Dieser Bericht beschreibt einen einfachen Ansatz, um erfolgreich experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) mit dem Myelin Protein zero (P0)180-199 Peptid in Kombination mit Freunds kompletten Adjuvans und Pertussis-Toxin zu induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine ausgereifte Paradigma in der Lage, präzise Bewertung des Ausmaßes der funktionelle Defizite und Neuropathologie, die in diesem EAN auftreten.
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Methodenartikel
Ein einfacher Ansatz, experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6 Mäusen für funktionale und neuropathologische Bewertungen zu induzieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) ist ein gut geschätzt experimentellen Modell der autoimmunen peripheren demyelinisierenden Erkrankungen. EAN Krankheit wird induziert durch Immunisierung von Mäusen mit neurogenen Peptide, entzündlichen Angriff gegen Komponenten des peripheren Nervensystems (PNS) zu lenken. Die jüngsten Fortschritte konnten die Induktion von EAN in der relativ resistent C57BL/6-Maus-Linie mit Myelin Protein zero (P0)106-125 oder P0180-199 Peptide in adjuvante kombiniert mit der Injektion von Pertussis-Toxin geliefert. Die Fähigkeit, EAN induzieren in den Stamm C57BL/6 ermöglicht den Einsatz der zahlreichen genetische Werkzeuge, die auf diesem Hintergrund Maus vorhanden und ermöglicht so das anspruchsvolle Studium der Pathogenese der Krankheit und Vernehmung der mechanistischen Wirkung neuer Therapeutika in Kombination mit transgene Ansätze. In der vorliegenden Studie zeigen wir einen einfachen Ansatz, um erfolgreich EAN verwendet P0180-199 Peptid bei C57BL/6 Mäusen zu induzieren. Wir skizzieren auch ein Protokoll für die Beurteilung der funktionellen Defizite, die in diesem Modell, begleitet von einer Reihe von neuropathologische Funktionen auftreten. Somit ist dieses Modell ein leistungsfähiges experimentellen Modell die Pathogenese der menschlichen peripheren demyelinisierenden Neuropathien zu studieren und die Wirksamkeit der möglichen Therapien zu bestimmen, die darauf abzielen, Myelin-Reparatur zu schützen gegen Nervenschäden in autoimmune Neuritis.
Einleitung
Periphere Neuropathien kann entweder genetisch bedingt oder erworben, mit erworbenen Neuropathien haben entweder metabolische, ischämische, entzündliche oder giftige Fällungsmitteln. Diese Krankheiten sind auch sinnvoll als axonalen oder demyelinative Ursprungs eingestuft. Die häufigsten erworbenen demyelinisierenden periphere Neuropathien akuten entzündlichen demyelinisierenden Polyneuropathie (AIDP sind, auch bekannt als Guillain-Barré-Syndrom, GBS) und chronisch entzündlichen demyelinisierenden Polyneuropathie (CIDP)1, 2 , 3 , 4; Beide ze....
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Protokoll
alle hier beschriebene Verfahren wurden von Florey Instituts für Neurowissenschaften und psychische Gesundheit (Melbourne Brain Zentrum)-Tier-Ethik-Kommission genehmigt und folgen Sie der australischen Code of Practice für die Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke.
1. EAN Induktion
Hinweis: EAN bei männlichen C57BL/6 Mäusen im Alter zwischen 6-8 Wochen erfolgreich induziert werden kann. Die Induktion-Protokoll dauert insgesamt 9 Tage. Tag 0 bezieht sich auf den Tag der ersten Immunisierung. Für dieses Protokoll Injektionen wurden unter Narkose durchgeführt (siehe Schritt unten 1.1.2).
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Ergebnisse
P0180-199 Peptid induzierten EAN C57BL/6 Mäusen führt zu eine monophasische Erkrankung mit klinischen Score Ausbruch aus 6 Tage nach ersten Immunisierung (dpi) und maximale Punktzahl Schweregrad von 25 dpi beobachtet wird gefolgt von einigen klinischen Ergebnis Verbesserung von 40 dpi Dauer (Abbildung 1)4,9. In Bezug auf die Gangart Funktion Mäuse beginnen zu versagen bei laufenden einfach .......
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Diskussion
Dieser Bericht beschreibt eine einfache Methode um EAN verwendet P0180-199 Peptid bei C57BL/6 Mäusen, so dass die Quantifizierung der wichtigsten neuropathologische und funktionelle Defizite bei Mäusen mit EAN induziert induzieren. DISTINCT zu dem hier beschriebenen EAN Induktion-Protokoll ist die Verwendung der Anästhesie während der Durchführung der Impfung-Injektionen. Die Verwendung von Isofluran-Narkose verbessert erheblich die Möglichkeit, sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen des Inokulums an der gewü.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte in Bezug auf diese Arbeit.
Danksagungen
DGG ist NHMRC Peter Doherty und Multiplesklerose Forschung Australien (MSRA) frühe Karriere Fellow. JLF wird unterstützt durch eine MSRA Postdoctoral Fellowship. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Australian National Health und Medical Research Council (NHMRC) Projekt #APP1058647 gewähren, JX.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| C57BL/6, männlich, 6-8 Wochen alt | Australian Bioresources Cenre, WA, Australien | ||
| Pertussis-Toxin-Liste | Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0,1 M Maus-isotonische phosphatierte gepufferte Kochsalzlösung (MT-PBS) | Die Laboratorien haben ihr eigenes Protokoll. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories wird über ein eigenes Protokoll für die Verabreichung verfügen. | |
| P0180– 199 Peptid | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180– 199, Sequenz S– S– K– R– G– R– Fragen und Fragen; T– P– V– L– Y– A– M– L– D– H– S– R– S | |
| Hitze tötete Mycobacterium tuberculosis (Stamm H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's vollständiges Adjuvans (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16 % Paraformaldehyd (PFA) | Elektronenmikroskopische Dienstleistungen | #15710 | Verdünnen auf 4 % PFA am Tag der Gewebeentnahme. |
| 25% Glutaraldheyd | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australien | #11-30-8 | Verdünnen auf 2,5% Glutaraldehyd am Tag der Fixierung. |
| Natriumazid | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australien | SL189 | Schaffung eines Lagerbestands von 10% (w/v) in 0,1 MIO. MT-PBS. Bei 0,03 % (v/v) verwenden. |
| Saccharose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australien | SA030 | Verwendung bei 30 % (w/v). |
| Optimale Schnitttemperatur (OKT) mittel | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normales Eselsserum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Verwendung als Antikörperverdünnungsmittel bei 10% (v/v) oder einer anderen Konzentration, die durch ein eigenes Labor bestimmt wurde. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Verwendung in Antikörperverdünnungsmitteln bei 0,3 % (v/v) oder einer anderen Konzentration, die durch ein eigenes Labor bestimmt wurde. |
| Kaninchen-Anti-Amyloid-Vorläuferprotein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Wird bei 1:400 verwendet oder titriert im eigenen Labor. |
| Kaninchen Anti-Contactin-assoziiertes Protein-1 (Caspr) | Geschenk von Prof. Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Verwendet bei 1:500 oder titriert im eigenen Labor. | |
| Geeignete Alexa Fluor konjugierte Sekundärantikörper | Molekulare Sonden (Life Technologies), OR, USA | Verschiedene | Verwendung bei 1:200 oder titrieren im eigenen Labor. Die Wahl der Spezies, in der der Antikörper gezüchtet wurde, und der Wahl von Alexa Fluor liegt im Ermessen des jeweiligen Labors. |
| Wässrige Einbettlösung | Dako (Agilent), CA, USA | Jedes Labor hat seine eigenen Vorlieben. | |
| Name | Unternehmen | <>Katalognummer< | strong>Kommentare< |
| strong>Ausrüstung0,5 | |||
| mL Spritze mit 301/2 g Nadeln | BD | #326105 | |
| 23 g Nadeln | BD | #305143 | |
| Rotes Stempelkissen | Jedes rote Stempelkissen oder jede rote Lebensmittelfarbe kann verwendet werden, um die Füße der Tiere zu markieren. | ||
| DigiGate-Geräte (einschließlich Laufband) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stoppuhr | Es kann ein beliebiger Timer verwendet werden. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Präpariermikroskop | Zeiss | Es kann jedes geeignete Präpariermikroskop verwendet werden. | |
| Aufgeladene Objektträger | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Es kann ein geeigneter Cyrostat verwendet werden. | |
| Perfusionsgeräte und Präparierinstrumente | Die Labore werden über eigene Perfusionsprotoktole verfügen. | ||
| Undurchsichtige humifizierte Kammer | Labore können ihre eigenen mit einem undurchsichtigen Kunststoffbehälter herstellen. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wachsstift oder Oberflächenspannung können auch verwendet werden, um eine Vertiefung um den Gewebeschnitt zu schaffen. | |
| Konfokalmikroskop | Zeis LSM780 | Es kann jedes konfokale Mikroskop mit entsprechenden Laserlinien verwendet werden. | |
| Fidschi/Image J | Nationale Gesundheitsinstitutionen | Erhältlich ab www.fiji.sc |
Referenzen
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
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Nachdrucke und Genehmigungen
