Anwendung des High-Speed-Höchstauflösung Geschwindigkeit Mikroskopie in Live primäre Zilie

Summary

Vor kurzem abgebildet wir die dreidimensionale (3D) räumlichen Positionen der Transportwege für verschiedene Proteine in primäre Zilien in lebenden Zellen translocating. Hier leben diese Papier-Details, die in der Versuchsanordnung, den Prozess der biologischen Proben und der Datenanalyse für die 3D Höchstauflösung Fluoreszenz imaging Ansatz neu angewendet primäre Zilien.

Abstract

Die primäre Zilie ist eine Vorwölbung Mikrotubuli-basierte auf der Oberfläche vieler eukaryotischer Zellen und enthält einer einzigartige Ergänzung der Proteine diese Funktion kritisch in Zelle Motilität und Signalisierung. Da Zilien nicht in der Lage eigene Protein zu synthetisieren sind, müssen fast 200 einzigartige ciliary Proteine zwischen dem Cytosol und primäre Zilien verschleppt werden. Es ist jedoch immer noch eine technische Herausforderung für dreidimensionale (3D) Standorte der Transportwege für diese Proteine in live primäre Zilien aufgrund der Einschränkungen der derzeit bestehenden Karte Techniken. Um die Herausforderung zu erobern, haben vor kurzem wir entwickelt und beschäftigt eine High-Speed-virtuelle 3D Höchstauflösung Mikroskopie, Einpunkt-Kante-Erregung Sub Beugung (Geschwindigkeit) Mikroskopie, um festzustellen, die 3D räumliche Lage der Transportwege für bezeichnet Beide cytosolischen und Membranproteine in primäre Zilien von lebenden Zellen. In diesem Artikel zeigen wir die detaillierte Setup SPEED-Mikroskopie, die Vorbereitung der Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-Protein-Label ciliary Proteine, die Echtzeitverfolgung der Einzelmolekül-einzelne Proteine in live Zilie und die Erreichung Karten 3D räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte der Transportwege für ciliary Proteine.

Introduction

Da Ernst Abbe im Jahre 1873 erklärte, hat die Auflösung der konventionellen Lichtmikroskopie angenommen wurde, beschränkt sich auf etwa 200 nm durch Lichtbeugung aus dem Ziel^1,2. Derzeit Höchstauflösung lichtmikroskopische Techniken brechen diese Einschränkung und ermöglicht die Erfassung von dynamischen Bildern mit Sub-Beugung (< 200 nm) Auflösung. Die Techniken in der Regel fallen in zwei Hauptkategorien: stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie-basierte Ansätze, die Sub-Beugung Beleuchtung Volumen durch nichtlineare optische Reaktion des Fluorophore Proben³; generieren und p....

Protocol

(1) NIH-3 t 3 Zelle Vorbereitung für Geschwindigkeit Mikroskopie ab Lager

1. 1,5 Wochen vor dem Experiment, Wiederherstellen einer frischen Kultur NIH-3 t 3 Zellen aus einem gefrorenen bestand bei 37 ° C Auftauen und die Zellen in einem 25 cm² Zelle Kultur Kolben mit 3 mL der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 110 mg/mL Natrium-Pyruvat, 2 mM Glutamin fötalen Rinderserum 10 % und 1 % Penicillin/Streptomycin.
2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einem 5 % CO₂ Inkubator.
3. Teilen von Zellen bei 80 % Konfluenz, etwa alle zwei Tage mindestens dreimal vor experimentellen am Tag, um Homogenität des Zellzyklus.....

Results

Dieser Abschnitt zeigt die Durchführung Geschwindigkeit Mikroskopie in der TZ primäre Zilien den Transportweg von SSTR3, verbunden durch ein ~ 15 nm externe Linker, Alexa647 studieren gewonnenen Daten(Abbildung 3). Es dient dem doppelten Zweck der Überprüfung des 3D-Transformation Algorithmus. Alexa647 sollten nur Label die Außenfläche der primäre Zilie und sich somit der 3D Transportweg High-Density Transportweg an dieser Stelle verraten sol.......

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Geschwindigkeit Mikroskopie auf die primäre Zilie, ein zellulärer Signalisierung Organell, das hoch effiziente Protein Transport abhängig ist. Geschwindigkeit-Mikroskopie kann hochauflösende (< 10 nm) für Gewebekulturen beschriftet Moleküle bieten Durchschreiten der Einzelpunkt-Beleuchtung auf die TZ zentriert. Zuvor ist angewendet worden, um das Protein des Menschenhandels durch die NPC-^6,7,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 cm2 Gewebekulturschale	Corning	VV-01936-00
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher	15140122
fötales Rinderserum	ThermoFisher	10438018
DMEM	ThermoFisher	10566-016
OPTIMEM	ThermoFisher	31985062
Trypsin	ThermoFisher	25300054
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich	P3813-1PAK
Transit LT1	Mirus	MIR 2300
35 mm Glasbodenschale	MatTek	P35GCOL-0-14-C
AlexaFluor 647-konjugiertes Streptavidin	ThermoFisher	S21374
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
633 nm He-Ne-Laser	Melles Griot	25-LHP-928-249
561 nm Festkörperlaser	Coherent	OBIS 561-50 LS
488 nm Festkörperlaser	Coherent	1185053
Inverses Fluoreszenzmikroskop	Olympus	IX81
1,4-NA 100- und 100-faches apochromatisches Ölimmersionsobjektiv	Olympus	UPLSAPO 100&mal;
On-Chip-Multiplikationsverstärkung Kamera für chargengekoppelte Geräte	Roper Scientific	Cascade 128+
dichroitischer Filter	Semrock	Di01- R405/488/561/635-25x36
Emissionsfilter	Semrock	NF01-405/488/561/635-25X5.0
Slidebook 6.0	Intelligent Imaging Innovations		digitale Mikroskopie-Software