anlage.
  6. Probieren Sie 20 µL das Eluat mit ein automatischer Probenehmer und dann in das HPLC-ECD-System zu injizieren.
  7. Wenn die Läufe abgeschlossen sind, schalten Sie die Detektorzelle mit dem Detektor-Schnittstelle. Schalten Sie die Zelle mit dem Schalter auf der Rückseite der Detektor nicht da das Gerät dadurch beschädigt werden könnte.
  8. Ändern Sie manuell die Zusammensetzung der mobilen Phase in 10 % Methanol und 90 % Wasser. Für mindestens 30 Minuten laufen. Ändern Sie dann manuell die mobile Phase in Methanol HPLC-Klasse. Führen Sie für ca. 15 min zum Schutz des Systems in Methanol. Führen Sie diesen Schritt nach der empfohlenen Laufzeit kann zu Schäden an der Spalte und der Detektor Nichtbeachtung. Schalten Sie den Fluss, dann schalten Sie die Degasser.

(4) Phenylboronic Säure Patronen (PBA) Extraktion

PBA Patrone Extraktionsverfahren waren ähnlich wie die Regelung in Kumar Et Al. (2011) 25. alle Lösungen mit Luftkühlung mittels einer Spritze durch die PBA-Patrone (100 mg, 1 mL) geschoben.

  1. Zustand der Patrone mit 1 mL 80: 20 Acetonitril-Wasser (V/V) mit 1 % Ameisensäure und 1 mL 50 mM Phosphatpuffer (pH 10) gegenüber dem Vorquartal.
  2. Drücken Sie die gepufferten Urinprobe (1 mL Urin und 2 mL Phosphatpuffer, pH 8,5) durch die PBA-Patrone.
  3. Waschen Sie die Patrone mit 1 mL 50: 50 V/V Acetonitril-Phosphat-Puffer (10 mM, pH 8,5).
  4. Eluieren Sie die Patrone mit 1 mL Acetonitril-Wasser (80: 20 V/V) mit 1 % Ameisensäure.

5. Identifizierung und Quantifizierung der Katecholamine

  1. Linearität
    1. Verdünnen Sie die sekundäre Analyten Aktie mit künstlichem Urin zu sechs Konzentrationen (1,5, 3, 12, 25, 50 und 100 ng/mL); die Verdünnung Volumen von künstlichem Urin folgt ergänzenden Tabelle 2. Bilden Sie drei parallele Proben mit jeder Konzentration, 18 Analyten experimentelle Lösungen für den Bau von Kalibrierkurven.
    2. DHBA sekundäre Lager mit künstlichem Urin 10-fach um 100 ng/mL experimentelle Lösung zu verdünnen.
    3. Die Analyt-Lösungen von 5.1.1, nach Schritt 3 (PFSPE Extraktionsverfahren) vorbehandeln. Wie in Schritt 3 20 µL jeder entsprechenden Eluat in das HPLC-ECD-System eine HPLC-Chromatogramm zu injizieren.
    4. Kalibrierkurven der fünf Analyten durch Plotten das Verhältnis der Peakfläche (Ziele/IS) als die y-Achse gegen das Verhältnis der Konzentrationen zu konstruieren (Ziele/IS) als der X-Achse, wie in ergänzende Abbildung1dargestellt.
  2. LOD und LOQ Wert für die Empfindlichkeit
    1. Injizieren Sie 20 µL leer künstliche Urin in das HPLC-ECD-System (siehe Schritt 3), um die HPLC-Chromatogramm der Probe zu erhalten.
    2. Das Chromatogramm von 5.2.1 sammeln Sie 11 leer Signalwerte und berechnen Sie den Mittelwert Xb und Standardabweichung Sb. Berechnen Sie das minimale Signal einer Substanz, die auf ein gewisses Maß an Vertrauen, XL, erkannt werden können als XL = Xb+ K * Sb (K ist der Koeffizient von Konfidenzniveau bestimmt, Sb spiegelt Geräuschpegel von der Messmethode und der Geräuschpegel der Maschine). So, LOD = (X-L-X-b) / s = (K * Sb) / s (S steht für den Wert der Steigung der Kurve arbeiten).
    3. Definieren Sie ein S/N von 3:1 (K = 3) als der Nachweisgrenze (LOD) und eine S/N von 10:1 (K = 10) als die Grenze der Quantifizierung (LOQ).
  3. Die Rückforderungen zu bewerten
    1. Real und Spike Urinproben vorbereiten. Verdünnen Sie die sekundäre Analyten Aktie mit echten Urin drei Konzentrationen (5, 50, 100 ng/mL) um den Spike Urinproben zu erhalten. Drei parallele Proben für jeden Analyten Lösung vorbereiten. Zählen Sie die Spike Konzentration als die Menge der Ziel-Verbindungen in die Urinprobe gespickt. Definieren Sie diesen Wert als eines.
    2. Verdünnen Sie DHBA Lager bis 100 ng/mL, wie in Schritt 5.1.2.
    3. Verarbeiten Sie jede Probenlösung von 5.3.1 nach Schritt 3 (PFSPE Extraktionsverfahren) zu und injizieren Sie die 20 µL jedes entsprechende Fließmittel in das HPLC-ECD-System das Chromatogramm Resultat zu erzielen. Der Wert des Analyten wird als Menge von Ziel-Verbindungen in der Spike Urinprobe quantifiziert gezählt werden. Definieren Sie diesen Wert als eint.
    4. Injizieren Sie 20 µL Urin Probe in das HPLC-ECD (wie in Schritt 3) System das Chromatogramm Resultat zu erzielen. Der Wert des Analyten wird als eine Ausgangsmenge Ziel Verbindungen im Urin quantifiziert gezählt. Definieren Sie diesen Wert als einich.
    5. Berechnen Sie die Menge der Ziel-Verbindungen in den Proben aus der Standardkurve Gleichung. Die Prozentsatz Erholung wird als methodische Verwertung % geschätzt (A-t - Aich) = × 100 / (s). Mittelwerte sind in Tabelle 1dargestellt.
  4. Die Ungenauigkeit zu bewerten
    1. Spike künstliche Urinproben zu 5, 50 und 100 ng/mL Konzentrationen wie in Schritt 5.3.1 vorzubereiten. Sechs parallele Proben für jeden Analyten Lösung vorbereiten. Jeden Tag frische experimentellen Proben vorbereiten.
    2. DHBA Lager, wie in Schritt 5.1.2 100 ng/mL zu verdünnen.
    3. Die Intraday-Genauigkeit bewerten (n = 6). Jede Probenlösung in 5.4.1 nach Schritt 3 verarbeiten und 20 µL jeder Korrespondent Laufmittel in der HPLC-ECD-System das Chromatogramm zu injizieren. Den gleichen Vorgang sechs Mal an einem Tag zu tun.
    4. Berechnen Sie die Menge der Ziel-Verbindungen in den Proben aus der Standardkurve Gleichung. Unter der gleichen Konzentration von der gleichen Verbindung wird die relative Standardabweichung (RSD) sechs Tests an einem Tag als Intraday-Präzision bestimmt. Mittelwerte sind in Tabelle 1dargestellt.
    5. Die Inter Tage Genauigkeit bewerten (n = 6). Zur gleichen Zeit jeden Tag in den sechs sequenziellen Tagen bereiten Spike künstliche Urinproben für drei Konzentrationen von 5, 50, 100 ng/mL, wie in 5.4.1 und 5.4.2., und jeden Analyten Beispiellösung nach Schritt 3 zu verarbeiten.
    6. Die 20 µL jeder entsprechenden Eluat von 5.4.5 in das HPLC-ECD-System Chromatogramm Resultat jeden Tag zu injizieren. Berechnen Sie die Menge der Ziel-Verbindungen in den Proben aus der Standardkurve Gleichung. Inter Tag Präzision wird durch die RSD der Assays Menge von Spike künstliche Urinproben bei den drei Konzentrationen in sechs sequenziellen Tagen ausgedrückt. Mittelwerte sind in Tabelle 1dargestellt.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll ist eine einfache und bequeme PFSPE Methode zum Vorbehandeln Urinproben und bereichern fünf Katecholamine zur Erkennung über ein HPLC-ECD-System; eine Abbildung des Prozesses ist in Abbildung 1dargestellt. Das Protokoll enthält hauptsächlich vier Schritte aktivieren, laden, spülen, und eluting - gepaart mit einer kleinen Menge von PCE-PS Nanofasern und einem einfachen Festphasen-Extraktion-Gerät. Die Morphologie der PCE-PS Nanofasern wurde an...

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Diskussion

Die vorgeschlagene PFSPE-Methode in diesem Artikel möglicherweise erhebliche und aussagekräftig in Bezug auf seine Schnelligkeit, Einfachheit und Bequemlichkeit. Die Adsorbentien im Protokoll verwendet werden Electrospun Nanofasern, die hohe Oberfläche Bereich-zu-Volumen-Verhältnis und der Analyten mit hohem Wirkungsgrad zu adsorbieren. Die Prozedur nur braucht ein paar Milligramm Nanofaser und ein kleines Volumen des Lösungsmittels Fließmittel und erfordert keinen Verdunstung Schritt Analyten zu konzentrieren. Hier habe...

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Offenlegungen

Die Autoren bestätigen, dass es kein Interessenkonflikt mit jeder finanzielle Organisation bezüglich des Materials in diesem Artikel beschriebenen gibt.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt durch die National Science Foundation of China (No.81172720, Nr. 81673230), die soziale Entwicklung Forschung Programm der Jiangsu Provinz Wissenschaft und IT-Abteilung (Nr. BE2016741), Wissenschaft & Technologie-Projekt der China General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine (2015QK055), das geöffnete Projekt Programm der Key Laboratory der kindlichen Entwicklung und das Lernen des Ministeriums für Bildung, Wissenschaft Southeast University (CDLS-2016-04). Wir erkennen mit freundlichen Grüßen Yuan Song und Ping Liu, die uns in Proben Sammlung unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
200 & Mikro; L Pipettenspitzensäulezur Aufnahme von Nanofasern
PCE-PS Nanofasermaterialfür die PFSPE-Extraktion
Stahlstab (ca. 0,5 mm Durchmesser)Füllen Sie die Nanofasern in die
Säule gasdichte Kunststoffspritze (5 ml)Komprimieren Sie die Lösung in das Ende der Spitze
MethanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd67-56-1
Diphenylborinsäure-2-aminoethylester (DPBA)Sigma-Aldrich.IncA-106408Komplexreagenz
Noradrenalin (NE)Sigma-Aldrich.IncA-9512Analyt
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglykol (MHPG)Sigma-Aldrich.IncH1377Analyt
Adrenalin (E)Sigma-Aldrich.Inc100154-200503Analyt
3, 4- Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC)Sigma-Aldrich.IncD-9128Analyt
Dopamin (DA)Sigma-Aldrich.IncH-8502Analyt
3, 4-Dihydroxybenzylaminhydrobromid (DHBA)Sigma-Aldrich.Inc858781Innenetikett
AcetonitrilSigma-Aldrich.Inc75-05-8Eluriant und
Phosphorsäurein der mobilen PhaseSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7664-38-2Eluriant
HarnsäureSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd69-93-2künstliches Urinkreatinin
Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd60-27-5künstliches
Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd6132-04-3künstlicher Urin
KClSinopharm Chemisches ReagenzCo. , Ltd7447-40-7künstlicher Urin
NH4ClSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd12125-02-9künstlicher Urin
NaHCO3Sinopharm Chemical ReagenzCo., LtdSWC0140326künstlicher Urin
C2Na2O4Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd62-76-0künstlicher Urin
NaSO4Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd7757-82-6künstlicher Urin
DinatriumhydrogenphosphatSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10039-32-4künstlicher Urin
HarnstoffSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd57-13-6künstlicher Urin
NaClSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd7647-14-5künstlicher Urin
MgSO4.7H2OSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10034-99-8künstlich Urin
CaCl2Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd10035-04-8künstlicher Urin
HClSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd7647-01-0künstlicher Urin
ZitronensäureSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd77-92-9künstlicher Urin und mobile Phase
EDTA DinatriumsalzSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd34124-14-6mobile Phase
monometallisches NatriumorthophosphatSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd7558-80-7künstlicher Urin und mobile Phase
1-Heptansulfonsäure NatriumsalzSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd22767-50-6Phase
NatriumhydroxidSinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd1310-73-2mobile Phase
Phenylboronsäuresäule (PBA-Säule)Aglilent12102018PBA-Extraktion
Inertsil® ODS-3 5 & Mikro; m 4.6&fach; 150 mm SäuleDikma5020-06731HPLC-Säule zur Trennung
SHIMADZU SIL-20AC Prominenz AUTO SAMPLERShimadzu Corporation, JapanSIL-20ACAutoinjektion für Eluriant
SHIMADZU LC-20AD HochleistungsflüssigkeitschromatographieShimadzu Corporation, JapanLC-20ADHPLC-Pumpe
SHIMADZU L-ECD-60A elektrochemischer DetektorShimadzu Corporation, JapanL-ECD-60A-Detektorfür die Analyten
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry SystemMicromeritics, USAOberflächen- und Porositätsanalysator 
Urintrinatriumcitrat mobile

Referenzen

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