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Ein einfacher Ansatz, experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6 Mäusen für funktionale und neuropathologische Bewertungen zu induzieren

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DOI:

10.3791/56455

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9. November 2017

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1Department of Anatomy and Neuroscience, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Bericht beschreibt einen einfachen Ansatz, um erfolgreich experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) mit dem Myelin Protein zero (P0)180-199 Peptid in Kombination mit Freunds kompletten Adjuvans und Pertussis-Toxin zu induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine ausgereifte Paradigma in der Lage, präzise Bewertung des Ausmaßes der funktionelle Defizite und Neuropathologie, die in diesem EAN auftreten.

Zusammenfassung

Experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) ist ein gut geschätzt experimentellen Modell der autoimmunen peripheren demyelinisierenden Erkrankungen. EAN Krankheit wird induziert durch Immunisierung von Mäusen mit neurogenen Peptide, entzündlichen Angriff gegen Komponenten des peripheren Nervensystems (PNS) zu lenken. Die jüngsten Fortschritte konnten die Induktion von EAN in der relativ resistent C57BL/6-Maus-Linie mit Myelin Protein zero (P0)106-125 oder P0180-199 Peptide in adjuvante kombiniert mit der Injektion von Pertussis-Toxin geliefert. Die Fähigkeit, EAN induzieren in den Stamm C57BL/6 ermöglicht den Einsatz der zahlreichen genetische Werkzeuge, die auf diesem Hintergrund Maus vorhanden und ermöglicht so das anspruchsvolle Studium der Pathogenese der Krankheit und Vernehmung der mechanistischen Wirkung neuer Therapeutika in Kombination mit transgene Ansätze. In der vorliegenden Studie zeigen wir einen einfachen Ansatz, um erfolgreich EAN verwendet P0180-199 Peptid bei C57BL/6 Mäusen zu induzieren. Wir skizzieren auch ein Protokoll für die Beurteilung der funktionellen Defizite, die in diesem Modell, begleitet von einer Reihe von neuropathologische Funktionen auftreten. Somit ist dieses Modell ein leistungsfähiges experimentellen Modell die Pathogenese der menschlichen peripheren demyelinisierenden Neuropathien zu studieren und die Wirksamkeit der möglichen Therapien zu bestimmen, die darauf abzielen, Myelin-Reparatur zu schützen gegen Nervenschäden in autoimmune Neuritis.

Einleitung

Periphere Neuropathien kann entweder genetisch bedingt oder erworben, mit erworbenen Neuropathien haben entweder metabolische, ischämische, entzündliche oder giftige Fällungsmitteln. Diese Krankheiten sind auch sinnvoll als axonalen oder demyelinative Ursprungs eingestuft. Die häufigsten erworbenen demyelinisierenden periphere Neuropathien akuten entzündlichen demyelinisierenden Polyneuropathie (AIDP sind, auch bekannt als Guillain-Barré-Syndrom, GBS) und chronisch entzündlichen demyelinisierenden Polyneuropathie (CIDP)1, 2 , 3 , 4; Beide zeichnen sich pathogenetisch durch eine Autoimmunreaktion gegen die Myelinscheide, Demyelinisierung peripherer Nerven verursacht. Bei diesen Erkrankungen aktivierte T-Zellen der Blut-Nerven-Schranke und generieren eine Immunreaktion in der PNS. Aktivierung von Makrophagen innerhalb der Nerv dann verursacht Demyelinisierung entweder direkt über phagocytic Angriff, oder indirekt über freigesetzten Entzündungsmediatoren, was in klinischen Behinderungen wie Lähmungen und sensorische Dysfunktion5. Während demyelinated Axone die Fähigkeit behalten, Remyelinated nach Demyelinisierung, Remyelinisierung ist oft verzögert oder unvollständig, wodurch Anfälligkeit der nackten Axone zu irreversiblen Schäden, das ist die wesentliche Ursache für dauerhafte klinischen Behinderung. Derzeit wirksamsten Behandlungen sind immunmodulatorische, aber trotz ihrer Wirksamkeit in vielen Fällen die Erholung ist oft langsam und ~ 25 % der Patienten erleben residual funktionelle Defizite, die ihre Lebensqualität6deutlich zu reduzieren, 7.

EAN ist eine weit verbreitete Tiermodell der demyelinisierenden peripheren Neuropathie, der wertvolle Einblicke in die Pathogenese und ein Mittel zur Beurteilung neuartiger Therapeutika4zur Verfügung gestellt hat. Dieses Modell induziert werden kann in verschiedenen Arten wie Kaninchen, Ratten, Mäuse und Meerschweinchen, und wird durch Immunisierung mit neurogenen Antigene induziert. Hängt jedoch letztlich die erfolgreiche EAN Induktion eine entsprechende Immunantwort für Krankheit auftreten. Angesichts der Arten (und inter-Arten/Stamm) Variationen in Funktion des Immunsystems, wurden mehrere Kombinationen von Antigenen und Hilfsstoffe entwickelt, um erfolgreich EAN induzieren. In Bezug auf murinen genetische Werkzeuge ist der C57BL/6 die am weitesten verbreitete; Das traditionelle P2 Protein Peptid 57-81 (P257-81), die Krankheit in der anfälligen SJL Maus Belastung8 führt ist jedoch nicht in der Lage zu unerlaubten Pathogenese, funktionelle Defizite in der C57BL/6-Belastung führen. Glücklicherweise, Sensibilisierung Paradigmen mit P0106-125 oder P0180-199 Peptide, geliefert in adjuvante kombiniert mit der Injektion von Keuchhusten Toxin bewältigt diese Barriere, so dass genetische Spezialtools in genutzt werden die EAN Mausmodell.

Hier ist eine einfache Methode für die Induktion von EAN in den Mäusen C57BL/6 vorgestellt. Darüber hinaus erfolgt eine detaillierte Gesamtkonzept, um die funktionelle und neuropathologische Defizite, die mit der Krankheit assoziiert zu bewerten. Die P0180–199 Peptid9 wurde anstelle der P057-81 alternative10gewählt. Das P0180–199 Modell produzieren weniger schwere klinische Symptome im Vergleich zu den P057-81 alternative10beschrieben worden und dürfte daher die Einführung von potenziell zu widerstehen schädliche genetische Störungen, von chirurgischen Eingriffen (z. B. osmotischen Pumpe Implantation) erholen und Laufband Gangart Funktionsprüfung4zugänglich ist. Jedoch konnte das Laufband Gangart Funktionstests und histologischen Protokolle hier beschriebenen leicht angewendet werden, wenn die Krankheit in einer P057-81 induzierte Variante zu studieren.

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Protokoll

alle hier beschriebene Verfahren wurden von Florey Instituts für Neurowissenschaften und psychische Gesundheit (Melbourne Brain Zentrum)-Tier-Ethik-Kommission genehmigt und folgen Sie der australischen Code of Practice für die Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke.

1. EAN Induktion

Hinweis: EAN bei männlichen C57BL/6 Mäusen im Alter zwischen 6-8 Wochen erfolgreich induziert werden kann. Die Induktion-Protokoll dauert insgesamt 9 Tage. Tag 0 bezieht sich auf den Tag der ersten Immunisierung. Für dieses Protokoll Injektionen wurden unter Narkose durchgeführt (siehe Schritt unten 1.1.2).

  1. Am Tag-1:
    1. bereiten das Pertussis-Toxin (siehe Tabelle der Materialien) Lösung von 1,6 µg/mL mit der sterilen 0,1 M Maus-isotonische Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (MT-PBS).
    2. Anesthetization mit Isofluran:
        ,
      1. platzieren Sie den Mauszeiger (C57BL/6, Männlich, 6-8 Wochen) in der Anesthetization Kammer und passen Sie die Sauerstoffzufuhr auf 1 L/min
      2. Schalten Sie den Verdampfer Isoflurane, passen Sie es auf 2,5 % für Anesthetization, und den Monitor atmen und warten Sie 2 Minuten, oder bis primäre Reflexe (Hornhaut und hinteren Gliedmaßen) reagieren nicht mehr
    3. Entfernen Sie die Maus aus der Kammer Anesthetization und verwalten die obige Pertussis-Toxin-Lösung über eine intraperitoneale (i.p.) Injektion mit einer 0,5 mL Spritze mit einer Nadel 30 1/2 G 250 µL.
    4. Immunisierung der injizierbare Inokulum vorbereiten:
      1. Prepare Lösung A mit 2 mg/mL Lösung von P0 180-199 Peptid (mit > 98 % Reinheit, Sequenz S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) in 0,9 % Kochsalzlösung.
      2. Vorbereitung Lösung B mit 20 mg/mL Lösung von Mycobacterium Tuberculosis (siehe Tabelle der Materialien) in Freund ' s komplettes Adjuvans (FCA, bestehend aus: 15 % Mannide Monoolate + 85 % Paraffinöl und 0,5 mg/mL der ausgetrocknete getötet und getrockneten M Mycobacterium Butyricum).
      3. Zu das endgültige Inokulum zum Einspritzen, gleiches Volumen Teile Lösungen A und B in einem Wulst Schläger kombinieren und mischen Sie sie mit einer maximalen Geschwindigkeit für 1 min bei Raumtemperatur.
        Hinweis: Lösungen A und B können als Lager gehalten und bei 4 ° C für maximal einen Monat gelagert, sondern das kombinierte endgültige Inokulum muss frisch zubereitet werden, am Tag der Injektion Maus.
  2. An Tag 0, verwalten 50 µL des Inokulums (Vorbereitung in Schritt 1.1.4 beschrieben) in eine Maus über eine subkutane Injektion mit einer Nadel 23 G.
    Hinweis: Die Injektion kann platziert werden zwischen den Schulterblättern oder zwischen den hinteren Gliedmaßen und Rute über die Caudale Dorsum.
  3. On Tag1 machen die Pertussis-Toxin-Lösung von 1,2 µg/mL (in MT-PBS) und verwalten 250 µL in eine Maus über i.p.-Injektion mit einer 0,5 mL Spritze mit einer Nadel 30 1/2 G.
  4. Am 3. Tag, wiederholen Sie Schritt 1.3 oben.
    Hinweis: Lager-Lösungen A und B können aus und bei 4 ° c für maximal einen Monat gelagert werden. Allerdings muss das letzte injizierbare Inokulum, produziert durch die Kombination von Stammlösungen A und B, am Tag der Injektion erfolgen.
  5. Am 8. Tag verwalten 50 µL des Inokulums (Vorbereitung in Schritt 1.1.4 beschrieben) in eine Maus über eine subkutane Injektion (siehe Schritt 1.2 oben), an der gleichen Einstichstelle wie in Schritt 1.2 (für jedes Tier)

2. klinische Bewertung

  1. durchführen, klinische Bewertung, täglich ab am Tag 0.
  2. Geben jedem Mausklick eine Punktzahl von 0, 1, 2, 3 oder 4 nach den veröffentlichten Kriterien 4. Siehe Tabelle 1 für die EAN klinische Wertung.
    Hinweis: aus Gründen der Kohärenz eine Anstrengungen unternommen werden sollten Mäuse gleichzeitig Tor täglich von der gleichen Forscher.

3. Motor-Funktion Bewertung

Hinweis: die Motorleistung wird parallel mit klinischen erzielte bei der gleichen Altersgruppe Tiere bewertet. Der motorischen Funktion Bewertung Apparat muss an einen Computer angeschlossen werden, dass ein Gang-Funktion-imaging-System (siehe Tabelle der Materialien) installiert hat. Es wird auch empfohlen, dass alle Mäuse zu beurteilenden an die ausgeführte Aufgabe vor EAN Induktion gewöhnt werden sollten. Zu diesem Zweck werden Praxis läuft (2 Testläufe per Mausklick) drei Tage vor der Krankheit Induktion (Tag-3) durchgeführt.

  1. Zug auf das motorische Funktion Bewertung Gerät und schalten Sie die Lichttaste.
  2. Genick der Maus fest und Tinte seine Füße durch Absenken auf einen Behälter, gefüllt mit roter Tinte gedrückter Schwanzspitze.
    Hinweis: Dieser Schritt ist erforderlich für die C57BL/6-Belastung, aber kann übersprungen werden, wenn eine Maus-Sorte mit einem weißen Fellfarbe verwendet wird.
  3. Platzieren Sie den Mauszeiger in das Fach zu Fuß und stellen Sie die Laufband Geschwindigkeit 15 cm/s.
  4. Schalten Sie das Laufband und klicken Sie auf die " Rekord "-Taste, um die laufende Bewegung der Maus über die Gangart Funktion imaging-System zu erfassen (siehe Tabelle der Materialien).
  5. Verwenden Sie einen Zeitgeber und messen jedes Rennen um 36 s. Nach 36 s, Aufnahme beenden und Stop der Tretmühle.
    Hinweis: Mäuse, die erfolgreich ausgeführte Aufgabe für dieses 36 s-Intervall können nicht gelten als gescheitert zu sein.
  6. Speichern die video-Datei im Ordner "benannten".
  7. Wiederholen Sie die oben genannten Schritte für jede Maus beurteilt werden. Testen Sie die Mäuse mit der gleichen ausgeführte Aufgabe alle 3 Tage.
  8. Analysieren die bearbeiteten video-Dateien mit Software für Gang Funktionsparameter (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Die Details der Analyse verschiedener Motorparameter variieren unter Software also entnehmen Sie bitte den Hersteller ' s Anweisung vor der Analyse. Histologischen Nachweis der axonalen zu gewinnen und Myelinschäden entweder über Immunohistochemistry oder Elektronenmikroskopie, Tier Gewebe zu den Phase Motorik Abschlusstest je nach den spezifischen Zielen der Forschung eingenommen werden können.

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Ergebnisse

P0180-199 Peptid induzierten EAN C57BL/6 Mäusen führt zu eine monophasische Erkrankung mit klinischen Score Ausbruch aus 6 Tage nach ersten Immunisierung (dpi) und maximale Punktzahl Schweregrad von 25 dpi beobachtet wird gefolgt von einigen klinischen Ergebnis Verbesserung von 40 dpi Dauer (Abbildung 1)4,9. In Bezug auf die Gangart Funktion Mäuse beginnen zu versagen bei laufenden einfach ...

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Diskussion

Dieser Bericht beschreibt eine einfache Methode um EAN verwendet P0180-199 Peptid bei C57BL/6 Mäusen, so dass die Quantifizierung der wichtigsten neuropathologische und funktionelle Defizite bei Mäusen mit EAN induziert induzieren. DISTINCT zu dem hier beschriebenen EAN Induktion-Protokoll ist die Verwendung der Anästhesie während der Durchführung der Impfung-Injektionen. Die Verwendung von Isofluran-Narkose verbessert erheblich die Möglichkeit, sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen des Inokulums an der gewü...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte in Bezug auf diese Arbeit.

Danksagungen

DGG ist NHMRC Peter Doherty und Multiplesklerose Forschung Australien (MSRA) frühe Karriere Fellow. JLF wird unterstützt durch eine MSRA Postdoctoral Fellowship. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Australian National Health und Medical Research Council (NHMRC) Projekt #APP1058647 gewähren, JX.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C57BL/6, männlich, 6-8 Wochen altAustralian Bioresources Cenre, WA, Australien
Pertussis-Toxin-ListeBiological Laboratories, Inc., CA, USA#181
0,1 M Maus-isotonische phosphatierte gepufferte Kochsalzlösung (MT-PBS)Die Laboratorien haben ihr eigenes Protokoll.
IsofluranePharmachem, QLD, AustraliaLaboratories wird über ein eigenes Protokoll für die Verabreichung verfügen.
P0180– 199 PeptidWuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHNP0180– 199, Sequenz S– S– K– R– G– R– Fragen und Fragen; T– P– V– L– Y– A– M– L– D– H– S– R– S
Hitze tötete Mycobacterium tuberculosis (Stamm H37RA)Difco, MI, USA#231141
Freund's vollständiges Adjuvans (FCA)Difco, MI, USA#263910
16 % Paraformaldehyd (PFA)Elektronenmikroskopische Dienstleistungen#15710Verdünnen auf 4 % PFA am Tag der Gewebeentnahme.
25% GlutaraldheydProSciTech Pty Ltd, QLD, Australien#11-30-8Verdünnen auf 2,5% Glutaraldehyd am Tag der Fixierung.
NatriumazidChem-Supply Pty Ltd, SA, AustralienSL189Schaffung eines Lagerbestands von 10% (w/v) in 0,1 MIO. MT-PBS. Bei 0,03 % (v/v) verwenden.
SaccharoseChem-Supply Pty Ltd, SA, AustralienSA030Verwendung bei 30 % (w/v).
Optimale Schnitttemperatur (OKT) mittelSakura Finetek, CA, USA#4583
Normales EselsserumMerck Millipore, MA, USA#S30-100Verwendung als Antikörperverdünnungsmittel bei 10% (v/v) oder einer anderen Konzentration, die durch ein eigenes Labor bestimmt wurde.
Triton-X 100Sigma Aldrich, MI, USA#90o2-31-1Verwendung in Antikörperverdünnungsmitteln bei 0,3 % (v/v) oder einer anderen Konzentration, die durch ein eigenes Labor bestimmt wurde.
Kaninchen-Anti-Amyloid-Vorläuferprotein (APP)Invitrogen (Life Technologies), CA, USAS12700Wird bei 1:400 verwendet oder titriert im eigenen Labor.
Kaninchen Anti-Contactin-assoziiertes Protein-1 (Caspr)Geschenk von Prof. Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, IsraelVerwendet bei 1:500 oder titriert im eigenen Labor.
Geeignete Alexa Fluor konjugierte SekundärantikörperMolekulare Sonden (Life Technologies), OR, USAVerschiedeneVerwendung bei 1:200 oder titrieren im eigenen Labor. Die Wahl der Spezies, in der der Antikörper gezüchtet wurde, und der Wahl von Alexa Fluor liegt im Ermessen des jeweiligen Labors.
Wässrige EinbettlösungDako (Agilent), CA, USAJedes Labor hat seine eigenen Vorlieben.
NameUnternehmen<>Katalognummer<strong>Kommentare<
strong>Ausrüstung0,5
mL Spritze mit 301/2 g NadelnBD#326105
23 g NadelnBD#305143
Rotes StempelkissenJedes rote Stempelkissen oder jede rote Lebensmittelfarbe kann verwendet werden, um die Füße der Tiere zu markieren.
DigiGate-Geräte (einschließlich Laufband)eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging SystemeMouse Specifics Inc. Framingham, MA
StoppuhrEs kann ein beliebiger Timer verwendet werden.
DigiGait 8 SoftwareeMouse Specifics Inc. Framingham, MA
PräpariermikroskopZeissEs kann jedes geeignete Präpariermikroskop verwendet werden.
Aufgeladene ObjektträgerSuperfrost Plus, Lomb Scientific Pty LtdSF41296SP
CyrostatLeicaEs kann ein geeigneter Cyrostat verwendet werden.
Perfusionsgeräte und PräparierinstrumenteDie Labore werden über eigene Perfusionsprotoktole verfügen.
Undurchsichtige humifizierte KammerLabore können ihre eigenen mit einem undurchsichtigen Kunststoffbehälter herstellen.
PAP peneGeneTex (USA)Wachsstift oder Oberflächenspannung können auch verwendet werden, um eine Vertiefung um den Gewebeschnitt zu schaffen.
KonfokalmikroskopZeis LSM780Es kann jedes konfokale Mikroskop mit entsprechenden Laserlinien verwendet werden.
Fidschi/Image JNationale GesundheitsinstitutionenErhältlich ab www.fiji.sc
#S3023

Referenzen

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Schlagwörter

EAN ModellP0 180 199 Peptidsubkutane InjektionPertussis ToxinBeurteilung der MotorikLaufband GanganalyseDemyelinisierung des Nervus ischiadicusTransmissionselektronenmikroskopie

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