DNA-Färbung Methode basiert auf Formazan Niederschlag induziert durch blaues Licht aussetzen

Zusammenfassung

Diese Methode erlaubt selektive Färbung und Quantifizierung der DNA in den Gelen durch Einweichen das Gel in einem SYBR Grün ich / Nitro blau Tetrazoliumsalz Lösung und setzen Sie sie dem Sonnenlicht oder eine blaue Lichtquelle. Dies erzeugt einen sichtbaren Niederschlag und erfordert fast keine Ausrüstung, wodurch es ideal für den mobilen Einsatz.

Zusammenfassung

DNA-Färbung Methoden sind sehr wichtig für die biomedizinische Forschung. Wir haben eine einfache Methode, die DNA-Visualisierung mit dem bloßen Auge durch die Bildung von farbigen Niederschlag ermöglicht entwickelt. Es funktioniert durch Einweichen der Acrylamid oder DNA Agarose-gel in einer Lösung aus 1 X (entspricht 2,0 µM) SYBR Green ich (SG ich) und 0,20 mM Nitro blau Tetrazoliumsalz, die eine lila produziert Niederschlag von Formazan bei Sonneneinstrahlung oder speziell blaues Licht. Auch wurden DNA-Recovery Tests durchgeführt mit einem Ampicillin resistent Plasmid in einem Agarosegel mit unserer Methode befleckt. Eine größere Zahl von Kolonien wurde erreicht mit unserer Methode als mit traditionellen Färbung mit SG ich mit UV-Beleuchtung. Das beschriebene Verfahren ist schnell, spezifisch und nicht toxisch für DNA-Nachweis, so dass Visualisierung von Biomolekülen mit dem "bloßen Auge" ohne ein Transilluminator und ist billig und für den mobilen Einsatz geeignet. Aus diesen Gründen hat unsere neue DNA Färbung Methode potenzielle Nutzen für Forschung und Industrie.

Einleitung

Mit den Fortschritten in der Biochemie und Molekularbiologie haben die Studien mit DNA bessere Techniken zur DNA Analyse erforderlich. Die erste Methode für DNA-Färbung wurde Silber Färbung, die sehr empfindlich ist, aber ermangelt Selektivität und erlaubt keine Probenrückgewinnung. Später, erlaubt die Entwicklung von fluoreszierenden DNA-Färbung die selektive Quantifizierung der DNA mit der Möglichkeit der Probenrückgewinnung. Eines der ersten Fluoreszenzfarbstoffen verwendet für DNA-Quantifizierung war Interkalation Bromid¹, mutagene². Allerdings gibt es nun verbesserte fluoreszierende Farbstoffe, die sicherer und empf....

Protokoll

1. Vorbereitung und Ausführung der Gel

1. Bereiten Sie die nicht Denaturierung 12 % Polyacrylamid-Gel Gele Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) Rezept fand in Sambrook und Russell¹⁴ , aber mit Wasser anstelle von SDS.
   1. Verwenden Sie um 5 mL Lösung Gel vorzubereiten, 1,7 mL destilliertem Wasser, 2 mL Acrylamid/Bis-Acrylamid (30/0,8 % w/V), 1,3 mL 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL 10 % Ammonium bleichen und 0,002 mL TEMED.
   2. Zur Vorbereitung verwenden 2 mL Stapeln Gel 1,5 mL Wasser 0,33 mL Acrylamid/Bis-Acrylamid (30/0,8 % w/V), 0,25 mL 1 M Tris pH 6.8, 0,02 mL 10 % Ammonium bleichen und 0,002 mL TEMED....

Ergebnisse

Ein violette Formazan Niederschlag erscheint (verifiziert durch Massenspektrometrie¹³) wo die DNA befindet. Im Experiment wurde eine DNA-Leiter geladen zu einer Kalibrierkurve (Abbildung 3). Das Protokoll arbeitet für Acrylamid und Agarose Gele, aber es hat eine geringere Intensität und nimmt eine längere Zeit in Agarose. Jedoch die Verwendung von Agarose-Gele ermöglicht die Rückgewinnung der Probe mit einem kommerziell erhältlichen Ki.......

Diskussion

Eine sensible und Roman DNA Färbung Methode anhand der Reduzierung der NBT und die Verwendung von SG, die ich in diesem Artikel vorgestellt wurde. Der entscheidende Schritt in diesem Protokoll ist die Inkubationszeit des Gels in der NBT-SG ich Lösung und die Konzentration der NBT. Die Färbung Agarose-Gele dauert länger als bei Acrylamid Gele wegen der größeren Dicke Agarose-Gele. Diese Methode funktioniert nicht gut im Beisein von SDS, wie NBT mit ihm in Berührung ausfällt. Wenn das Gel einen violetten Hintergrund erhält.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nitroblau, Tetrazolium	Gold Biotechnology	298-83-9	Reagenz, das bei der Färbung
verwendet wurde SYBR Green I 10000X	Thermo-Fisher	S7563	Reagenz, das bei der Färbung verwendet wurde
Gel-Extraktionskit	QIAGEN	28704	zur Extraktion von Plasmid aus dem Gel im Integritätsassay
DNA-Leiter Thermo-Fisher		SM 1331	wird zur Erstellung von Kalibrierkurven und als Referenz für das Durchtrennen der Bande im Integritätsassay verwendet
Agar Agar	Merck		wird zur Herstellung von LB-Ampicillin-Kulturplatten verwendet
Natriumchlorid	Merck	1064045000	zur Herstellung von LB-Ampicillin-Kulturplatten verwendet
Hefeextrakt	Becton, Dickinson and Company	212750	zur Herstellung von LB-Ampicillin-Kulturplatten verwendet;
Pepton	Merck	72161000	zur Herstellung von LB-Ampicillin-Kulturplatten
TEMED	AMRESCO	761	zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen,
Ammoniumpersulfat,	Calbiochem	2310	zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen,
Acrylamid-Invitrogen		15512-023	zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen,
Bisacrylamid	SIGMA	146072	zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen,
Tris-Base,	Merck	1083821000	zur Herstellung von TAE-Puffer und nicht denaturierendem Polyacrylamid-Gel Tris-HCl-Puffer
EDTA	J.T. Baker	8993-01	zur Herstellung von TAE-Puffer Essigsäure
	Merck	1.000.632.500	zur Herstellung von TAE-Puffer
Agarose	Merck	16802	zur Herstellung von TAE-Puffer-Spektralphotometer
	Tecan	infinite 200 pro	zur Quantifizierung von DNA-Plasmid
Wasseraufbereitungseinheit	Merck	Elix 100	zur Herstellung von Wasser Typ 1 (ASTM), das in der Spektrophotometrie und DNA-Verdünnungen verwendet wird.
Destilliertes Wasser		,	in Gelen, Nährmedium, Färbungen und allgemeinen Lösungen verwendet
wird HCl	J.T. Baker	9535-03	zur Herstellung von nicht denaturierendem Polyacrylamid-Gel Tris-HCl-Puffer
6X DNA-Ladefarbstoff	Thermo-Fisher	R0610
5 mm blaue LED	Jinyuan Elektronik	SP-021	Lichtquelle, die in der Integritätsassay-Protoplatine
	KANDH	KH102	Lichtquellenunterstützung und Schaltung verwendet wird
9-V-Batterie	Duracell	-	zur Stromversorgung der horizontalen
Elektrophoresekammer	Biorad	1704486EDU	zur Herstellung und zum Betrieb von Agarosegel im Integritätsassay
Vertikales Elektrophorese-Kit	Biorad	1658002EDU	zur Herstellung und Ausführung von Polyacrylamid-Gelen in Kalibrierkurven
Stromversorgung	Biorad	1645050	Wird zur Stromversorgung der Elektrophorese verwendet