Gesättigte Fettsäuren induzieren Ceramid-assoziierten Makrophagen Zelltod

Zusammenfassung

Wir zeigen eine geradlinige Methode murine primären Makrophagen von Knochenmarkzellen zur Ableitung und eine einfache Methode zur Vorbereitung von BSA-Fettsäure konjugiert. Dann zeigen wir, dass gesättigter Fettsäuren Makrophagen Zelltod induzieren können, und solchen Zelltod positiv assoziiert mit zellulären Akkumulation von Ceramid-Ebenen ist.

Zusammenfassung

Makrophagen express hoch epidermale Fettsäure-bindendes Protein und Fett Fettsäure-bindendes Protein. Sie aktiv Aufnahme gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Immunfunktionen spielen könnte. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass verschiedene Fettsäuren, gesättigt oder ungesättigt, können unterschiedliche Auswirkungen auf das Zellwachstum und die Funktion besitzen. Allerdings variieren die Ansätze für die Fettsäure-Vorbereitung zu unphysiologischen Ergebnissen führen kann. Serum-Albumin, natürliche Träger für Fettsäuren in peripheren Säugetierblut wird empfohlen zur Bildung einer konjugiert komplex mit das Natriumsalz von Fettsäuren, Fettsäure-Funktion in Säugerzellen, minimiert die Toxizität von Fettsäure-Seife zu untersuchen. Somit ist eine einfache, relativ schnelle Heizung und beschallen Methode entwickelt und präsentiert hier für BSA-Fettsäuren konjugierte Säurebildung. Wir beschreiben ein Protokoll mit gesättigten Fettsäuren, vor allem Stearinsäure Säuren zu schweren Zelltod in der Maus Knochenmark abgeleitet Makrophagen induzieren. Wir zeigen weiter, dass gesättigte Fettsäure-induzierte Zelltod mit kumulierten zellulären Ceramid-Spiegel positiv assoziiert ist. Diese Methode kann für Studien über die Auswirkungen der Fettsäure auf andere Säugetier-Zellen erweitert werden.

Einleitung

Fettsäuren spielen eine wichtige Rolle im Energiestoffwechsel und in der Synthese der Phospholipide der Membran in verschiedenen Arten von Zellen. Fettsäuren haben eine geringe wässrige Löslichkeit. Entsprechende Vorbereitung der Fettsäure ist von entscheidender Bedeutung für die Erforschung der biologischen Funktionen der Fettsäuren in Säugerzellen. Wenn Fettsäuren mit Ethanol vorbereitet sind, kann viele Fettsäuren ihre giftigen Seife (Reinigungsmittel) Wirkung auf die Zellmembran, auch bei relativ niedrigen Konzentrationen¹angezeigt. Als natürliche, große Transporter für die freien Fettsäuren im Serum gilt als Serum-Albumin einen guten Träger für Fettsäure-Lieferung in Vitro für Fettsäure Funktion Assays^2,3,4. Jedoch sind die Details der Vorbereitung der Fettsäure und Serum-Albumin-Konjugat in der Regel nicht verfügbar, obwohl viele Forschungsarbeiten mit Fettsäuren veröffentlicht worden sind.

Makrophagen express hoch epidermale Fettsäure-bindendes Protein und Fett Fettsäure-bindende Protein^5,6,7,8. Sie aktiv Aufnahme gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, die ihre Immunfunktionen regulieren kann. Um die Wirkung von Fettsäuren auf Makrophagen und andere Zellen zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden der Fettsäure Vorbereitung angewandte^1,7,9. Mit entsprechend vorbereitete Fettsäure/Serum-Albumin-Konjugate, um die Wirkung von Fettsäuren auf Makrophagen Funktion zu untersuchen, ist von entscheidender Bedeutung in biologisch sinnvolle Daten zu erhalten. Studien über die Auswirkungen der Fettsäuren auf Makrophagen Funktion bieten Grundkenntnisse und mögliche therapeutische Ziele in Bezug auf Fettsäure-Stoffwechsel bei Erkrankungen Makrophagen beteiligt.

Protokoll

das Protokoll von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of Louisville gebilligt wurde.

1. Maus Knochenmark abgeleitet Makrophagen (BMDMs)

1. einschläfern eine 6 bis 8 Wochen alten, gesunden Wildtyp-Maus mit CO ₂. Heften Sie es auf eine Dämmplatte und sprühen Sie es mit 70 % Ethanol, bis es getränkt ist. Entfernen Sie die Tibia/Femur-Knochen mit Zange und Schere. Setzen Sie sie in einer Petrischale mit 5 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Führen Sie alle Verfahren unter sterilen Bedingungen.
2. Aufschneiden beide Enden der Tibia/Femur-Knochen mit einer Schere in einem sterilen Gewebekultur-Haube. Spülen Sie den Knochen mit einer 25 G Nadel mit PBS + 2 % fetalen bovine Serum (FBS) in einem 15 mL-Tube.
3. Zentrifugieren Sie die Knochenmarkzellen 500 X g, 4 ° C für 5 min.
4. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL roten Blutzelle Lysis Puffer zur lyse der Erythrozyten (RBC) für weniger als 1 min. sofort mit 9 mL 1 X PBS verdünnt. Zentrifuge wieder wie in Schritt 1.3. Die Überstände dekantieren.
5. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL 1 X PBS, filtern die Zellsuspension durch eine sterile 40 μm-Nylon-Netzgewebe in einem anderen 15 mL-Tube, Zelle Schutt/Klumpen zu entfernen. Zentrifuge wieder wie in 1.3. Die Überstände dekantieren.
6. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 15 mL Roswell Park Memorial Institute mittlerer (RPMI) 1640 mit 5 % FBS und 10 μg/mL Gentamicin, Platte, die die Zellen in der Kulturschale von 100mm Gewebe am 37 ^o C-Inkubator für 60 min. Wirbel sanft das Gericht, die schwimmende herausnehmen Zellen, und zähle sie.
7. Platte 6 x 10 ⁶ Zellen in einer 100-mm-Schale mit 12 mL Makrophagen differenzieren Medien (RPMI 1640 mit 5 % FBS und 10 μg/mL Gentamicin, gemischt mit 30 % L929 konditionierten Media ¹⁰) mit 10 ng/mL rekombinanter Maus Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) für 2 Tage.
8. Nach Kultivierung für 2 Tage in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO ₂, füttern Sie jedes Gericht mit 6 mL frische Makrophagen differenzieren Medien mit 10 ng/mL M-CSF.
9. Am Tag 5, 8 mL der alten Medien, ohne die Zellen zu stören und fügen 10 mL frisches Makrophagen differenzieren Medien mit 10 ng/mL M-CSF.
10. Am 7. Tag ernten die Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) mit einer Zelle Heber.
    Hinweis: Angehängte Makrophagen können auch mit 5 mL 1 mM EDTA mit 1 X PBS-Puffer für 5 bis 10 min losgelöst werden nach dem Entfernen der Float-Zellen und Platte zweimal mit 5 mL 1 X PBS waschen. Zentrifugieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.3., Aufschwemmen sie in frische Makrophagen, die Medien zu unterscheiden und mit einer Hemocytometer zu zählen.
    1. Bestätigen die BMDMs ' Phänotyp durch Durchflusszytometrie als ⁵ beschrieben. Vorbereiten der abgeleiteten Maus Makrophagen in einer bestimmten Konzentration für die folgenden Studien.

2. BSA-fetthaltige Säure konjugieren Vorbereitung

1. vorbereiten 2 mM BSA in sterilen PBS. Zum Beispiel wiegen 6,65 g BSA, hinzufügen 30 mL 1 X PBS aufzulösen, fügen Sie mehr PBS bis 50 mL Skalierung Komponenten um 2 mM BSA in 1 X PBS zu machen.
2. Vorbereitung 5 mM individuelle Natriumsalz der Fettsäuren in 2 mM BSA. Heizen auf 37 ° C oder höher, wenn nötig, und beschallen die Mischung von 2 mM BSA und Natriumsalz von Fettsäuren, bis eine klare Lösung erhalten wird.
   Hinweis: Im Vergleich zu ungesättigten Fettsäuren, gesättigter Fettsäuren benötigen eine höhere Temperatur und weitere Beschallungsdauer für auflösen.
3. Filter die Fettsäuren-Säure-BSA-Lösung durch einen 0,22-μm-Filter, aliquoten es in 1,5 mL sterile Microcentrifuge Rohre, und speichern sie bei 4 ° C für den kurzfristigen Einsatz oder bei-20 ° C für langfristige Lagerung. Kein Niederschlag nach Lagerung bei 4 ° C im Kühlschrank beachtet werden.

3. Gesättigte Fettsäuren induzieren Zelle Tod der Maus Knochenmark abgeleitet Makrophagen

1. BMDMs in einer Gewebekultur 24-Well-Platte-Platte mit 0,4 x 10 ⁶ /mL in Makrophagen differenzieren Medien.
2. Behandlung der Zellen mit 0,4 mM Palmitinsäure und Stearinsäure für 16 bis 24 h bei 37 ° C-Inkubator mit 5 % CO ₂. BSA zu verwenden, als die Negativkontrolle.
3. Ernte der Zellen mit einer Zelle Lifter nach Behandlung und spin-down der Zellen bei 500 X g, 4 ° C für 5 min.
4. Beflecken Zellen mit Annexin V-Alexa 488 und 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) in 100 μL annexin V Bindung Puffer für 15 min bei Raumtemperatur.
5. Die Probe mit 200 µL annexin-Bindung Puffer verdünnen, vorsichtig mischen, dann halten Sie die Proben auf Eis nach der Inkubationszeit.
6. Analysieren die gefärbten Zellen so bald wie möglich durch Flow Cytometry ⁵. Annexin V-Alexa 488 in FITC Kanal erkannt und 7-AAD in PerCP/PerCP-Cy5.5-Kanal erkannt wird.

4. Intrazelluläre Ceramid Färbung

1. nach der Fettsäure-Behandlung, die Zellen wie in Schritt 3.3 ernten. Befestigen Sie die Zellen in 4 % Paraformaldehyd für 30 min.
2. Die Probe mit 1 mL 1 X PBS waschen, spin-down als Schritt in 3.3 und dekantieren des Überstandes.
3. Die Zellen mit Anti-Ceramid Primärantikörper (Verdünnung 1: 200) in 100 μl 1 X Permeabilisierung Puffer für 30 min. Färben
4. Waschen und Spin down die Zellen wieder wie in Schritt 4.2.
5. Die Zellen mit Anti-Maus IgM Sekundärantikörper (Verdünnung 1: 500) in 100 μl 1 X Permeabilisierung Puffer für 30 min. Färben
6. Waschen und Spin down die Zellen wieder wie in Schritt 4.2. Fügen Sie 250 μl 1 X PBS und analysieren die gefärbten Zellen von Flow Cytometry ⁵.
   Hinweis: Finden Sie die detaillierte Reagenz-Liste in der Tabelle von Geräten und Reagenzien.

Ergebnisse

Fettleibigkeit erhöht freie Fettsäure-Konzentrationen im Serum. Als professionelle Phagozyten aufgreifen Makrophagen aktiv Fettsäuren zu Host Homöostase. Bei diesen Prozessen können überladene Lipide Makrophagen Zelltod auslösen. Zu diesem Zweck wir BMDMs kultiviert in Vitro mit übergewichtigen diätetischen Fettsäuren und gemessenen Makrophagen Zelltod mit Flow durchflusszytometrischen Färbung. Im Vergleich zur BSA-Kontrolle, gesättigten Fettsäuren, induziert insbesondere Stearin...

Diskussion

Die richtige Vorbereitung der Fettsäure-Lösung ist von entscheidender Bedeutung für die biologische Funktion von Fettsäuren zu studieren. Die Neutralisation der Fettsäuren erhöht die Löslichkeit in wässriger Lösung. Natriumsalze der Fettsäuren, vor allem gesättigte Fettsäuren, sind jedoch noch der geringe Löslichkeit in Wasser oder PBS, wie wir beobachten. Eine Methode ist mit 95-100 % Ethanol helfen Fettsäure¹auflösen. Mit dieser Methode kann auch bei niedrigeren Konzentrationen für weniger gifti...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CPX Ultraschallbad	Bransonic	Modell 2800
Natriumpalmitat (PA)	Nu-Chek Prep, Inc.	S-1109	M.W. 278
Natriumstearat (SA)	Nu-Chek Prep, Inc.	S-1111	M.W. 306
Rinderserumalbumin (BSA), fettsäurefrei	Fisher Scientific	9048-46-8
Maus-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (mM-CSF)	Zellsignaltechnologie  Inc.	5228
RPMI 1640	VWR International	71002-878
Annexin V, Alexa Fluor 488 Konjugat	Fisher Scientific	A13201
7-AAD	BD Biosciences	559925
Monoklonaler Anti-Ceramid-Antikörper (Maus IgM)	Sigma	C8104-50TST	Klon: MID 15B4
Ziege Anti-Maus IgM Antikörper & Mikrokette, FITC Konjugat	Sigma	AP128F
Fixierungspuffer	Biolegend	420801
Permeabilisierungspuffer	Ebioscience	4307693
Lysepuffer für rote Blutkörperchen	Sigma	11814389001
Annexin V Binding Buffer	BD Biosciences	556454
L929 Zellen	ATCC	CCL-1
Corning  Zell-Lifter	Fisher Scientific	07-200-364
Hinweis: M.W. steht für das Molekulargewicht.