Visualisierung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die gleichzeitige Darstellung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde. Individuelle Thalamocortical Axone und ihre präsynaptischen Terminals werden durch eine einzelne Zelle Elektroporation Technik mit DsRed und GFP-Tags Synaptophysin visualisiert.

Zusammenfassung

Axon verzweigen und Synapse Bildung sind entscheidende Prozesse für die Festlegung der genauen neuronale Schaltkreise. Während der Entwicklung bilden sensorische Thalamocortical (TC) Axone Zweige und Synapsen in bestimmten Schichten der Großhirnrinde. Trotz der offensichtlichen räumliche Korrelation zwischen Axon verzweigen und Synapse Bildung ist die kausale Beziehung zwischen ihnen kaum verstanden. Um dieses Problem zu beheben, haben wir vor kurzem eine Methode für die gleichzeitige Darstellung von Verzweigungen und Synapse Bildung von individuellen TC Axone in organotypischen Kokulturen entwickelt.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode besteht aus einer Kombination von organotypischen Coculture und Elektroporation. Organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde erleichtern, Genmanipulation und Beobachtung der axonalen Prozesse, Erhaltung der charakteristischen Strukturen wie laminar Konfiguration. Zwei unterschiedliche Plasmide Codierung DsRed und Verschlagwortet mit EGFP Synaptophysin (SYP-EGFP) wurden Co transfizierten in eine kleine Anzahl von Thalamische Neurone durch Elektroporation-Technik. Diese Methode erlaubt uns, individuelle axonalen Morphologien von TC Neuronen und ihren präsynaptischen Websites gleichzeitig visualisieren. Die Methode aktiviert auch Langzeit-Beobachtung, der den ursächlichen Zusammenhang zwischen Axon verzweigen und Synapse Bildung offenbart.

Einleitung

Die Thalamocortical (TC) Projektion in das Gehirn von Säugetieren ist ein geeignetes System, Axon Guidance und targeting Mechanismen zu untersuchen. Während der Entwicklung wachsen sensorische TC Axone in die kortikale Platte und Form Zweige und Synapsen bevorzugt in Schicht IV der primären sensorischen Bereiche in der Großhirnrinde^1,2. Auch nach Gründung der grundlegenden Verbindungen sind abhängig von Veränderungen der Umwelt^3,4axonalen Lauben und synaptischen Terminals umgebaut. Jedoch wie TC Axon Morphologie dynamisch geändert ist schlecht verstanden. Einer der Hauptgründe ist das Fehlen einer angemessenen Technik, strukturelle Veränderungen auf eine einzelne Zellenebene zu beobachten. Obwohl jüngste Entwicklungen in der Mikroskopie, wie zwei-Photonen-Mikroskopie, direkten Beobachtung von lebenden kortikale Neuronen in Vivoerlaubt haben, gibt es noch technische Einschränkungen für die Erfassung der gesamten TC Trajektorien^{5, 6}. daher, in-vitro- Methoden für live Aufnahmen von TC Axone böte leistungsstarke Tools für Strukturanalysen der Axon verzweigen und Synapse Formation.

Unsere Gruppe zum ersten Mal gegründet eine statische Slice-Kultur-Methode mit durchlässige Membran⁷. Mit dieser Methode eine Ratte kortikalen Scheibe war mit einem sensorischen Thalamische Block cocultured und Lamina-spezifische TC Verbindungen wurden in diesem organotypischen Kokulturen^7,8zusammengefaßt. Spärliche Beschriftung mit einem fluoreszierenden Protein weiter konnten wir beobachten, TC Axon Wachstum und Zweig Bildung^9,10,11. Vor kurzem haben wir eine neuartige Methode zur gleichzeitigen Darstellung von Verzweigungen und Synapse Bildung von individuellen TC Axone in die organotypischen cocultures¹². Um TC Axone und präsynaptischen Websites gleichzeitig visualisieren, waren DsRed und Verschlagwortet mit EGFP Synaptophysin (SYP-EGFP) Co transfizierten in eine kleine Anzahl von Thalamische Neurone durch Elektroporation organotypischen Coculture. Die aktuelle Methode morphologische Analyse des TC Axone erleichtert und ermöglicht eine langfristige Beobachtung, die verwendet werden können, um den ursächlichen Zusammenhang zwischen Axon verzweigen und Synapse Bildung zu zeigen.

Protokoll

Alle Versuche wurden nach den Richtlinien festgelegten Tierschutz Ausschüsse von Universität von Osaka und Japan Neurowissenschaftliche Gesellschaft durchgeführt.

(1) organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde

Hinweis: Die detaillierte Vorgehensweise finden Sie in der ursprünglichen Publikationen^7,8,13. Alle Verfahren sollte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Sprague-Dawley (SD) Ratten werden für neuronale Kulturen verwendet.

1. Vorbereitung der Reagenzien
   Hinweis: Bände der folgenden Reagenzien sind für eine Rattengehirn.
   1. Vorbereitung 10 x modifizierte N2-Ergänzung ¹³: Insulin (50 μg/mL), Progesteron (200 nM), Hydrocortison (200 nM), Natriumselenit (300 nM), Transferrin (1 mg/mL), Putrescin (1 mM), Glukose (60 mg/mL)
   2. Prepare Serum-haltigen Kulturmedium (10 mL): 85 % DMEM/F12, 10 X geändert N2 Zuschlag von 10 %, 5 % fetalen bovine Serum (FBS)
   3. Prepare serumfreien Kulturmedium (20 mL): 90 % DMEM/F12, 10 X geändert N2 Zuschlag von 10 %
   4. Bereiten Sie Ratte Schweif Kollagen Lösung (0,5 mL). In Kürze nehmen zartere Fasern aus einem Rattenschwanz unter sterilen Bedingungen und brüten in Essigsäure-Lösung über Nacht. Nach Zentrifugation den überstand (ein paar mg/mL) erheben und speichern in einem Kühlschrank-¹³.
2. Zubereitung von Speisen Kultur
   1. Legen Sie einen Membran-Einsatz in einer 35 mm Petrischale.
   2. Die Membran 40-50 μL der Ratte Schweif Kollagen-Lösung hinzu, und verbreiten Sie die Kollagen-Lösung um das Zentrum herum zu.
   3. Die Membran vollständig in einer sauberen Werkbank der Luft trocknen lassen.
   4. Setzen Sie 1,5-2 mL Serum-haltigen Kulturmedium in die Schüssel, so dass die Membran mit dem Medium getränkt ist.
   5. Legen Sie die Kulturschale in einem Inkubator (37 ° C, feuchte Luft von 95 % und 5 % CO₂) vor der Beschichtung.
3. Vorbereitung der kortikalen Scheiben
   1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit 70 % igem Ethanol für 10 min oder länger.
   2. Sezieren das ganze Gehirn schnell von einem postnatalen Tag (P) 2 Ratte eiskalte Narkose (mitten in der Eis-Chips für ein paar Minuten).
   3. Ort des Gehirns in eine 100 mm Petrischale mit 100 mL kaltem Hanks ausgewogen Salzlösung.
   4. Die Pia Angelegenheit aus dem Gehirn zu entfernen, mit feinen Zangen und kortikale Scheiben (300-400 μm Dicke) aus der visuellen und somatosensorischen Kortex mit mikrochirurgischen Schere schneiden (für Details siehe Abbildung 1).
      Hinweis: Die Dicke der kortikalen Scheiben wird durch das Ausmaß der Netze unter einem Binokular grob geschätzt.
      Hinweis: Alternativ können kortikale Scheiben mit einem Vibratome unter sterilen Bedingungen erfolgen.
   5. Ein paar kortikale Scheiben auf die Membran-Einlage mit einer Einweg-Kunststoff-Pipette zu übertragen.
   6. Stellen Sie die Positionen der Scheiben in der Mitte des Kultur-Einsatzes mit einer feuerpolierte Pasteurpipette (für Details, siehe^8,13) und entfernen Sie überschüssiges Mittel aus dem einfügen.
      Hinweis: Der Pegel des Mediums etwas unterhalb der Oberfläche der Scheiben, so dass die Scheiben eine ausreichende Versorgung mit Gas und Medium erhalten können. Dies ist entscheidend für die Zellviabilität.
   7. Pflegen Sie die Scheiben in der Serum-haltigen Nährmedium bei 37 ° C in einem Umfeld von befeuchtete 95 % Luft und 5 % CO₂und Kultur allein für einen Tag, bevor ein Thalamische Block genommen und daneben platziert.
4. Vorbereitung der Thalamische Blöcke
   1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit 70 % igem Ethanol für 10 min oder länger.
   2. Eine schwangere Ratte (embryonale 15.Tag) durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (50 mg/kg), enthält Betäubungsmittel zu betäuben.
   3. Sezieren Sie jedes Embryo aus den uterinen Hörnern zu, und legen Sie die Embryonen in einem 100 mm Petrischale mit 100 mL kaltem Hanks ausgeglichene Salzlösung.
   4. Unter einem Binokular das Gehirn von jedem Embryo und schneiden Sie Thalamische Blöcke enthalten vor allem die Ventrobasal komplex und seitlichen gekniet Kern (ca. 0,5 mm x 3)⁷ mit mikrochirurgischen Schere (siehe Abbildung 1).
5. Kultur und pflegen organotypischen Kokulturen
   1. Mit einer Pasteurpipette, legen Sie die Thalamische Block neben der ventrikulären Oberfläche der kortikalen Schicht auf die Membranfilter erteilte.
   2. Pflegen Sie die Kokulturen in das Serum-haltigen Nährmedium bei 37 ° C in einem Umfeld von befeuchtete Luft von 95 % und 5 % CO₂.
   3. Tauschen Sie die Hälfte des Mediums mit dem Kulturmedium serumfreien nach zwei Tagen in der Kultur. Danach tauschen Sie das Medium alle 2-3 Tage.
      Hinweis: Das Niveau des Mediums sollte nach den Datenträgeraustausch überprüft werden, da es wichtig für das Überleben der Zelle.

(2) Elektroporation

Alle Verfahren sollte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

Hinweis: Führen Sie durch Elektroporation einen Tag nach der Vorbereitung der Thalamische Blöcke, Ablösung der Blöcke zu verhindern.

1. Plasmide
   1. Machen Sie eine Mischung aus Plasmide wie folgt: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
      Hinweis: Die beiden Plasmide mit einem Endotoxin-freie Maxiprep-Kit zu reinigen und in Hanks ausgeglichene Salzlösung auflösen.
2. Elektroporation Gerät einrichten
   Die elektrischen Instrumente wie ein Stimulator und ein Isolator sollte angeschlossen werden, wie in Abbildung 2dargestellt.
   1. Verbinden Sie den Stimulator mit biphasischen Isolator.
   2. Verbinden Sie eine Elektrode (ein Silberdraht 0,2 mm Durchmesser) mit dem Minuspol des Isolators.
   3. Eine Elektrode (ein Silberdraht 1 mm Durchmesser) in Reihe zu einem 100 Ω Widerstand und der Pluspol des Isolators anschließen.
   4. Verbinden Sie den Verstärker mit dem Oszilloskop zu überwachen, ob elektrische Ströme über den Widerstand übergeben werden, durch die Messung der Spannung mit dem Verstärker.
3. Vorbereitung von Glaspipetten
   Hinweis: Zwei Arten von Glaspipetten Auswurf der Plasmid-Lösung und Anwendung elektrischer Impulse dienen.
   1. Machen Sie die Pipetten von Glaskapillaren mit einer Elektrode Abzieher.
   2. Die Tipp für die Auswurf-Pipette (der Kopfkreis sollte 20-50 μm) zu brechen.
   3. Schleifen Sie und Polieren Sie der Elektrode Pipettenspitze mit Sandpapier gefolgt von Feuer-polieren (der innere Durchmesser sollte 50-200 µm).
      Hinweis: Die Elektrodenspitze sollte flach und glatt, wie es das Gewebe direkt berührt.
4. Verfahren der Elektroporation
   1. Verbinden Sie die Auswurf und Elektrode Pipetten mit der Manipulatoren.
   2. Legen Sie ein Silberdraht (0,2 mm Durchmesser) in die Elektrode Pipette.
   3. Legen Sie die Auswurf-Pipette auf eine 1 mL Spritze mit einem Kunststoffrohr.
   4. Nehmen Sie > 5 μl Plasmid-Lösung in die Auswurf-Pipette durch Spritze absaugen.
   5. Legen Sie die Coculture auf der Bühne Elektroporation, und legen Sie die 1 mm Durchmesser Elektrode in das Kulturmedium.
   6. Legen Sie die Auswurf-Pipette auf die Thalamische Explant.
   7. Schieben Sie die Spritze manuell, nachdem die Spitze die Oberfläche des Thalamische Blocks berührt.
      Hinweis: Über 0,5 μL des Plasmids wird die Lösung in der Regel pro Thalamische blockweise eingesetzt.
   8. Legen Sie die Elektrode Pipette auf Thalamische Block unmittelbar nach der Rücknahme der Auswurf Pipette.
   9. Elektrische Impulse (50-400 μA, 3 bis 5 Züge der 200 Quadratmeter Impulse von 1 ms Dauer bei 200 Hz) zu liefern. Die Amplitude und die Anzahl der Züge auf dem Oszilloskop zu überwachen.
      Hinweis: Die Amplitude der elektrischen Ströme hängt von der Innendurchmesser eine Elektrode Pipette¹³.
   10. Die Elektrode Pipette zurückziehen und das Gericht in den Inkubator zurück.
5. Mikroskopische Beobachtung
   1. Setzen der Kulturschale auf einer mikroskopischen Bühne eine aufrechte confocal Mikroskop, ausgestattet mit zwei Filter-Sets für EGFP (Erregung, 488 nm, Emission, 515 nm) und DsRed (Erregung, 514 nm, Emission, 565 nm).
   2. Nehmen Sie Bilder von 10-25 optischen Abschnitte am 1-7 µm-Schrittweiten mit einem 20 X lange arbeitende Abstand Objektiv. Wählen Sie individuell unterscheidbar beschrifteten Axone die DsRed und SYP-EGFP ausdrücken.
      Hinweis: Die beobachteten Bereich ist ca. 0,7 x 0,7 mm (entspricht 1024 x 1024 Pixel, d. h., 0,68 μm/Pixel).
   3. Die Aufnahmen Sie alle 24 h für die tägliche Bildgebung. Innerhalb von 10 min bei Raumtemperatur, und schicken Sie die Kulturen in den Inkubator. Halten Sie für kurz-Intervallzeit Zeitraffer Bildgebung die Kultur in einer Kultur-Kammer, die behauptet, dass die Umwelt von 95 % Luft und 5 % CO₂ bei 37 ° c befeuchtet

Ergebnisse

Das Experiment beschriebenen hier zielt darauf ab, die Beziehung zwischen TC Axon verzweigen und Synapse Bildung zu offenbaren. Um gleichzeitig visualisieren axonalen Flugbahnen und Standorte der präsynaptischen Seiten, einzelne oder wenige Thalamische Zellen in organotypischen Kokulturen wurden mit zwei Plasmide Codierung SYP-EGFP und DsRed mit Elektroporation transfiziert. In der zweiten Woche in Kultur wurden individuell unterscheidbar TC Axone durch DsRed (Abbildu...

Diskussion

Das aktuelle Protokoll ist auch ein leistungsfähiges Werkzeug, Entwicklungsaspekte der wachsenden Axone anders als der TC Projektion¹¹zu studieren. Zum Beispiel ermöglicht eine Kombination der kortikalen Stück Kultur und die Elektroporation Technik Visualisierung einzelner axonalen Morphologie der kortikalen Neuronen und langfristige Beobachtung^9,18.

Mithilfe des aktuellen Protokolls können die Rollen von intere...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM/F12	GIBCO	11320-033
Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS)	Nissui	5905
Fötales Rinderserum (FBS)	Thermo Scientific	SH30396-03	Hyklon
	Insulin Sigma	I6634
Progesteron	Sigma	P8783
Hydrocortison	Sigma& nbsp;	H0888
Natriumselenit	Wako Pure Chemische Industrie	192-10843
Transferrin	Sigma	T1147
Putrescin	Sigma	P5780
Glucose	Wako Pure Chemical Industries	16806-25
35 mm Petrischalen	Falcon	351008
Millicell-CM Einsatz	Millipore	PICMORG50
100 mm Petrischalen	BIO-BIK	I-90-20	Petrischale sterrile
HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen
Sterile Einwegpipetten aus Kunststoff	202-IS	Transferpipetten
Glaskapillare: AD 1,2 mm	Narishige	G-1.2	Innendurchmesser, 1.2 mm
Silberdraht: 0.2 und 1 mm	Nilaco	AG-401265 (Durchmesser, 0,2 mm), AG-401485 (Durchmesser, 1,0 mm)
1 mL Spritze	Terumo	SS-01T
Stimulator	A.M.P.I	Master 8
Biphasischer Isolator	BAK ELECTRONICS	BSI-2
Verstärker	A-M Systems	Modell 1800
Oszilloskop	Hitachi	VC-6723
Manipulator	Narishige	SM-15
Mikromanipulator	Narishige	MO-10
Stereomikroskop	Olympus	SZ40
Universal-Standfuß	Olympus	SZ-STU2
Lichtbeleuchtungssystem	Olympus	LG-PS2, LG-DI, HLL301
Elektrodenabzieher	Narishige	PC-10
Konfokalmikroskop	Nikon	Digital Eclipse C1 Laser
x20 Objektiv	Nikon	ELWD 20x/0,45
Kulturkammer	Tokai Hit	UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) Ratte	Japan SLC und Nihon-Dobutsu
Mikrochirurgie-Schere	Natsume	MB-54-1