Methodenartikel

Charakterisierung der Zellmembran Erweiterungen und studieren ihre Rolle im Krebs Zelle Adhäsion Dynamik

DOI:

10.3791/56560

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26. März 2018

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1Department of Surgery & Yale Endocrine Neoplasia Laboratory, Yale University School of Medicine, 2Yale New Haven Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Studie zeigt den nutzen und die einfache quantitative Zellmembran Erweiterung Messung und ihre Korrelation zum Klebstoff Kapazität von Zellen. Als ein repräsentatives Beispiel zeigen wir hier der Dickkopf-related Protein 3 (DKK3) fördert erhöhte Pseudopodien Bildung und Zelle Haftfähigkeit in NNR Karzinom-Zellen in Vitro.

Zusammenfassung

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Die Zellmembran Erweiterung Repertoire moduliert verschiedene bösartige Verhaltensweisen von Krebszellen, einschließlich ihrer Klebe- und wandernden Potenziale. Die Fähigkeit, genau zu klassifizieren und Zelle Erweiterungen zu quantifizieren und die Wirkung auf eine Zelle Klebstoff Kapazität zu messen ist entscheidend für die Bestimmung, wie Zelle Signalisierung Ereignisse Auswirkungen Krebs Zelle Verhalten und Aggressivität. Hier beschreiben wir die in-vitro- Gestaltung und Nutzung einer Zelle Quantifizierung Erweiterungsmethode in Verbindung mit einem Adhäsion Kapazität Assay in einem etablierten in-vitro- Modell für NNR-Karzinom (ACC). Insbesondere prüfen wir die Auswirkungen der DKK3, eine vermeintliche Tumorsuppressor und pro-Differenzierung Faktor auf der Membran Erweiterung Phänotyp der ACC-Zelllinie, SW-13. Wir schlagen diese Tests bieten relativ einfach, zuverlässig und leicht interpretierbare Metriken, misst diese Eigenschaften unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.

Einleitung

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Dysregulated WNT signalisieren spielt eine entscheidende Rolle in der NNR Malignome1. Die in dieser Studie verwendeten Methoden untersuchen, ob Schweigen der DKK3, ein negativer Regulator der WNT signalisieren, stellt eine Entdifferenzierung Ereignis in der Nebennierenrinde und fördert Tumorbildung im Zusammenhang mit der Zelle-Erweiterung Repertoire Änderungen. DKK3 ist eine 38 kDa Glykoprotein mit einer N-terminalen Signalpeptid abgesondert und frühere Studien haben gezeigt, dass seine erzwungene Ausdruck Zellzyklus Festnahme führte, aggressiven bösartigen Verhaltens gehemmt und epitheliale-mesenchymale umgekehrt Übergang2

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Protokoll

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1. Erweiterung der Zelleigenschaften

  1. Pflegen Sie SW 13, SW-Neo und SW-DKK3 Zellen in einem standard befeuchteten Inkubator bei 37,0 ° C und 5 % CO2 in Dulbeccos geändert Eagle Medium mit 10 % fötalen Rinderserum und 10.000 U/mL Penicillin und Streptomycin (bezeichnet als "Wachstumsmedium") ergänzt.
    1. Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und 5.000 Zellen pro Bohrloch für SW 13, SW-Neo und SW-DKK3 Linien in separaten 6-Well-Platten und wachsen über Nacht im Wachstumsmedium auf sterile Glasdeckgläser.
  2. Nachdem über Nacht Wachstum, für jedes gut Aspirieren das Wachstumsmedium, waschen Sie Zellen mit 1 mL warmen Phospha....

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Ergebnisse

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Unter Verwendung der oben genannten Assays, wurden die Auswirkungen der DKK3 Überexpression auf Verlängerung Zellmorphologie und Zelle Adhäsionseigenschaften in die etablierten ACC-Zellinie SW-13, in Vitrogetestet. DKK3 überexprimierenden Zellen wurden durch stabil transfecting SW-13 Zellen mit Myc-DDK tagged pCMV6-Eintrag/DKK3-Plasmid-Vektoren und als SW-DKK3 erzeugt. Ebenso wurden mit leerer Vektor pCMV6-Eintrag stabil transfizierten Zellen als Transfektion und Passagierung Ste.......

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Diskussion

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Hier beschreiben wir eine in-vitro- quantitative Methode zur Charakterisierung von Zelle Erweiterungen mit Leichtigkeit, paar Grube fällt und zuverlässige Reproduzierbarkeit, die für verschiedene Testbedingungen angewendet werden können. Darüber hinaus können einfache, quantifizierbare Haftung und/oder Motilität Assays gleichzeitig durchgeführt werden, um mögliche funktionale Bedeutung der beobachteten Veränderungen in der Zellmembran Erweiterungen zu korrelieren.

Diese Methoden könne.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die Ohse Grant Foundation finanziert diese Arbeit.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher11965-092Ergänzt mit fötalem Rinderserum und Penicllin und Streptomycin
Deulbeco's phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-AldrichD85371X-Lösung, direkt verwendet
3,7% Formaldehyd Sigma-AldrichF8775Verdünnte Stammlösung
0,05 % KristallviolettHarleco192-12Verdünnte Stammlösung
Deionisiertes WasserNANANA
Mikroskop mit 400-facher Vergrößerung NANANA
6-Well-PlattenCorning353046NA
Zelldissoziationslösung nicht-enzymatisch 1XSigma-AldrichC5914 1X-Lösung, direkt verwendet

Referenzen

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  1. Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
  2. Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Bioch....

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Schlagwörter

NebennierenrindenkarzinomQuantifizierung der ZellextensionAssay zur Adh sionskapazit tFilopodien Lamellipodien LobopodienDKK3 TumorsuppressorSW 13 Zelllinielichtmikroskopische AnalyseKristallviolett F rbung

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