Methodenartikel

Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren

DOI:

10.3791/56515

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30. März 2018

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1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Eine einfache Methode für den Erhalt der NK und T-Zell-Klone von CAEBV Patienten wurde mit hohem Wirkungsgrad, eine kleine Menge des peripheren Blutes und einen Low-Dose von IL-2 entwickelt.

Zusammenfassung

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Eine Reihe von Methoden wurden beschrieben, NK/T-Zell-Linien von Patienten mit Lymphom oder Lymphoproliferative Syndrome zu etablieren. Diese Methoden angewendet Feeder-Zellen, gereinigten NK oder T-Zellen mit mehr als 10 mL Blut oder eine hohe Dosis von IL-2. Diese Studie stellt eine neue Methode, eine leistungsstarke und einfache Strategie zu etablieren, dass NK und T-Zell-Linien durch Kultivierung der peripheren Mononukleäre Zellen (PBMC) Blut mit dem Zusatz von rekombinanten menschlichen Il-2 (RhIL-2) und weniger als 2 mL Vollblut verwendet. Die Zellen können in zwei Wochen schnell vermehren und für mehr als 3 Monate gehalten werden. Mit dieser Methode wurden 7 NK oder T-Zell-Linien mit einer hohen Erfolgsquote eingerichtet. Diese Methode ist einfach, zuverlässig und für Schaffung Zelllinien aus mehr Fälle von CAEBV oder NK/T-Zell-Lymphom.

Einleitung

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Epstein - Barr-Virus (EBV) ist allgegenwärtig und befällt nicht nur B-Zellen, sondern auch T und natürlichen killer (NK)-Zellen, wodurch eine Reihe von EBV-assoziierten NK/T Lymphoproliferative Erkrankungen (LPD) und Lymphom/Leukämie, wie z. B. EBV-assoziierten hemophagocytic Lymphohistiocytosis, Hydroa Vacciniforme-wie Lymphom, extranodal NK/T-Zell-Lymphom, nasale Art und aggressive NK Zell-Leukämie1,2,3. Unter diesen ist schwerer chronisch aktive EBV (SCAEBV) Erkrankung, die einfallenden vor allem in Ostasien, und das gilt jetzt als ein LPD verursacht durch klonale Expansion von EBV-infizierte T oder NK Zellen4,5,6, 7, aber ohne die scheinbare Immunschwäche präsentieren in infektiöse Mononukleose (IM)-wie Symptomen wie Fieber, Hepatosplenomegalie, Lymphadenopathie und Leberfunktionsstörungen, anhaltend oder wiederkehrend sowie hohen EBV-DNA in die peripheren Blut8,9. Patienten mit CAEBV haben eine schlechte Prognose10,11, und seine Pathogenese und die Rolle der EBV ist unklar. Daher Zellinien von EBV-assoziierten NK/T Lymphoproliferative Erkrankungen abgeleitet und Lymphome sind sehr hilfreich, wie Zellmodelle für Klärung des Mechanismus der EBV NK oder T-Zell-Proliferation und seine Beziehung mit hoher Inzidenz von Leukämie induziert oder Lymphom.

Bislang wurden mehrere Zellinien mit verschiedenen Techniken12,13,14,15,16eingerichtet. Eine menschliche NK-Zell-Linie, NK-YS, entstand von NK-Zellen-Lymphom/Leukämie, durch Kultivierung zusammen mit einer Maus Stromazellen Zelllinie als Zubringer und in Anwesenheit von RhIL-2 in einer Konzentration von 20U pro mL15. KAI3 war ein weiterer NK-Zell-Linie gegründet von Patienten mit einer schweren Moskito-Allergie oder SCAEBV mit autologen Lymphoblastoid Zelllinie (LCL), B-Zellen durch EBV, als Feeder-Zellen und Zugabe von RhIL-2 bei 100U/mL16verwandelt. SNK6 und SNT8 wurden von Tumorgewebe des nasalen NK/T Zelle Lymphom Patienten abgeleitet, durch Zugabe von Hochdosis-RhIL-2 (700U/mL)12. Mit ähnlicher Technik war die SNK-1 Zelle von CAEBV Patienten, kultiviert von PBMC durch T-Zellen entfernen und Hinzufügen von 700U/mL RhIL-213,17. SNT13 und SNT15 wurden durch Entfernen von CD4 + und CD8 + Zellen18gegründet. Bisher wurden alle anderen T-Zellen und NK-Zell-Linien von EBV-NK/T LPD Patienten mit dieser Methode19entwickelt.

Die Nachteile der oben erwähnten vorhandenen Methoden gehören die Beschäftigung von Feeder-Zellen, das Erfordernis einer hohen Dosis von IL-2, die Auslastung von mehr als 10 mL Vollblut oder die Reinigung von NK/T-Zellen, die sehr anspruchsvoll in der Klinik die Notwendigkeit der Überprüfung, welche Arten von Zellen, dass EBV latent infiziert vor Beginn der Kultur. Als CAEBV vor allem bei Kindern in Asien tritt, ist 10 mL Blut nicht einfach, in allen Regionen zu erwerben. In dieser Studie haben wir eine neue einfache Methode mit einer hohen Erfolgsquote, NK und/oder T-Zell-Linien zu etablieren, durch Kultivierung PBMC von CAEBV Patienten mit niedrig dosierten rhIL2 und ein Volumen von 2 mL Vollblut ohne Feeder-Zellen entwickelt. Die Ergebnisse dieser Methode haben ihre hohe Effizienz und Zeitersparnis bewiesen.

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Protokoll

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Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Institut für Genetik und Entwicklungsbiologie, chinesische Akademie von Wissenschaften, genehmigt und das Protokoll folgt den institutionellen Richtlinien für menschliches Wohlergehen.

Hinweis: Siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung des Workflows.

1. Isolierung von PBMC von CAEBV Patienten

  1. Primäre PBMC von 2 mL Vollblut von CAEBV Patienten durch den Farbverlauf (z.B.Ficoll-Plakette) zu reinigen Zentrifugation, die Anweisungen des Herstellers. Alternativ kryokonserviert Tauwetter PBMC von flüssigem Stickstoff mit RPMI 1640 Medium.
  2. 18 µL Zellsuspension 2 µL Trypan blau (0,4 %) hinzufügen, 3 min. zu beflecken Zellen, das Fahrwerk an die Zelle Gegenplatte übertragen und messen die Zellen Konzentration und Rentabilität mit einem automatisierten Zelle Zähler warten.
  3. Bereiten Sie die Zellsuspension bei einer Dichte von 2-3 × 106 Zellen/mL mit kompletten RPMI 1640 Kulturmedium mit 20 % humanem Serum (Hitze inaktiviert bei 56 ° C), 2 mM L-Glutamin ergänzt und Antibiotika (100 µg/mL Streptomycin, 100 U/mL Penicillin). Samen 1 mL PBMC Suspension pro Bohrloch in 24 wohlen Zellplatten Kultur.
  4. Fügen Sie 150 U RhIL-2 pro Bohrloch.
  5. Legen Sie die Kultur-Platten in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C.
  6. Am 2. Tag beobachten Sie die Zellmorphologie unter dem Mikroskop (200 X Vergrößerung); Zellen sind in einem guten Zustand, wenn sie hell und rund sind.

2. Ausbau der Nummerierung der lebensfähigen Zellen und Zellen

  1. Die Zellmorphologie unter dem Mikroskop (200 X Vergrößerung) zu beobachten und überwachen den Zustand des Zellwachstums durch Nummerierung der Zellen vor dem Wechsel Medium: 18 µL Zellsuspension 2 µL Trypan blau (0,4 %) hinzu, und die Zellen Konzentration zu berechnen (siehe 1.2, Abbildung 2).
  2. 500 µL des Mediums in einer 24-Well-Platte zu verwerfen, und 500 µL frische komplette Kulturmedium hinzufügen. Fügen Sie 150U RhIL-2 pro Bohrloch.
  3. Verändern Sie zweimal in der Woche wie in Schritt 2.2 das Medium.
  4. Ziehen Sie die Zelle Wachstumskurve (Abbildung 3).
  5. Überschreitet der lebensfähigen Zellen Konzentration 5 × 106/mL, teilen Sie sich Zellen in neue Brunnen in einer Konzentration von 1 – 2 × 106 Zellen/mL in jede Vertiefung. Dieser Vorgang dauert ca. 2-4 Wochen.

3. Zelle Phänotypisierung von Durchflusszytometrie

  1. Wenn Zellen erweitert haben, sammeln Sie 1 × 106 Zellen um die Phänotypen der Zell-Linien zu bestimmen. Zentrifugieren Sie Zellen bei 240 X g für 5 min bei Raumtemperatur (NK/T-Zellen werden an der Unterseite des Rohres Niederschlag).
  2. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie den Niederschlag durch Zugabe von 7 mL PBS. Zentrifuge für 5 min bei 240 X g bei Raumtemperatur. Einmal wiederholen.
  3. Jedes Rohr 200 µL Humanserum hinzufügen, gut mischen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Zentrifugieren Sie Zellen bei 240 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den Überstand verwerfen und erneut aussetzen der Zellen bei 1 × 106/mL mit kalten PBSA (PBS+0.2%BSA). Teilen Sie Zellen in 5 Röhren auf, jedes Röhrchen mit 2 × 105 Zellen.
  5. Zentrifuge Zellen bei 240 X g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand verwerfen und wieder auszusetzen, die Zellen mit PBSA Puffer oder PBSA mit 10 µL PE (oder PE-Cy7) und 10 µL FITC beschriftet Antikörper, die Zell-Rezeptoren von T oder NK-Zellen auf dem Eis zu beflecken, wie Abbildung 4angegeben ist. Zellen mit PBSA Puffer ausgesetzt sind als Negativkontrolle verwendet.
  6. Inkubation der Zellen mit Antikörpern für 20-30 min auf Eis im Dunkeln.
  7. Waschen Sie die Zellen zweimal mit kalten PBSA, wieder auszusetzen, die Zellen mit 300 µL kalter PBSA.
  8. Analysieren Sie die Zelle Phänotyp mit einem Durchflusszytometer.
    1. Richten Sie den Flow Cytometer in "Arbeitsblatt erstellen" Zustand. Richten Sie die experimentelle Vorlage mit einem Dot-Plot, der forward Scatter (FSC) versus Side Scatter (SSC) anzeigt.
    2. Laden Sie der Isotype Kontrollröhrchen um den FSC und SSC Spannungen zu optimieren und optimieren Sie den FSC-Schwellenwert um Ablagerungen zu beseitigen ohne Beeinträchtigung der Zellpopulation von Interesse. Löschen Sie alle Parameter mit Ausnahme von FSC, SSC, FITC, PE und PE-Cy7.
    3. Führen Sie die Isotype-Steuerung und einer einzigen positiven Kontrolle in jeder Gruppe 2-Farbanalyse mit Ausgleich.
    4. Laden Sie Proben und erstellen Sie HLA-DR VS CD19 CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 und CD3 VS CD16 Punkt plottet zeigt verschiedene Bevölkerung der Zellen.
      Hinweis: PBMC wurden verwendet, um mit negativen/Isotype Steuerungen und einzigen positiven Ausgleich durchzuführen. 2-Farben-Immunfluoreszenz mit Durchflusszytometer war routinemäßig verwendet, um den Ausdruck der Oberflächenmarker zu analysieren. Die folgenden Antikörper sind enthalten: Anti-HLA-DR, Anti-CD4, Anti-CD16 konjugiert mit Fluorescein erfolgt (FITC), Anti-CD8, Anti-CD56, CD3 konjugiert mit Phycoerythrin (PE) und Anti-CD19 konjugiert mit PE-Cy7.

4. Ausbau und Kryokonservierung von NK/T-Zellen

  1. Ändern Sie das Medium, wenn die Zelle Phänotyp-Analyse abgeschlossen ist. Sorgfältig entfernen Sie die Hälfte des Überstands und berühren Sie die Zellen an der Unterseite der Platte. Fügen Sie die gleiche Menge an frischem Nährmedium mit 300 U/mL RhIL-2 zu den Zellplatten.
  2. Die Hälfte des Mediums ändern alle 3 Tage (als 2.2) bis die Zelle Cluster sind deutlich sichtbar unter dem Mikroskop (Abbildung 2). In der Regel dauert dieser Vorgang ca. 2-3 Wochen.
  3. Transfer der Zellen vom 24-Well Platten zum T25 Kulturflaschen nach dem Mischen verschiedenster Brunnen derselben Linie. Doppelte Volumen Kulturmedium wie es gelb bis das Volumen des Mediums wird erweitert um 10-15 mL. Fügen Sie RhIL-2 mit der Konzentration von 150 U/mL.
  4. Ändern mittlere 24 h vor dem Einfrieren nach 2-3 Wochen wachsen, wenn die Zelle Masse mit bloßem Auge beobachtet werden kann. Messen Sie Zellkonzentration mit einer Zelle Zähler.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 240 X g und wieder auszusetzen Sie Zelle Pellet bei einer Dichte von 5-10 x 106 Zellen/mL mit gefrorenen Vorratslösung der fötalen Rinderserum 90 % und 10 % Dimethylsulfoxide (DMSO) enthält. Mit einer Rate von 1 ° C / Min. bis-80 ° C eingefroren und dann direkt in flüssigen Stickstoff übertragen.

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Ergebnisse

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Nach 3 Tagen während der Einrichtung von Zelllinien Kultur, beginnen die polymorphen Zellen erscheinen (Abbildung 2). Nach 7 Tagen wachsen Zellen schnell, da sowohl die Anzahl als auch die Lebensfähigkeit der Zellen mit einer hohen Rate (Abbildung 3) erhöht werden. Kleine Gruppen von Zellen sind deutlich sichtbar nach 10-14 Tagen wächst, wenn die Zellkonzentration 3-6 × 106überschreiten kann. In diesem Zeitraum sollten...

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Diskussion

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In diesem Protokoll wurde eine neuartige Technik für den Aufbau von NK/T-Zell-Linien aus dem Vollblut von CAEBV Patienten entwickelt. Im Vergleich mit den bisherigen Verfahren, ist der Hauptvorteil dieser Methode seiner Einfachheit und seiner Forderung nach nur ein kleines Volumen des Blutes, während es eine hohe Erfolgsquote und gute Bedingungen der Zellviabilität aufweist. Darüber hinaus können NK/T-Zell-Linien eingerichtet werden, durch Kultivierung PBMC ohne festzustellen, dass die Zelltypen der EBV latent infiziert ...

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Offenlegungen

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D.Z., X.Z. und X.C. sind Co-Erfinder auf Patentanmeldungen für Einsatzmöglichkeiten dieser Methode zur Festsetzung von NK/T-Zell-Linien und die Zell-Linien, die in dieser Studie festgestellt. D.Z., X.Z. und X.C. erklären, keine finanziellen Interessenkonflikte in dieser Arbeit. Die verbleibenden Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch die Schlüssel Projekte der chinesischen Akademie der Wissenschaften (KFZD-SW-205), strategische biologische Ressourcen Technologie-Support-System der chinesischen Akademie der Wissenschaften (CZBZX-1 und ZSSB-004) und durch Zuschüsse vom National Science Foundation of China (unterstützt 81401640) und Shanghai Natural Science Fund (14ZR1434800).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Hu HLA-DR FITCBDAntikörper für FACS
Hu CD4 FITCBD555346Antikörper für FACS
Hu/NHP CD8 PEBD557086Antikörper für FACS
Hu CD3 PEBD555340Antikörper für FACS
Hu CD16 FITC 3G8BD555406Antikörper für FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31BD556647Antikörper für FACS
hu/CD19 PE-Cy7BD560728Antikörper für FACS
humanes IL-2Roche11147528001
humanes SerumMRCCCC118-125
CO2-InkubatorSANYO
CentrifugeTechcompCT6TZentrifugationsmikroskop
OLYMPUS CKX53CKX53
Automatisierter ZellzählerCountstarIC 1000Für die Zellzählung
24-Well-ZellkulturclusterCorning Incorporated3524Polystyrolplatten
25cm2 ZellkulturkolbenNest707001Polystyrol
FBSGibco10270Bestandteil des Zellmediums
RPMI Medium 1640Lebensdauer22400089Für Zellmedium
L-GlutaminAmresco374Bestandteil des Zellmediums
100 x Streptomycin Penicillin-Lösung BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Bestandteil des Zellmediums
Ficoll paque plusGE Healthcare17-1440-03Für die In-vitro-Isolierung von Lymphozyten
DMSOSigmaD2650Zum Einfrieren von Zellen
DurchflusszytometerBDBD FACSAria II
SoftwareBDBD FACSDiva SoftwareFACS Analyse
560944

Referenzen

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NK T Zelllinienchronisch aktive EBV Infektionperiphere mononukle re Zellen des Blutesrekombinantes humanes IL 2flusszytometrische AnalyseGradientenzentrifugationZellkulturpflegePh notypbestimmungberwachung der ZellproliferationKryokonservierungstechnik

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