Methodenartikel

Live Cell Fluoreszenzmikroskopie um wesentliche Vorgänge während der mikrobiellen Zellwachstum beobachten

DOI:

10.3791/56497

⸱

24. November 2017

 ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verständnis der Funktion der wesentlichen Prozesse in Bakterien ist eine Herausforderung. Fluoreszenz-Mikroskopie mit zielgruppenspezifischer Farbstoffe kann wichtige Einblicke in mikrobiellen Zelle Wachstum und Zellzyklus Fortschreiten geben. Hier wird Agrobacterium Tumefaciens als ein Modell-Bakterium verwendet, um Methoden für das live Cell Imaging zur Charakterisierung der wesentlichen Prozesse zu markieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zelluläre Kernprozesse wie DNA-Replikation und Segregation, Proteinsynthese, Zellwand-Biosynthese und Zellteilung verlassen sich auf die Funktion von Proteinen, die bakterielle überlebenswichtig sind. Eine Reihe von Farbstoffen gezielt kann verwendet werden, da diese Prozesse Sonden, um besser zu verstehen. Färbung mit lipophilen Farbstoffen ermöglicht die Beobachtung der Membran-Struktur, Visualisierung von Lipid Microdomains und Erkennung von Membran Blebs. Einsatz von Leuchtstoff-d-Aminosäuren (FDAAs), die Standorte der Peptidoglycan Biosynthese Sonde kann mögliche Mängel in Zellwand Biogenese oder Zelle Wachstum Musterung angeben. Nukleinsäure-Flecken können schließlich mögliche Defekte im DNA-Replikation oder Chromosom Segregation angeben. Cyanin DNA Flecken Label lebende Zellen und eignen sich für Zeitraffer-Mikroskopie ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen der Nucleoid Morphologie beim Zellwachstum. Protokolle für die Zelle Kennzeichnung können auf Protein Erschöpfung Mutanten, defekte Membran-Struktur, Zellwand Biogenese oder Chromosom Abtrennung zu identifizieren angewendet werden. Darüber hinaus kann Zeitraffer-Mikroskopie, morphologische Veränderungen zu überwachen, wie ein essentielles Protein entfernt und zusätzliche in Proteinfunktion Einblicke kann verwendet werden. Beispielsweise führt die Erschöpfung der wesentlichen Zellteilung Proteine Filamentierung oder Verzweigungen, die Erschöpfung der Zelle Wachstum Proteine Zellen kürzer oder runder werden verursachen. Hier sind Protokolle für Zellwachstum, Target-spezifische Kennzeichnung und Zeitraffer Mikroskopie bakterielle Pflanzen Pathogen Agrobacterium Tumefaciensvorgesehen. Zusammen ermöglichen gezielt Farbstoffe und Zeitraffer Mikroskopie Charakterisierung der wesentlichen Prozesse in A. Tumefaciens. Schließlich können die Protokolle zur Verfügung gestellt leicht geändert werden, um wichtige Prozesse in anderen Bakterien zu untersuchen.

Einleitung

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Fortschreiten durch die bakterielle Zelle Zyklus erfordert die Koordination vieler Prozesse einschließlich der Membran und Zellwand Biosynthese, DNA-Replikation und Segregation und Zellteilung. Um die Komplexität der bakteriellen Zelle Biologie zu verstehen, ist es notwendig, diese wesentliche Ereignisse zu studieren; Dies ist jedoch eine nicht-triviale Aufgabe, da Zellviabilität gefährdet ist, wenn wichtige Komponenten dieser Wege mutagenisierter werden. Epifluoreszenz Mikroskopie gepaart mit zielgruppenspezifischer Farbstoffe ist ein leistungsfähiger Ansatz, diese wesentlichen Prozesse in Wildtyp und Mutanten Bakterienstämme zu erforschen.

Peptidoglycan-spezifische Farbstoffe enthalten fluoreszierende Antibiotika (Vancomycin-FL, Bocillin-FL) und Leuchtstoff-d-Aminosäuren (z. B. 7-Hydroxycoumarin-3-carboxylic Acid-3-amino-d-Alanin, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-Alanin , NADA; Tetramethylrhodamine-3-amino-d-Alanin; TADA). In grampositiven Bakterien wurde die Verwendung von subletalen Konzentrationen von fluoreszierenden Antibiotika Analoga auf Seiten der Peptidoglycan Biosynthese Sonde eine wirksame Strategie zur Peptidoglycan einfügen Muster1,2zu offenbaren, 3,4. Während fluoreszierende Vancomycin Kennzeichnung verwendet wurde, um Einblicke in die Peptidoglycan einfügen Muster in festen Gram-negativen Bakterien5, bietet die äußere Membran in der Regel eine Durchlässigkeit Barriere, die verhindert, die Verwendung von Leuchtstofflampen dass Antibiotika als Sonde für Peptidoglycan Biosynthese in lebenden Zellen. Im Gegensatz dazu beschriften kurze Pulse von Leuchtstoff-d-Aminosäuren oder d-Aminosäuren mit Biorthogonal funktionellen Gruppen kovalent Regionen der jüngsten Peptidoglycan Insertion in einer Vielzahl von lebendigen Bakterienzellen6,7. Muster der Peptidoglycan Einfügung, die mit synthetischen d-Aminosäuren beobachtet gehören punctata und septal (Escherichia coli und Bacillus Subtilis), polar und septal (Agrobacterium Tumefaciens und Listeria Monocytogenes), septal nur (Staphylococcus Aureus) und apikal (Streptomyces Venezuelae)6,7. Diese Beobachtungen zeigen, dass Bakterien unterschiedliche Muster der Zellwand Biogenese weisen und die Verwendung von synthetischen d-Aminosäuren als Sonden für die Prüfung Wachstum Musterung eine sinnvolle Strategie in vielen Bakterien ist.

Farbstoffe, die bakterielle Chromosomen beschriften gehören der Desoxyribonukleinsäure (DNA) bestimmte kleinere Groove Binder (4,6-Diamidino-2-Phenylindole; DAPI) und hohe Affinität Cyanin-Farbstoffe (grün und Orange; siehe Materialliste). DAPI-Färbung der fixen Zellen hilft bei der Aufzählung der Bakterien aus Umweltproben8, wogegen DAPI-Färbung von lebenden Zellen verwendet wird, um bakterielle Lebensfähigkeit9anzugeben. Im Gegensatz dazu Farbstoffe Cyanin wie Orange und grün sind häufig beschrieben, wie impermeant "tote" Zelle Membrane Flecken, nicht lebensfähige Zellen9aufzulisten. Bemerkenswert ist, wenn diese Reagenzien verwendet werden, um die Morphologie der bakterielle Nucleoid während Zellwachstum Sonde, DAPI, Orange und grün alle erwiesen sich Membran permeationsfähigen und in der Lage, Kennzeichnung von lebenden Zellen10. In E. Coli Zellen Leben, DAPI-Färbung der DNA erscheint diffus durch Auto-Fluoreszenz von Zytoplasma und wiederholte Exposition des DAPI-gefärbten Zellen auf ultraviolettes (UV) Licht stört die Nucleoid Struktur10. Färbung E. Coli oder B. Subtilis mit Orange enthüllt, dass dieser Farbstoff Membran permeationsfähigen und lang anhaltende Fluoreszenz auf Bindung an DNA in lebenden Zellen bietet ohne Beeinträchtigung der Zelle Wachstum, DNA-Replikation oder Chromosom Abtrennung10 . Diese Beobachtungen legen nahe, dass Cyanin DNA-Farbstoffe verwendet werden können, um die Morphologie des ausgedehnt beim Zellwachstum in vielen Bakterien zu überwachen.

Phospholipid-specific Stryl Farbstoffe wie z. B. N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridiniumdichromat Dibromide (4-64; siehe Materialliste) sind kationische Verbindungen und ordnen Sie bevorzugt negativ geladen Phospholipide wie Cardiolipin und Phosphatidylglycerol11. Verschiedene Muster werden beobachtet, wenn 4-64 verwendet wird, um die Membran von verschiedenen Bakterien zu beschriften. In Escherichia coli4-64 ist in Polen, in Bändern entlang der Seitenwand angereichert und in den Geschäftsbereich des späten pre-divisional12Zellen. In Bacillus Subtilisermöglicht 4-64 Kennzeichnung die Visualisierung der Lipid Spiralen13. In Agrobacterium Tumefaciens4-64 Etiketten die äußere Membran und ist in einem charakteristischen "Hufeisen"-Muster, in der die Wachstumspol ist frei von14,15Kennzeichnung, beobachtet. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass diese Bakterien heterogene Lipid-Distributionen aufgrund des Vorhandenseins von Lipid-Domains zeigen die zellulare Asymmetrie beitragen. Änderungen 4-64 Kennzeichnung Muster wie zum Beispiel das Vorhandensein von diffusen Kennzeichnung kann Blebs oder Vesikel, Invaginations oder Membran Schrumpfung informativ sein bei der Charakterisierung von Mutanten, die Einfluss auf die Verteilung oder die Biosynthese von Lipiden.

Hinausgeht, Färbung Zellen, ist bestimmen die Funktion von Proteinen, die Teilnahme an essentielle Prozesse erforderlich. Die Charakterisierung der wesentlichen Proteine ist technisch anspruchsvoll, denn es nicht möglich ist, löschen Sie wesentlichen Gene und die phänotypischen Auswirkungen zu studieren. So entstanden alternative Ansätze, die zu einem des Proteins Abbau. Beispielsweise kann ein wesentliches gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoter, anstatt seine native Veranstalter gestellt werden. Induzierbare Promotoren sind empfänglich für kleine Moleküle wie z. B.; Zink-16, Isopropyl β-d-1-Thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, Arabinose22, vanillate17,23, und Xylose23, damit die Transkription des Zielgens aufhört und das Protein des Interesses ist leer, wenn der Induktor entfernt wird. Alternative Ansätze für abbauende wesentlich interessierenden Proteine enthalten synthetische Riboschalter24 welche kleine Molekül-RNA Interaktionen verwenden, um die Transkription von Zielgenen, CRISPR Einmischung25,26 behindern , Block-Transkription von Zielgenen und induzierbaren Protein Degradation27,28 die Peptid-Tags Zielproteine für den Abbau von ClpXP Protease verwendet. Erschöpfung Stämme bieten nur kurze Zeit für die Charakterisierung, bevor die Zellen Lebensfähigkeit verlieren, daher mikroskopische Bildgebung von Zellen im Laufe der Zeit während der Protein-Abbau ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Charakterisierung. In der Tat ermöglichte Mikroskopie lebender bakterielle Zellen Forscher Einblicke in grundlegende biologische Prozesse, einschließlich der Mechanismen der Zelle Form Wartung, Sekretion und Abschottung29.

A. Tumefaciens ist eine bakterielle Pflanzen Pathogen30 und natürlichen genetischen Ingenieur31,32. Also, auch Mechanismen im Zusammenhang mit Pathogenität, Wirt-Pathogen Interaktionen33,34,35, Sekretion36und Host Transformation30,31, 37 ausgiebig untersucht. Um Strategien zu entwerfen, die A. Tumefaciens vermittelten Krankheiten vorbeugen oder verbessern Pflanzentransformation, A. Tumefaciens überlebensnotwendig Prozesse besser verstanden werden müssen. Die Verwendung von Farbstoffen gezielt und die jüngste Entwicklung einer Protein-Abbau-Strategie für A. Tumefaciens18 bietet eine Möglichkeit, wichtige Prozesse zu untersuchen.

Hier werden ausführliche Protokolle für die mikroskopische Analyse der Wildtyp und Mutanten Protein Erschöpfung Stämme von A. Tumefaciens bereitgestellt. Die ersten beiden Protokolle wird beschrieben, wie Zellen vorbereiten und beschriften Sie sie mit gezielt Farbstoffe. Das dritte Protokoll bietet schrittweise Anleitungen für die Zubereitung von Agarose-Pads (Abbildung 1) und imaging die Bakterienzellen (Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4). Diese Protokolle möglicherweise auch geeignet für andere Bakterien mit zusätzlichen Anpassungen an verschiedene Medien Bedingungen, Wachstumsraten, Sauerstoff-Anforderungen und Zellstrukturen zu berücksichtigen.

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Protokoll

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1. Wachstum von A. Tumefaciens Stämme

  1. Kultivierung von A. Tumefaciens Stämme
    1. Verwenden Sie einen sterilen Holzen Stick oder Pipettieren Tipp impfen 1 mL ATGN Wachstumsmedien (siehe Materialliste für das Rezept) mit einer einzigen Kolonie der gewünschten Sorte.
      Hinweis: Für A. Tumefaciens Erschöpfung Stämme, sollte die ATGN 1 mM IPTG wie ein Induktor weiterhin Biosynthese von essentielles Protein enthalten.
    2. A. Tumefaciens Stämme über Nacht in ATGN bei 28 ° C mit Schütteln bei 225 u/min zu wachsen.
    3. Messung die optische Dichte der Zellen bei 600 nm (OD600) mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die Zellkultur auf einer OD600 = ~0.2 und weiter wachsen bis OD600 = ~0.6 erreicht ist. Für Erschöpfung Stämme weiter wachsen mit Induktor bis OD600 = ~0.6 erreicht ist.
    4. Verwenden Sie Wildtyp und Mutanten Stämme von A. Tumefaciens OD600 = ~0.6 für Target-spezifische Färbung und/oder Zeitraffer Mikroskopie (siehe § § 2 und 3.1). Für Erschöpfung Stämme Auswaschen der Induktor (siehe Abschnitt 1.2.)
  2. Entfernung der Induktor zur Charakterisierung von A. Tumefaciens Protein Erschöpfung Stämme
    1. Pellet-1 mL der exponentiellen Kultur (OD600 = ~0.4-0.6) durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min in einer Desktop-Zentrifuge bei Raumtemperatur.
    2. Zum Waschen entfernen überstand und das Pellet in frische Medien ohne Induktor Aufschwemmen und pellet die Zellen wie oben (1.2.1) beschrieben. Waschen Sie den Zellen insgesamt 3 Mal in den neuen Medien.
    3. Aufschwemmen der letzten Pellet in frische Medien und konzentrieren sich die Zellen eines OD600 = ~0.8 für sofortige Färbung mit Ziel bestimmte Farbstoffe (Abschnitt 2 und Abbildung 4 b-D) oder Time-Lapse-Mikroskopie (Abschnitt 3.2 und Abbildung 4a).) . Alternativ vorab zum Abbau der Zellen für die gewünschte Menge an Zeit durch den Anbau von der Zellen in den Medien ohne Induktor vor Fleckenbildung und Bildgebung der Zellen.

(2) Target-spezifische Färbung von A. Tumefaciens Zellen

  1. Fluoreszierende d-amino Acid Zellwand Kennzeichnung
    Hinweis: FDAAs sind ungiftig fluoreszierende d-Aminosäuren die ohne weiteres in die A. Tumefaciens Peptidoglycan integriert sind. Dieses einfache Kennzeichnung Verfahren Sonden Wachstum in lebenden Zellen6Musterung. Protokolle für die Synthese von vier FDAAs sind verfügbar38.
    1. Pellet-500 µL der exponentiellen Kultur (OD600 = ~0.4-0.6) durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min in einer Desktop-Zentrifuge. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 100 µL der neuen Medien.
    2. Fügen Sie 5 µL 5 mM FDAA, gewaschen und Zellen konzentriert und 2 min im Dunkeln inkubieren.
      Hinweis: Maximal FDAA Lichteinwirkung. Die Zeit der Inkubation wird die Wachstumsrate der Belastung abhängig. In der Regel sollte die Inkubationszeiten zwischen 5-10 % der Verdoppelung Mal6.
    3. Pellet-Zellen durch Zentrifugation und Zelle Pellets mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) dreimal waschen.
    4. Aufschwemmen Sie Pellet in ~ 50 µL PBS.
      Hinweis: Die Lautstärke des PBS zur Wiederfreisetzung variieren basierend auf Pellet-Größe.
    5. Anwenden von 0,8-1 µL Zellen zu einer Agarose-Pad und Bild mit Epifluoreszenz Mikroskopie sofort (siehe Abschnitte 3.1 und 3.2).
      1. Alternativ weitere stoppen Sie Label Aufnahme durch die Fixierung der Zellen mit eiskalten 70 % Ethanol. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL eiskaltes 70 % Ethanol und 15 Minuten auf dem Eis inkubieren.
      2. Zellen durch Zentrifugation zu sammeln und in einem kleinen Volumen der PBS für die Bildgebung zu einem späteren Zeitpunkt erneut. Zellsuspensionen bei 4 ° C und Bild innerhalb von 48 Stunden zu speichern.
  2. DNA-Färbung mit DAPI oder Orange Fleck
    Hinweis: Um DNA zu beobachten Struktur, Zellen mit DAPI oder Orange (tote Zelle Fleck) gekennzeichnet sind. Obwohl klassisch als einen "Toten Zelle Fleck" beschrieben, ist Orange permeationsfähigen, photostabil, und hat keinen Einfluss auf das Wachstum von Bakterienzellen, ermöglicht live-Cell DNA imaging-10. In A. Tumefaciensorangefarbene Kennzeichnung Werke auch in lebenden Zellen und eignet sich für Zeitraffer-Mikroskopie (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu, die ultraviolette (UV) Belichtung notwendig für bildgebende DAPI-gefärbten Zellen phototoxischen (Abbildung 3) und somit DAPI-Färbung eignet sich am besten zum Beizen von lebenden Zellen für sofortige imaging oder Färbung feste Zellen.
    1. DAPI-Färbung der Zellen
      1. Pellet-1 mL der exponentiellen Kultur (OD600 = ~0.4-0.6) durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min in einer Desktop-Zentrifuge.
      2. Optional, um Zellen vor der Färbung zu beheben, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL eiskaltes Ethanol 70 %. Inkubation auf Eis für 10-15 min. sammeln die Zellen durch Zentrifugation als 2.2.1.1 beschrieben.
      3. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL PBS mit 1 µL der Stammlösung DAPI (1 mg/mL; siehe Materialtabelle). Mischen von pipettieren und 5 Minuten im Dunkeln inkubieren.
      4. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min und in 1 mL PBS entfernen überschüssige DAPI aufzuwirbeln. Waschen der Zellen zwei weitere Male und das Pellet in 50 µL PBS oder Medien Aufschwemmen.
      5. Anwenden von 0,8-1 µL Zellen eine Agarose-Pad und Bild Epifluoreszenz Mikroskopie sofort verwenden. Siehe Abschnitte 3.1 und 3.2.
        Hinweis: Dieses Protokoll ist nicht optimal für Zeitraffer-Mikroskopie, Chromosom Dynamik (Abbildung 3) zu beobachten. Erwägen Sie Orange Färbung als Alternative (siehe Abschnitt 2.2.2).
    2. Orange Färbung von lebenden Zellen
    3. Pellet-1 mL der exponentiellen Kultur (OD600 = ~0.4-0.6) durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 min in einer Desktop-Zentrifuge. Aufschwemmen Zelle Pellet in 1 mL PBS mit 1 µL Orange-Stammlösung (siehe Materialliste). Mischen von pipettieren und 5 min im Dunkeln inkubieren.
    4. Pellet-Zellen durch Zentrifugation und Aufschwemmen in 1 mL PBS, überschüssige Orange zu entfernen. Waschen der Zellen zwei weitere Male und das Pellet in 50 µL PBS aufzuwirbeln.
    5. Anwenden von 0,8-1 µL Zellen eine Agarose-Pad und Bild Epifluoreszenz Mikroskopie sofort verwenden. Siehe Abschnitte 3.1 und 3.2.
      Hinweis: Dieses Protokoll funktioniert gut mit lebenden Zellen und eignet sich für Zeitraffer-Mikroskopie, Chromosom Dynamik (Abbildung 3) zu beobachten. Wenn es nicht sofort Bild passt, können Zellen in eiskalte 70 % igem Ethanol (siehe Abschnitt 2.2.1.2) behoben werden.
  3. Membran zu beschriften
    Hinweis: Die lipophilen Styryl Fluoreszenzfarbstoff 4-64 ist beträchtlich, die Membran der Bakterienzellen beobachten benutzt worden. Im Gegensatz zu vielen Bakterien 4-64 mit der Bezeichnung A. Tumefaciens Zellen nicht einheitlich zu kennzeichnen, aber recht häufig ein "Hufeisen" Muster14,15aufweisen. Bemerkenswert ist die Wachstumspol fast frei von Flecken, während der alte Pol intensiv gekennzeichnet ist. Somit ermöglicht 4-64 Visualisierung der Zelle Wachstumsmuster und Membran-Struktur in A. Tumefaciens.
    1. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 8 µg/mL in 1 mL der exponentiellen Phase Zellkultur FM 4-64 und 5 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Pellet-markierte Zellen durch Zentrifugation bei 7.000 x g für 5 Minuten in einer Desktop-Zentrifuge und Zelle Pellet in 1 mL PBS aufzuwirbeln. Waschen Sie den Zellen insgesamt dreimal, um überschüssige Farbe zu entfernen.
    3. Aufzuwirbeln Sie Zellen in einem kleinen Volumen der PBS und vor Ort auf eine Agarose-Pad, um sofort Bild. (Siehe Abschnitte 3.1 und 3.2)
      Achtung: Zellen müssen sofort abgebildet werden, um charakteristische Kennzeichnung Muster zu beobachten.

3. Darstellung der A. Tumefaciens Zellen

  1. Agarose-Pad-Vorbereitung
    Hinweis: Abbildung 1 enthält eine Bildsequenz (zentrale A) und Schaltplan (Gruppe B) eines typischen Agarose-Pads für Zeitraffer-Mikroskopie vorbereitet. Agarose-Pads sind in der Regel bereit, je nach Bedarf.
    1. 3.1.1 verwenden Sie ein Deckglas als Wegweiser und Schnitt eine 22 x 22 mm Quadrat des Labors mit einem Skalpell an den Rändern film (siehe Materialliste).
    2. Schneiden Sie ein Quadrat aus dem Zentrum des Labor-Films verlassen ~ 2-5 mm Grenze als eine Dichtung für die Agarose-Pad zu dienen. Verwerfen Sie den Center-Ausschnitt.
    3. Legen Sie die Film-Dichtung auf einen Objektträger (75 mm x 25 mm) mit Ammoniak und Alkohol Reiniger (siehe Materialliste) gereinigt und erhitzen, bis der Film auf Glas (obere Bild in Abbildung 1A) leicht geschmolzen ist. Labor Film schmelzen, benutzen Sie den Rand von einem Block Heatset auf 70 ° C oder über einer Flamme leicht schmelzen.
    4. Bereiten Sie Agarose-Lösung durch Mischen ~0.075 g Agarose (siehe Materialliste) in 5 mL Medien in eine kleine Flasche. Erhitzen Sie die Lösung in einer Mikrowelle mit periodischen Wirbeln zu mischen, bis die Agarose aufgelöst wird und die Lösung klar ist. Halten Sie die Agarose-Lösung bei 55-70 ° C und für den Bau von mehreren Agarose-Pads innerhalb von 48 Stunden.
    5. Pipette Medien mit 1,2 – 1,5 % Agarose in der Mitte der Dichtung.
      Hinweis: Die Lautstärke der Medien ist in der Regel 50-60 µL aber variiert je nach Größe der Dichtung. Hinzufügen von Medien zu einer kalten Folie die Agarose, vorschnell zu verfestigen verursachen können, sollte daher die Folie auf eine warme Oberfläche gehalten werden. Der Rand von einem Heizblock auf 70 ° C arbeiten gut eingestellt. Wasser-Agarose oder gepufferten Agarose Lösungen wie Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) können verwendet werden, anstelle von Medien, die Agarose für Anwendungen, in denen weitere Zellwachstum nicht erforderlich ist. Für imaging Erschöpfung Stämme, Induktor kann präsentieren oder abwesend in den Medien. Präsenz der Induktor kann als Kontrolle verwendet werden, während das Fehlen der Induktor den Erschöpfung Phänotyp offenbaren wird.
    6. Platzieren Sie ein Deckglas über die Dichtung um die Agarose gleichmäßig zu verteilen.
    7. Legen Sie die Folie auf einen kühlen Untergrund für ~ 2 min. vermeiden Übertrocknetes der Agarose Pad da dies eine runzlige Oberfläche auf die Agarose-Pad und Bündelung der Zellsuspension bei Anwendung auf der Oberfläche führt zu festigen.
    8. Schieben Sie vorsichtig das Deckglas aus dem Agarose-Pad.
      Achtung: Dieser Schritt keine Eile. Die Agarose-Pad kann leicht reißen und eine ungleichmäßige Agarose-Pad kann Bildgebung erschweren.
    9. Lassen Sie die Agarose-Pad an der Luft trocknen für 1 – 2 min. bei Raumtemperatur bis die Oberfläche des Pads trocken erscheint. Mit einem Skalpell entfernen Sie einen schmaler Streifen der Agarose erstelle ich ein Luftpolster (mittlere Bild, Abbildung 1A); das Luftpolster ist in der Regel ~ 2 x 7-10 mm und A. Tumefaciens Zellen sind in der Regel wachsen am besten in der Nähe der Atemhöhle (Abbildung 1).
      Hinweis: Für die Bildgebung der fixen Zellen oder unter Bedingungen, wo Wachstum nicht überwacht wird, ist ein Luftpolster nicht erforderlich.
    10. Spot 0,8-1 µL Zellen auf die Agarose-Pad und mit einem neuen Deckgläschen abdecken. Legen Sie das Deckglas vorsichtig über den oberen Teil der Agarose-Pad auf die Oberfläche des Pads Agarose Zellen verteilt.
    11. Seal die Ränder der das Deckglas mit geschmolzenen VALAP (siehe Materialtabelle für Rezept; Abbildung 1A, Bild unten). Entlang der Kanten und Ecken von dem Deckglas versiegeln können fehlschlägt Trocknung von der Agarose-Pad, die zu das Auseinanderdriften der Zellen während der Bildgebung führen wird. Hinweis: Abdichtung von das Deckglas ist nur für die langfristige Zeitraffer Bildgebung erforderlich.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Agarose Pad Vorbereitung. (A) Bild-Sequenz des Protokolls Agarose Pad Vorbereitung. Bild 1 ist eine Folie mit der Labor-Film-Dichtung. In Abbildung 2 sind die Agarose-Pad und Atemhöhle visualisiert. Zu guter Letzt Bild 3 zeigt die komplette Agarose-Pad mit den Zellen unter einem Deckglas und mit VALAP versiegelt. (B) eine schematische Darstellung einer Agarose-Pad für Zeitraffer-Mikroskopie steht zur Verfügung. Hauptmerkmale des Agarose-Pads sind im Schaltplan gekennzeichnet. (C) die Atemhöhle förderte Wachstum von A. Tumefaciens auf Agarose-Pads. Gezeigt werden Bilder der Wildtyp A. Tumefaciens Zellen gewachsen auf einem Agarose-Pad für 20 Stunden. Bilder wurden an Positionen immer weit entfernt von der Atemhöhle. Die Entfernung von der nächsten Kante des Bildes in die Atemhöhle wird über jedes Bild angezeigt. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Bildgebung
    Hinweis: Differential Interferenz-Kontrast, Phasenkontrast und Epifluoreszenz Bildgebung erfolgt mit einem inversen Mikroskop mit Hardware-basierte Autofokus, 60 X Ölimmersion automatisierte frühzeitig, Standardfilter, eine LED-Lichtquelle ausgestattet Ziele (1,4 NA) für Phasenkontrast oder differential Interferenz-Kontrast (DIC), und ein 1K Elektron-Multiplikation-gepaart-Ladegerät (EMCCD) Kamera. Das Mikroskop sollte in einem klimatisierten Raum platziert werden. Alternativ kann eine Stufe wärmer oder Kammer weiterhin konsequente Temperaturen während der Aufnahme verwendet werden.
    1. Epifluoreszenz Mikroskopie
      Hinweis: Für die Fluoreszenz-Bildgebung von lebenden Zellen ist es notwendig, die Anzahl der Bild Akquisitionen und optimieren Sie die Belichtungszeit um Immunofluoreszenz und Phototoxizität zu minimieren. Für die Darstellung von jeder Farbstoff empfiehlt es sich, eine optimale Belichtungszeit zu finden, die ausreichend Fluoreszenz-Detektion bietet aber führt nicht zur Immunofluoreszenz oder Phototoxizität. In den Abbildungen 2-4dienten alle Fluoreszenzbilder Belichtungszeiten von 200 ms. Für die Zeitraffer-Sequenzen in Abbildung 3dargestellt wurden die Bilder alle 10 min für 3 h erworben.
      1. Immersionsöl auf das angestrebte Ziel und legen Sie die invertierte Folie in den Diahalter auf der Bühne. Verwenden Sie die Fokussierung-Regler, um die Zellen in den Fokus zu bringen.
      2. Bilder in Phase (oder DIC) und den gewünschten Fluoreszenz-Filter zu erwerben.
        Hinweis: Die maximale Anregung und Emission Wellenlängen für die Flecken verwendet in Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4 sind wie folgt: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), Orange (547/570).
    2. Zeitraffer-Mikroskopie
      Hinweis: Während der Time-Lapse-Mikroskopie die folgenden Features sind Computer gesteuert: x-, y- und Z-Position, Fensterläden und Fluoreszenz-Filter. Eine Hardware-basierte Autofokus-System ist optimal zu konzentrieren während der Time-Lapse Bildgebung. Alternativ kann eine Software-basierte Autofokus-Schleife verwendet werden.
      1. Immersionsöl auf das angestrebte Ziel und legen Sie die invertierte Folie in den Diahalter auf der Bühne. Verwenden Sie die Fokussierung-Regler, um die Zellen in den Fokus zu bringen.
      2. Optional: Erwerben mehrere (X, y) Positionen. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 10 Felder von Zellen in unmittelbarer Nähe der Atemhöhle der Agarose-Pads.
      3. Einrichtung der Sequenz Erwerb Bild in Phase oder DIC auf das gewünschte Zeitintervall.
        Hinweis: Für die Zeitraffer-Sequenz, die in Abbildung 4dargestellt, DIC-Bilder mit 30 ms Exposition alle 10 min für 14 h erworben wurden. Bei der Verwendung von Fluoreszenz-Bildgebung im Zeitraffer Mikroskopie anpassen der Erfassungszeit Intervall und Belichtung, Immunofluoreszenz und Phototoxizität zu minimieren.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Target-spezifische Kennzeichnung der Wildtyp A. Tumefaciens Zellen
Um zu verdeutlichen, dass Zellmorphologie werden nicht beeinflusst durch das Waschen Stufen oder Behandlung mit 1 % DMSO (die verwendet wird, um die Fluoreszenz-Farbstoffen verdünnen), Zellen wurden direkt von Kultur (Abb. 2A, weit links), nach dem Waschen der Zellen durch abgebildet Zentrifugation wie beschrieben in 1.2 (

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll enthält eine Reihe von Verfahren zur Untersuchung von A. Tumefaciens Wildtyp, Mutanten und Erschöpfung Stämme. Es ist erwähnenswert, dass alle im Abschnitt Protokoll aufgeführten Verfahren für andere Bakterienstämme mit zusätzlichen Modifikationen ausmachen Wachstumsmedien, Temperaturen und Wachstumsraten leicht angepasst werden kann.

Die Verwendung von Farbstoffen gezielt ist ein wertvolles Werkzeug für die Bereitstellung einer detaillierte Charakterisierung der Zell...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Michael VanNieuwenhze (Indiana University) für das Geschenk des FDAAs, die in Abbildung 2 und Abbildung 4verwendet. Wir danken Mitglieder des braunen Lab for Feedback während der Vorbereitung dieser Handschrift. Forschung in die braunen Lab on A. Tumefaciens Zelle Wachstum und Teilung wird von der National Science Foundation (IOS1557806) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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Bacterial Stämme
Agrobacterium tumefaciens C58ATCC33970Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid, das für die Virulenz von Agrobacterium tumefaciens erforderlich ist. J Bacteriol 123: 255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58Δ tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA Δ ctrAFigueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Die Mini-Tn7-Insertion in eine künstliche attTn7-Stelle ermöglicht die Depeltion des essentiellen Master-Regulators CtrA im Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
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<>Media Components
ATGN Minimal MediumZu 1 l sterilisiertem Wasser 50 ml 20X Puffer, 50 ml 20X Salze, 12,5 ml 40% Glukose hinzufügen. Für Teller 15 g Bacto Agar in 1 l Wasser geben und autoklavieren. Abkühlen auf 55 Grad; C und fügen Sie 50 ml 20X Puffer, 50 ml 20X Salze, 12,5 ml 40% Glukose hinzu.
20X AT Puffer214 g/L KH2PO4 in Wasser geben und den pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 7,0 einstellen. Autoklav.
NaOHFisher BioReagentsBP359
KH2PO4Fisher ChemicalP288
20X AT SalzeZugabe von 40 g/l (NH4)2SO4, 3,2 g/L MgSO4• 7H2O, 0,2 g/L CaCl2• 2H2O und 0,024 g/L MnSO4• H2O in Wasser. Autoklav.
(NH4)2SO4Fisher ChemicalA701
MgSO4• 7H2OFisher BioReagentsBP213
CaCl2• 2H2OFisher BioReagentsBP510
MnSO4• H2OFisher ChemicalM114
GlucoseFisher ChemicalD1640% Brühe in Wasser zubereiten. Filter sterilisieren.
Bacto AgarFisher BioReagentsBP1423Fügen Sie 15 g zu 1 l Wasser hinzu, wenn Sie die Platten vorbereiten.
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Optionale Medienadditive
KanamycinGoldBioK-120Als 100 mg/ml Stammlösung in Wasser zubereiten und mit Filter sterilisieren. Verwendung bei einer Endkonzentration von 200 & Mikro; g/ml.
IPTGGoldBioI2481C5Als 1 M Stammlösung in Wasser aufbereiten und filtrieren. Bei einer Endkonzentration von 1 mM verwenden, je nach Bedarf für die Induktion.
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Mikroskopiematerialien
ObjektträgerFisherbrand12-550D25 x 75 x 1,0 mm. Mit Sparkle Glasreiniger reinigen.
Mikroskop-DeckglasFisherbrand12-541-B22 X 22 mm. Nr. 1.5. Reinigen Sie mit Sparkle Glasreiniger.
Sparkle GlasreinigerHome Depot203261385Ammoniak- und alkoholfrei.
Ultra Pure AgaroseInvitrogen16500-100In Wasser, PBS oder Medien mit einer Endkonzentration von 1 - 1,5% geben. In der Mikrowelle schmelzen und auf 70 °C
PBSFisher BioReagentsBP39950010-fache Lösung geben, um sie mit sterilem Wasser auf 1-fach zu verdünnen.
ParafilmBemisPM-999Laborfolie, die als Dichtung bei der Herstellung von Agarose-Pads verwendet wird.
VALAPFüge die gleichen Gewichte von Lanolin, Parafinwachs und Vaseline in ein konisches Röhrchen hinzu. Wärmerohr in 70 Grad; C trocken, perlig oder im Wasserbad zum Schmelzen und Mischen. Tragen Sie VALAP auf, während es noch geschmolzen ist.
Lanolin ButterSAAQINSQ-LAB-R1
VaselineTarget Corp.06-17644
ParaffinwachsCrafty Kerzen263012
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Target-spezifische Farbstoffe
DMSOFisher BioReagentsBP231-1Zur Verdünnung von Stofflösungen von Farbstoffen nach Bedarf verwenden.
FDAAs (NADA, HADA, TADA) FDAAserworben werden. Bereiten Sie 100 mM Stammlösung in DMSO vor. Bei einer Endkonzentration von 5 mM anwenden.
DAPIThermoFisher Scientific62247mg/ml Stammlösung in DMSO herstellen. Verwendung bei einer Endkonzentration von 1 & Mikro; g/ml.
SYTOX Orange Nukleinsäure-FärbungInvitrogenS11368Stammkonzentration beträgt 5 mM in DMSO. Bei einer Endkonzentration von 5 μm verwenden.
FM4-64InvitrogenT3166mg/ml Stammlösung in DMSO herstellen. Verwendung bei einer Endkonzentration von 8 &; Mikro; g/ml.
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Ausrüstung
TrockenbadSheldon Manufacturing, Inc.52120-200
Metallische ThermokügelchenLab Armor42370-002
Epifluoreszenzmikroskop ausgerüstet mit einer EMCDD-KameraNikon Eclipse TiE ausgerüstet mit einer QImaging Rolera em-c2 1K Elektronen-multiplizierende Ladungsgekoppelte Baugruppe (EMCCD) Kamera wird in dieser Arbeit verwendet.
können synthetisiert oder durch Vereinbarung mit Mike VanNieuwenhze (Indiana University) 1 Die 8

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
  2. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  3. Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26(2010).
  4. Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
  5. Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496(2013).
  6. Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  7. Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
  9. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
  10. Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
  11. Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
  12. Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
  13. Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
  14. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219(2014).
  15. Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
  16. Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
  17. Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
  18. Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
  19. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  20. Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
  21. Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
  22. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  23. Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137(2007).
  24. Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
  25. Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
  26. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  27. Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
  28. McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
  29. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
  30. Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
  31. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
  32. Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730(2014).
  33. Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488(2016).
  34. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322(2014).
  35. Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
  36. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  37. Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519(2013).
  38. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
  39. Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
  40. Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682(2013).
  41. Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
  42. Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469(2014).
  43. Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363(2011).
  44. Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).

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