Methodenartikel

Verbesserte Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation aus Maus skelettartiger Muskel

DOI:

10.3791/56504

⸱

6. November 2017

 ,  ,  , 
1Department of Functional Genomics and Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine neuartige Protokoll für die Vorbereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskulatur zur Erforschung der Genregulation in Muskelfasern von Chromatin Immunopräzipitation angepasst präsentiert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben eine effiziente und reproduzierbare Protokoll für die Vorbereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskulatur, eine physisch resistent Gewebe mit einem hohen Gehalt von Strukturproteinen. Sezierten Gliedmaßen Muskeln von Erwachsenen Mäusen sind physisch durch mechanische Homogenisierung oder eine Kombination von hacken und Douncing in einem hypotonischen Puffer vor Formaldehyd Fixierung der Zelle lysate gestört. Die feste Kerne werden gereinigt, durch weitere Zyklen von mechanischer Homogenisierung oder Douncing und sequentielle Filtrationen, Zelle Ablagerungen zu entfernen. Die gereinigte Kerne können sofort oder zu einem späteren Zeitpunkt nach dem Einfrieren beschallt werden. Das Chromatin kann effizient beschallt und ist geeignet für Chromatin Immunopräzipitation Experimente, wie durch die Profile für Transkriptionsfaktoren, RNA-Polymerase II und kovalente Histon Änderungen erhalten. Die verbindliche Ereignisse mit Chromatin vorbereitet durch dieses Protokoll nachgewiesen sind überwiegend in die Muskelfaser Kerne trotz der Anwesenheit von Chromatin von anderen Faser-assoziierten Satelliten- und Endothelzellen stattfindet. Dieses Protokoll ist daher angepasst, Genregulation in der Skelettmuskulatur erwachsener Mäuse zu studieren.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) gekoppelt und Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-Seq) geworden, die Methoden der Wahl Transkription zu studieren und epigenetischen Regulation der Genexpression in verschiedenen Geweben und Zelltypen1. Diese Technik erlaubt es genomweiten Profilierung der kovalente Chromatin Änderungen, Histon Variante Belegung und Transkription Faktor Bindung2,3.

ChIP von kultivierten Zellen gut etabliert ist, bleibt ChIP von Säugetier-Gewebe schwieriger. Die Vorbereitung von Chromatin für ChIP umfasst mehrere wichtige Schritte, die für jede Art von Gewebe und Zellen optimiert werden müssen. Chromatin kann aus der zellulären Lysates kultivierten Zellen oder folgende Reinigung des ihre Kerne hergestellt werden. Im Falle von Säugetier-Gewebe sind effiziente lyse, Formaldehyd Fixierung und Reinigung der Kerne kritisch, um optimale Erholung des Chromatins zu gewährleisten. Darüber hinaus hat die Wahl, ob die Kerne vor oder nach ihrer Reinigung beheben experimentell zu ermitteln. Trotz dieser Hürden hat ChIP aus dem Gewebe wie Leber, Hoden oder Gehirn4,5,6erfolgreich durchgeführt. Im Falle der Skelettmuskulatur ist Störung der physisch resistent Gewebe, die einen hohen Gehalt an Strukturproteinen und Isolation von seinen Kernen Exponate besonders anspruchsvoll. Angesichts dieser Besonderheit, geben Protokolle, optimiert für andere Gewebe nicht zufriedenstellende Ergebnisse für skelettartigen Muskeln.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur ChIP-Grade Chromatin von Maus Skelettmuskelgewebe zu isolieren, die physisch stören das Gewebe, Formaldehyd Fixierung und die Isolation der Kerne und Beschallung beinhaltet. Die Effizienz dieser Methode Chromatin geeignet für ChIP aus diesem Gewebe vorzubereiten zeigte sich durch ChIP-qPCR und ChIP-Seq für verschiedene Transkriptionsfaktoren, RNA-Polymerase II und kovalente Histon-Modifikationen-7.

Diese neue Technik ist wesentlich schneller als ein zuvor gemeldeten Protokoll8 bestehend aus lange Kollagenase Verdauung Schritte während dieser Zeit, Änderungen bei genomischen Lokalisierung von Transkriptionsfaktoren und Veränderungen in der Genexpression erfolgen können. Die Schnelligkeit, mit der die Kerne isoliert und fixiert sind, macht die hier beschriebene Methode besonders attraktiv, Chromatin vorzubereiten, die mehr treu den nativen genomische Belegung Zustand erfasst. Außerdem, obwohl andere Methoden für Chromatin Isolierung oder Protein-Extraktion aus Muskelgewebe haben beschrieben8,9,10 und verwendet wurden für ChIP-qPCR Experimente auf ausgewählte Gene, kein ChIP-seq Daten wurde über sie berichtet. Die Methode hier berichtet eignet sich für Transkription Faktor und Histon Modifikation ChIP-Seq, und daher sollte auch für 3 / 4C oder HiC Chromatin Konformation Erfassung Anwendungen geeignet.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mäuse gehalten wurden, im Einklang mit den institutionellen Richtlinien zur Pflege und Verwendung von Labortieren und nationale Tier-Pflege-Richtlinien (Europäische Kommission Richtlinie 86/609/EWG; Französischen Dekret Nr. 87-848). Alle Verfahren wurden von der französischen nationalen Ethikkommission genehmigt.

1. Isolation von Muskelgewebe

  1. Opfer eines Erwachsenen 6 bis 8 Wochen altes Baby Maus durch zervikale Dislokation. Sterlise der Extremität durch Spülen mit 70 % Ethanol und sezieren die hinteren Gliedmaßen Muskeln (Gastrocnemius, m. Tibialis Anterior, Quadrizeps) mit feinen Spitze Schere und Zange.
    Hinweis: Sollte eine Maus etwa 500 mg des Gewebes ergeben.
  2. Hackfleisch die Muskeln in einem 2 mL Reagenzglas mit 1 mL eiskaltes hypotone Puffer, um eine homogene Zubereitung von kleinen (< ca. 2-3 mm 3) Stücke mit feinen Schere und verlassen das Rohr schütteln auf einer Bank Top Rührwerk bei 4 ° C für ca. 5-10 min.

2. Gewebe-Lyse

Hinweis: siehe Tabelle 1 für alle Kompositionen Puffern.

  1. Das Homogenat in einem 14 mL Rundboden Röhrchen zu übertragen und in 5 mL kalte hypotone Puffer (EDTA-freie Protease-Inhibitor cocktail und PMSF) Aufschwemmen.
    1. Homogenise das Hackfleisch / Muskelgewebe mit einer lockeren Dounce (20-30 Schläge innerhalb von 3 Minuten) oder eine mechanische Gewebe-Homogenisator für 15-30 s in 14 mL Rundboden Röhrchen.
      Hinweis: Die Effizienz der Lyse in diesem Stadium durch Lichtmikroskopie beurteilt werden kann und bei Bedarf zusätzliche Störungen durchgeführt werden kann.
  2. Das Homogenat in 15 mL-Tuben und Lautstärke auf 10 mL mit kalten hypotone Puffer zu füllen. Das Homogenat zu beheben, wie unten beschrieben, bevor Sie mit der nächsten Maus.

3. Befestigung

  1. 1 % Endkonzentration Formaldehyd hinzu und schütteln Sie für 10 min bei Raumtemperatur.
  2. In jedem Röhrchen, Fixierung und schütteln für 5-10 min bei Raumtemperatur zu stoppen eine Endkonzentration von 0,125 M Glycin hinzufügen.

4. Kerne Vorbereitung

Hinweis: siehe Tabelle 1 für alle Kompositionen Puffern.

  1. Homogenise die feste lysate mit einem losen Dounce (5-10 Schläge).
    1. Übertragung eine 15 mL Tube und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min bei 4 ° C, Kerne und Zelltrümmer zu erhalten.
  2. Den Überstand zu entfernen und das Pellet in frischen 5 mL Hypotonische Puffer aufzuwirbeln. Filtern der lysate durch ein Sieb 70 µm Zelle in ein 50 mL-Tube. Filtern Sie erneut das Filtrat durch ein Sieb 40 µm Zelle.
  3. Transfer das Filtrat eine 15 mL Tube und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 Minuten bei 4 ° C, das nukleare Pellet zu erhalten.
    Hinweis: In diesem Stadium die Kerne können sofort beschallt oder fangen, als eine trockene Pellets in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 gelagert ° C.

5. Ultraschall

  1. das Volumen des nuklearen Geschosses (rund 50 µL für Maschinen- und Dounce Homogenisierung) zu bewerten und in Beschallung Puffer bis zu 3 bis 4 Mal von nuklearen Packvolumen Aufschwemmen und beschallen für 10-15 min bei 4 ° C mit einem Sonikator .
    Hinweis: Das Chromatin kann sofort analysiert, wie unten (6) beschrieben oder eingefroren und bei-80 ° c

6. Beurteilung der Chromatin-Fragmentgröße nach Beschallung

Hinweis: siehe Tabelle 1 für alle Kompositionen Puffern.

  1. , De-Crosslink, 30 µL des Chromatins im Reagenzglas 1,5 mL und fügen 20 µL 5 M NaCl. Füllen Sie das Volume 500 µL und über Nacht bei 65 ° C inkubieren.
    1. Am nächsten Tag, führen Sie eine Behandlung mit 1 µL Proteinase K (20 mg/mL Brühe), 10 µL 2 M Tris pH 6,8 und 10 µL 0,5 M EDTA für 1 h bei 42 ° c führen eine Phenol-Chloroform/Chloroform Extraktion und überstürzen sich die DNA mit 1 Volumen von Natrium-acetat e (3 M) und 2 Bände von 100 % Ethanol für 1 h bei-80 ° C oder über Nacht bei-20 ° c
  2. Pellet-DNA durch Zentrifugation bei 13.500 x g für 15 min. Dekantieren des Überstandes, waschen das Pellet gründlich mit kaltem 70 % igem Ethanol und Zentrifuge wieder für 5 min. Dekantieren des Überstandes und an der Luft trocknen die Pellet.
  3. Aufschwemmen der Pellets in das ursprüngliche Volume (30 µL) von TE-Puffer. Die DNA-Konzentration in einem Spektralphotometer durch Absorption bei 260 nm/280 nm zu messen. Pipette 500-1.000 ng DNA zusammen mit einem DNA-Größe Leiter auf getrennten Bahnen eine 1,5 % Agarose-Gel und Elektrophorese zur Beurteilung der Fragmentgröße des Chromatins führen.
    Hinweis: Fragmentgröße sollte zwischen 200-500 Basenpaaren, und es darf keine nachweisbaren hochmolekularen Fragmente entspricht, nicht oder schlecht-fragmentierten DNA. Bei Bedarf kann die Chromatin-Lösung (Schritt 5) wieder für eine längere Zeit beschallt und analysiert dann erneut wie oben beschrieben, bis die optimale Größe erreicht ist.

7. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP)

Hinweis: siehe Tabelle 1 für alle Kompositionen Puffern.

  1. Block Eiweiß G Sepharose Perlen durch Aliquotierung 1 mL 50 % Gülle in Ethanol. Pellets die Perlen durch Zentrifugation bei 400 X g für 1 min in einem Benchtop Zentrifugieren und waschen mit 1 mL TE-Puffer-Zentrifuge bei 400 X g und wiederholen Sie die Wash
    1. , Nachdem der zweite Zentrifugation, neu in 1 mL der ChIP Verdünnungspuffer mit 25 µL der BSA (Lager 20 mg/mL) und 20 µL tRNA (Lager 10 mg/mL Hefe). Blockieren Sie die Perlen für mindestens 2 Stunden vor der Verwendung durch Rotation (40-60 u/min) bei 4 ° c
    2. Verdünnen 50 µg des Chromatins (Schritt 5) 8 bis 10 Mal mit ChIP Verdünnungspuffer. Fügen Sie 50 µL blockierte Wulst Gülle und inkubieren 2 h drehen (40-60 u/min) bei 4 ° C. Zentrifuge bei 400 X g bei 4 ° C zu erhalten bereits geräumten Chromatin und überträgt es auf ein frisches Tubus.
  2. Für Immunopräzipitation, fügen Sie die entsprechende Menge an primären Antikörper (z. B. 1-2 µg pro 10 µg von Chromatin) und inkubieren Sie über Nacht mit Rotation bei 4 ° c
    Hinweis: Die optimale Menge des Antikörpers kann vom Lieferanten empfohlen werden oder kann durch ChIP-qPCR mit unterschiedlichen Mengen von Antikörpern durchführen, bis optimale Bereicherung beobachtet wird empirisch ermittelt werden. Auch Eiweiß G Sepharose durch Protein A Sepharose je nach Subtyp des Antikörpers verwendet ersetzt werden kann.
  3. Fügen Sie die gesperrten Perlen am nächsten Tag und inkubieren Sie für 1 h mit Drehung (40-60 u/min) bei 4 ° C. Zentrifuge bei 400 X g für 20-30 s pellet-die Perlen, überstand zu entfernen, und starten den ChIP wäscht.
  4. ChIP Wäschen: führen Sie die folgenden Waschungen mit dem Puffer: einmal mit niedrig-Salz-Puffer, und dann zweimal mit hohen Salz Puffer, zweimal mit LiCl Puffer, und schließlich zweimal mit TE-Puffer.
    1. Jedem Waschgang für 10 min mit Drehung (40-60 u/min) bei 4 ° C durchführen und die Perlen zwischen jedem Waschgang durch Zentrifugation bei 400 X g für 20-30 s in einer Zentrifuge Benchtop-pellet.
  5. Für Elution, entfernen die letzten Wäsche und die Perlen in 250 µL Elution Buffer (frisch zubereitet) für 15 min bei Raumtemperatur unter Schütteln Aufschwemmen.
  6. Zentrifuge bei 400 x g und sammeln das Eluat in einem frischen Rohr. Führen Sie diesen Schritt zweimal und dann de-Crosslink das Eluat über Nacht mit 20 µL NaCl 5 M und 1 µL RNase A (10 mg/mL), Proteinase K und Phenol-Chloroform/Chloroform Extr behandelnhandeln wie in Schritt 6.
  7. In 50 µL TE-Puffer Aufschwemmen und Aliquote für ChIP-qPCR nach Standardprotokollen 15 um die Qualität des Chips.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um die Kerne zu isolieren, führten wir mechanische Homogenisierung des Muskelgewebes seziert und Hackfleisch für entweder 15 oder 45 s, bei 18.000 und 22.000 u/min (siehe Tabelle der Materialien). Unter allen Bedingungen Kerne aus den Trümmern Gewebe getrennt werden könnte, aber die Ausbeute war optimal mit der niedrigeren Drehzahl (Abbildung 1A-B). Kerne könnten auch durch Douncing für 3-5 min (Abbildung...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir eine neuartige Protokoll für die Zubereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskeln und zeigen, dass das Chromatin für ChIP Experimente geeignet ist, die Transkription Faktor Bindung und kovalente Histon-Modifikationen in den Muskelfaser-Kernen zu erkennen. Dieses Protokoll beinhaltet mehrere kritische Schritte. Die erste ist Gewebe Störungen, die durch Dounce oder durch mechanische Scherung erfolgen kann. Mechanische Scherung ist schneller und mehr reproduzierbar, und ist daher die Method...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir bedanken uns bei allen Mitarbeitern des IGBMC Hochdurchsatz-Sequenzierung Anlage, ein Mitglied des Konsortiums "Frankreich-Génomique" (ANR10-INBS-09-08) und alle IGBMC allgemeine Dienstleistungen insbesondere das Personal der IGBMC Tierhaltung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem CNRS, INSERM, AFM, der Ligue Nationale Contre le Cancer, die französische staatliche Fonds durch die ANR im Rahmen des Programms Investissements Avenir gekennzeichnet ANR-10-IDEX-0002-02, die Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 und die ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. S.J wurde unterstützt von der Ligue Nationale Contre le Cancer und die ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 und V.U durch das Ministère de nannte et De La Recherche. ID ist ein 'Équipe Labellisée' der Ligue Nationale Contre le Cancer.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
T 25 digital ULTRA-TURRAXT 18 ULTRA-TURRAX0009022800
PMSFSIGMA-ALDRICH CHIMIE SARLP7626-25G
Protease-Inhibitor Cocktail-EDTA-freiRoche Diagnostics11873580001
Protein G SepharosekügelchenSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-3296
Proteinase KSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-2308
Zellsiebe 70umCorning BV431751
Zellsiebe 40umCorning BV352340
Formaldehyd EM-QualitätEuromedex15710-S
Rnase AFischer Scientific12091039
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol 25:24:1SIGMA-ALDRICH CHIMIEP3803
BSASIGMA-ALDRICH CHIMIEB4287-25G
Hefe tRNASIGMA-ALDRICH CHIMIER5636
GlykogenblauAMIBIONAM9516
Pol II ChIP AntikörperSanta CruzSC-9001
H3K27ac ChIP AntikörperAktives Motiv39133
Tead4 ChIP AntikörperAviva Systems Biology(ARP38276_P050)
IGEPALSIGMA-ALDRICH CHIMIEI-3021
E220 Fokussierter UltraschallgerätCovaris E220
NameCompanyKatalognummerKommentare
>Zusätzliche Artikel
Scissors
Loose Dounce
15 ml und 50 ml Falcon Röhrchen
14 ml Rundbodenröhrchen
1,5 ml und 2 ml Eppendorf Röhrchen
70 & mu; m und 40 μ m-Zell-Siebe (Corning)

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  2. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
  3. Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
  4. Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613(2014).
  5. Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530(2010).
  6. Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
  7. Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).
  8. Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
  9. Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513(2012).
  10. Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
  11. Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
  12. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  13. Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
  14. Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
  15. Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Chromatin PreparationMechanical HomogenizationFormaldehyde FixationNuclei PurificationSonication ProtocolDNA ExtractionChIP SequencingTranscription Factor Binding

Verwandte Artikel