Methodenartikel

Echtzeit-Atem-Analyse mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation mit hochauflösenden Massenspektrometrie gekoppelt

DOI:

10.3791/56465

⸱

9. März 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Mass Spectrometer and Atmospheric Environment, Jinan University, 2Guangdong Provincial Engineering Research Center for On-line Source Apportionment System of Air Pollution, 3School of Energy and Environment, City University of Hong Kong

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein Protokoll zur Charakterisierung der chemischen Zusammensetzung der Ausatmungsluft in Echtzeit mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation gekoppelt an hochauflösende Massenspektrometrie nachgewiesen wird.

Zusammenfassung

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Ausgeatmete flüchtige organische Verbindungen (VOC) haben großes Interesse geweckt, da sie als Biomarker für die Diagnose von Krankheiten und Exposition der Umwelt in eine nicht-invasive Weise dienen können. In dieser Arbeit präsentieren wir ein Protokoll zur Charakterisierung der ausgeatmeten VOC in Echtzeit mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation mit hochauflösenden Massenspektrometrie (Sec-NanoESI-HRMS) gekoppelt. Die hausgemachten Sec-NanoESI-Quelle wurde bereitwillig basierend auf einer kommerziellen NanoESI Quelle eingerichtet. Hunderte von Gipfeln im Hintergrund subtrahiert Massenspektren der Ausatmungsluft beobachtet wurden, und die Massengenauigkeit Werte -4.0-13,5 ppm und-20.3-1,3 ppm in den positiven und negativen Ionen-Erkennung Modi, beziehungsweise. Die Gipfel wurden mit präzise elementare Zusammensetzung nach der genauen Masse und Isotopen Muster zugewiesen. Weniger als 30 s dient zur Messung einer Ausatmung, und es dauert ca. 7 min. für sechs replizierten Messungen.

Einleitung

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Mit der schnellen Entwicklung der modernen analytischen Techniken wurden Hunderte von flüchtigen organischen Verbindungen (VOC) in der Ausatmungsluft1identifiziert. Diese flüchtigen organischen Verbindungen ergeben sich meist aus alveoläre Luft (~ 350 mL für einen gesunden Erwachsenen) und anatomischen Totraum Luft (~ 150 mL)2, die vom Körper Stoffwechsel3,4,5,6,7 betroffen sind ,8 und Umweltverschmutzung9, beziehungsweise. Infolgedessen wenn identifiziert, sind diese flüchtigen organischen Verbindungen vielversprechend als Biomarker für die Diagnose von Krankheiten und Exposition der Umwelt in eine nicht-invasive Weise verwendet werden.

Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) ist die am weitesten verbreitete Technik zur qualitativen und quantitativen Analyse der ausgeatmeten VOC2, haben direkte MS-Techniken, die für Echtzeit-Atem-Analyse entwickelt wurden, die Vorteile der hohe zeitliche Auflösung und einfache Pre-Probenvorbereitung. Direkte MS Techniken wie Proton Transfer Reaktion MS (PTR-MS)10, ausgewählte Ion Strömungsrohr MS (SIFT-MS)11, sekundäre Electrospray Ionisierung MS (SESI-MS)12,13 (auch benannt als mineralgewinnenden Elektrospray Ionisation MS, EESI-MS14,15), Spur atmosphärische Gas Analyzer (TAGA)16 und Plasma Ionisierung MS (PI-MS)17 wurden untersucht den letzten Jahren.

Unter den direkten MS-Techniken ist SESI bekannt als eine universelle weiche Ionisierung Technik19,20,21; und die Quelle ist leicht angepasst und mit verschiedenen Arten von Massenspektrometer, z.B., Time Flight Massenspektrometer8,15gekoppelt werden, Ionenfallen mass Spectrometer14 und Orbitrap Massenspektrometer12 ,18. Bis jetzt, SESI-MS erfolgreich eingesetzt bei der Diagnose von Erkrankungen der Atemwege22, zirkadianen Rhythmus3,6,23, Pharmakokinetik7,8, Messung und Stoffwechselwege4usw.offenbart. Vor kurzem ist eine kommerzielle SESI Quelle verfügbar geworden.

In dieser Studie wurde eine einfache und kompakte sekundäre Nanoelectrospray Ionisierung Quelle (Sec-NanoESI) eingerichtet und mit einem hochauflösenden Massenspektrometer gekoppelt. Echtzeit-Messungen der ausgeatmeten VOC in Atem wurden vorgestellt.

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Protokoll

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Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Bitte verwenden Sie geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, z.B., Kittel, Handschuhe, Schutzbrille, voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe).

1. richten Sie die Sec-NanoESI-Quelle

  1. Sec-NanoESI aufbauen nach dem SESI-Verfahren, d.h., das Atem Gas eingeführt, um eine Electrospray Plume schneiden und ionisiert durch die geladenen Tröpfchen (Abbildung 1). Die Quellen, gebaut in den einzelnen Labors abhängen an der Schnittstelle zwischen dem Massenspektrometer verwendet24,25. Hier richten Sie die Sec-NanoESI-Quelle, basierend auf einer kommerziellen NanoESI Quelle (Abbildung 2) und implementieren Sie, um ein Benchtop Quadrupol Orbitrap Massenspektrometer.
    Hinweis: Der Hauptteil der Quelle ist eine kubische Edelstahl-Kammer (Länge 25 mm, Innendurchmesser 13 mm) (Abb. 2 b) mit einem Einlass (I.D. 4 mm) in die Kammer die NanoESI Kapillare einzuführen. Die Kammer ist also nicht vollständig verschlossen (Abb. 2 b).
  2. Installieren Sie zwei Edelstahlrohre (O.D 5 mm, Länge 8 mm, I.D. 3 mm) auf jeder Seite der Kammer für Gas-Lieferung.
  3. Statten Sie zwei Quarz-Fenster (I.D. 14 mm) auf der Ober- und Unterseite der Kammer, die Position der Spitze des NanoESI Kapillare und NanoESI Spray mit Augen oder ein digitales Mikroskop zu überprüfen.
  4. Schweißen Sie die Kammer der Sweep-Kegel des Massenspektrometers.
    Hinweis: Das Design wechselt je nach bestimmten Geometrie der Atmosphärendruck Schnittstelle des Massenspektrometers in einzelnen Labors verwendet.

2. Instrument Optimierung

  1. Das Massenspektrometer in beiden positiven und negativen Ionen-Erkennung Modi nach Herstellerangaben zu kalibrieren. Durch die Anwendung Kalibrierung, werden Massenspektrometer Parameter, wie Objektiv Potenziale und Erkennung Bedingungen optimiert, um gute Empfindlichkeit und Peakform bei einem festgelegten Auflösungswert geben. Die Massenauflösung 70000 wird hier verwendet.
    1. Führen Sie vollständige Q Exactive Kalibrierungen mithilfe der kommerziellen ESI-Quelle; jedoch kann mit jedem kompatiblen Quellen, einschließlich kundenspezifische Masse Kalibrierung erfolgen.
  2. Stellen Sie die Temperatur der Ionen-Rohrweiche (ITT) die Massenspektrometer > 100 ° c. Obwohl die höchste Temperatur bei 350 ° C eingestellt werden kann, kann es die Zersetzung von einigen Verbindungen führen. 150 ° C ist somit in diesem Experiment verwendet.
    Hinweis: Für das Massenspektrometer mit einer Probenahme-Öffnung statt ITT, wird die Temperatur der Probenahme-Öffnung > 100 ° c eingestellt
  3. Wählen Sie für die ESI Lösungsmittel und Flow Rate das geeignete ESI Lösungsmittel auf der Grundlage der Eigenschaften des Lösungsmittels (z.B., Polarität und Volatilität) und gezielte Verbindungen (z.B. Proton Affinität). Eine Mischung aus Wasser und Methanol in verschiedenen Verhältnissen wurde allgemein als ESI Lösungsmittel25eingesetzt. In diesem Experiment verwenden Wasser mit 0,1 % (V/V) Ameisensäure, für hohe Ionisierung Effizienz wurde diese Lösungsmittel13,19,23gemeldet. Einstellen die Durchflussmenge des ESI Lösungsmittel im Bereich von 0-1,5 μl/min und 200 nL/min.
    Hinweis: Degas ESI Lösungsmittel für 30 min vor Gebrauch.
  4. Sec-NanoESI Quelle Parameter, vor allem NanoESI Spannung und Kapillare QuickInfo für NanoESI zu optimieren. Die Spannung häufig reicht von 2,0 bis 4,5 kV. Einsatz 2,5 kV hier.
    Hinweis: Höhere ESI Spannung anliegt als die Strömung erhöht. Der Abstand zwischen der Spitze und der Massenspektrometer-Öffnung ist von 1 bis 5 mm einstellbar. Nach der Optimierung sollte die normalisierten Intensitätsstufe (NL) in ein Massenspektrum beobachtet > 1 x 106 und die Variation der gesamten Ion Chromatogramm (TIC) soll < 10 % in beiden Modi positiven und negativen Ionen-Erkennung. Das Massenspektrum und TIC ergeben sich im Massenbereich von m/Z 50-750.
  5. Reines Gas auf die Quelle anwenden. Dies ist ein optionaler Schritt, mit dem Ziel zu verringern den Einfluss von flüchtigen organischen Verbindungen aus der Raumluft. Hochreine Stickstoff (N2, 99,99 %) oder reiner Luft eingesetzt werden. Mit der Anwesenheit von reinem Gas sollte die NL in ein Massenspektrum beobachtet > 1 x 105 und die Variation der TIC < 10 % in beiden positiven und negativen Ionen-Erkennung Modi werden sollte. Hochreine N2 ist hier verwendet und bei 0,8 L/min geliefert.
    Hinweis: Die insgesamt Strömungsgeschwindigkeit des reinen Gas- und Atem Gas sollte höher als der Volumenstrom durch die Öffnung des Massenspektrometers.

3. Messung der Ausatmungsluft

  1. Atmen Sie die Luft in Innenräumen und führen Sie einen normalen ausatmen, atmen Sie die Luft in der Lunge bei konstantem Volumenstrom. Überwachen Sie die Ausatmung Durchflussmenge durch ein Manometer oder ein Durchflussmesser für das Thema sichtbar. Verwenden Sie Teflon (PTFE) Schlauch, um der Atem Gas23zu liefern.
    1. Um die Kondensation von Wasserdampf im Inneren der Rohre zu vermeiden, erhitzen Sie das Rohr bei einer Temperatur von 80-100 oC7,23,27 oder verwenden Sie ein Nafion Trockner28,29. In diesem Experiment zum Thema ausgeatmet bei 0,4 L/min durch ein Durchflussmesser kontrolliert.
    2. Verbinden Sie den Einlass des Durchflussmessers auf einem Nafion Rohr (Länge 60 cm), der Wasserdampf in der Ausatmungsluft entfernen und schließen den Auslass des Durchflussmessers mit einem PTFE-Schläuche (Länge 13 cm, I.D. 4 mm). Es dauert < 30 s für eine Messung nach Ausatmung.
    3. Führen Sie 4-6 replizierten Messungen28,29.
    4. Um verwirrende Effekte zu minimieren, haben Sie Teilnehmer aus Essen, trinken und putzen ihre Zähne mindestens 30 min vor den Messungen23.
      Hinweis: Um den Einfluss von flüchtigen organischen Verbindungen aus der Raumluft zu minimieren, wurde es berichtet, reines Gas anstelle von Raumluft26zu inhalieren. Wenn ein Nafion-Schläuche verwendet wird, können einige polaren Verbindungen verloren gehen.
    5. Während der Messung immer mal übersteigt die Ionen-Intensität die linearen Nachweisgrenze des Instruments oder nicht. Die Sättigung des Signals führen zu einem Artefakt-Gipfel, die praktisch nicht aus der Siedlung in der Probe führt. Durch Einatmen durch die Nase, würde Teil des ambient VOC und Partikel entfernt werden; Es ist jedoch bemerkenswert, dass Verbindungen in die Nasengänge auch erkannt werden können.

(4) erhalten Sie ein Atem-Fingerabdruck und eine Zeit Spur einer Verbindung

  1. Erhalten Sie Chromatogramme und Massenspektren. Software (z. B. Xcalibur) Rekord Chromatogramme und Massenspektren zu verwenden. Denn dies direkte MS Analyse ist und keine chromatographische Trennung erfolgt, total Ion Chromatogramm (TIC) eigentlich die Zeit Spuren aller Signale, die in den Massenspektren erkannt zeigt und die extrahierten Ion Chromatogramm (EIC) die Zeit Spur zeigt ein angegebene Verbindung.
    Hinweis: Für andere kommerzielle Massenspektrometer der Chromatogramme und Massenspektren von der entsprechenden Datenerfassungs-Software erhalten.
  2. Erhalten Sie einen Fingerabdruck der Ausatmungsluft durch Auswahl einer Reihe von Scans in der TIC, wenn Ausatmungsluft gemessen wird. Erhalten Sie ein Massenspektrum, durchschnittlich diese Scans von der Software darstellt.
    1. Hintergrund-Gipfel aus dem Atem-Fingerabdruck zu beseitigen, verwenden Sie das Subtrahieren Hintergrund-Tool in der Software. Entnehmen Sie bitte der Bedienungsanleitung des Herstellers. Kurz gesagt, wählen Sie die gleiche Anzahl von Scans, wenn keine Atemprobe eingeführt wird, und subtrahieren Sie Hintergrund Massenspektrum aus dem Atem-Fingerabdruck.
      Hinweis: Bei dieser Methode ist die Schwelle, die Funktionen in der Atem-Fingerabdruck zu identifizieren als dreimal die Standardabweichung der das Hintergrundsignal definiert. Für andere kommerzielle Massenspektrometer kann Hintergrundabzug durch die entsprechenden Datenerfassungs-Software durchgeführt werden.
  3. Erhalten Sie eine Zeit Spur einer bestimmten Verbindung. Wählen Sie die Spitze einer gezielten Verbindung in den Atem Fingerabdruck und die Zeit, die Spur der Verbindung anschließend von der Software erworben wird.

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Ergebnisse

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Abbildung 3 zeigt die Atem-Fingerabdrücke im Massenbereich von m/Z 50-750 unter sowohl positive als auch negative Ionen-Erkennung-Modus aufgezeichnet. 291 Gipfel (Peak-Intensität > 5.0x104) und 173 Gipfel (Peak-Intensität > 3.0x104) wurden im Hintergrund subtrahiert Atem Fingerabdrücke in den positiven und negativen Ionen-Erkennung-Modi bzw. beobachtet. Um Spitzen in den Massenspektren zu identifizieren, siehe Vorveröffent...

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Diskussion

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Bau der Sec-NanoESI-Quelle basiert auf einer kommerziellen NanoESI-Quelle, ist die Ionisation Effizienz höher als bei der Verwendung einer ESI-Quelle-30. Darüber hinaus die Ionisation Effizienz wird weiter verbessert in einer geschlossenen Kammer, da es den Prozess isoliert aus der Luft ambient Hintergrund und zur gleichen Zeit erleichtert die Vermischung zwischen der Gasprobe und der Spray-Plume. Durch die Verwendung einer Sec-NanoESI, weniger Parameter optimiert werden müssen im Vergleich zu ein...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von National Natural Science Foundation of China (Nr. 91543117) finanziell unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ReinstwasserMerck Millipore, USAMPGP04001Resistance >18,2 MΩ · cm
AmeisensäureSigma-Aldrich, USAF0507Ätzend für die Atemwege.
StickstoffgasGuangzhou Shiyuan Gas Co. Ltd., ChinaN.A.a>Reinheit >99,99%
Q Exaktives Hybrid-Quadrupol-Orbitrap-MassenspektrometerThermo Scientific, USA02634L(S/N)Vorsicht vor Hochspannungs- und
Thermo Scientific, USAES002373(S/N); ES071(P/N)Vorsicht vor Hochspannungs- und
Thermo Scientific, USA5041.0010A(P/N)/
Xcalibur-Software (Version 3.0)Thermo Scientific, USABRE0008596/
Dino-Lite Digital MicroscopeTech Video System (SuZhou) Co.Ltd., ChinaCQ401833R(S/N)/
Nafion-SchläuchePerma Pure LLC, USAME60/
PTFE-Schlauch (I.D. 4 mm)Dongguan Hongfu Insulation Material Co. Ltd., ChinaN.A.Vorsicht vor dem möglichen Verlust polarer Verbindungen
MassendurchflussreglerLine-Tech, KoreaM15122007 (S / N)/
DurchflussmesserYuyao Industrial Automation Meter Factory, China40784/
a< / sup>N.A.: nicht verfügbar.
Hochtemperatur-NanoESI-QuelleHochtemperatur-Nano-LC-Pumpen

Referenzen

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Schlagwörter

Exhalierte fl chtige organische VerbindungenMassenspektrometrie KalibrierungIonentransferschlauchtemperaturESI L sungsmittelflussrateNano ESI SpannungsoptimierungAtemgaszufuhrsystemMessung der Massengenauigkeit

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