Charakterisierung der Zellmembran Erweiterungen und studieren ihre Rolle im Krebs Zelle Adhäsion Dynamik

Taylor C. Brown; Norman G. Nicolson; Joyce Cheng; Reju Korah; Tobias Carling

doi:10.3791/56560

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Methodenartikel

Charakterisierung der Zellmembran Erweiterungen und studieren ihre Rolle im Krebs Zelle Adhäsion Dynamik

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DOI:

10.3791/56560

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26. März 2018

Taylor C. Brown¹ , Norman G. Nicolson² , Joyce Cheng¹ , Reju Korah¹ , Tobias Carling¹

¹Department of Surgery & Yale Endocrine Neoplasia Laboratory, Yale University School of Medicine, ²Yale New Haven Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie zeigt den nutzen und die einfache quantitative Zellmembran Erweiterung Messung und ihre Korrelation zum Klebstoff Kapazität von Zellen. Als ein repräsentatives Beispiel zeigen wir hier der Dickkopf-related Protein 3 (DKK3) fördert erhöhte Pseudopodien Bildung und Zelle Haftfähigkeit in NNR Karzinom-Zellen in Vitro.

Zusammenfassung

Die Zellmembran Erweiterung Repertoire moduliert verschiedene bösartige Verhaltensweisen von Krebszellen, einschließlich ihrer Klebe- und wandernden Potenziale. Die Fähigkeit, genau zu klassifizieren und Zelle Erweiterungen zu quantifizieren und die Wirkung auf eine Zelle Klebstoff Kapazität zu messen ist entscheidend für die Bestimmung, wie Zelle Signalisierung Ereignisse Auswirkungen Krebs Zelle Verhalten und Aggressivität. Hier beschreiben wir die in-vitro- Gestaltung und Nutzung einer Zelle Quantifizierung Erweiterungsmethode in Verbindung mit einem Adhäsion Kapazität Assay in einem etablierten in-vitro- Modell für NNR-Karzinom (ACC). Insbesondere prüfen wir die Auswirkungen der DKK3, eine vermeintliche Tumorsuppressor und pro-Differenzierung Faktor auf der Membran Erweiterung Phänotyp der ACC-Zelllinie, SW-13. Wir schlagen diese Tests bieten relativ einfach, zuverlässig und leicht interpretierbare Metriken, misst diese Eigenschaften unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.

Einleitung

Dysregulated WNT signalisieren spielt eine entscheidende Rolle in der NNR Malignome¹. Die in dieser Studie verwendeten Methoden untersuchen, ob Schweigen der DKK3, ein negativer Regulator der WNT signalisieren, stellt eine Entdifferenzierung Ereignis in der Nebennierenrinde und fördert Tumorbildung im Zusammenhang mit der Zelle-Erweiterung Repertoire Änderungen. DKK3 ist eine 38 kDa Glykoprotein mit einer N-terminalen Signalpeptid abgesondert und frühere Studien haben gezeigt, dass seine erzwungene Ausdruck Zellzyklus Festnahme führte, aggressiven bösartigen Verhaltens gehemmt und epitheliale-mesenchymale umgekehrt Übergang².

Das bösartige Verhalten der NNR-Karzinom (ACC) und anderen Krebsarten ist, im Teil, beeinflusst durch die Fähigkeit der Tumorzellen, Schnittstelle mit der umgebenden Flächen, einschließlich die extrazelluläre Matrix, die wiederum Tumorinvasion Zelle erleichtert und Migration-³. Die Rolle der spezifischen Zellmembran Erweiterungen in Tumorprogression ist zunehmend in verschiedenen Kontexten, vor allem über die Bildung von Filopodien vorgeführt. Zum Beispiel wurde Überexpression des L-Typ-Kalziumkanäle zu induzieren Filopodien Bildung und Förderung der Tumor Zelle Invasion⁴gefunden. Ebenso ist Fascin, ein Aktin-bindende Protein minimal ausgedrückt in normalem Gewebe auch überexprimieren in Krebszellen in Verbindung mit Filopodien Bildung⁵. Pseudopodien Bildung ermöglicht nicht-malignen Fibroblasten, effektiv durch die extrazelluläre Matrix zu migrieren, jedoch wurde nachgewiesen, dass Fibrosarkom Zellen abhängig Metalloproteinase Aktivität anstelle von Pseudopodien Zellwanderung zu erleichtern und Invasion-⁶. Wir haben gezeigt, dass Tumor Entstörer, einschließlich Ras Verband Domäne Familie 1 Isoform (RASSF1A) und DKK3, kann die Funktion zum Zellskelett Elemente zu verändern und Lamellipodia Bildung und stymie invasive Eigenschaften⁷^,⁸.

Als solches ist es wichtig, die Auswirkungen von Genen, die in der Karzinogenese und ihre Beziehung zur Zellmembran Erweiterung Änderungen, insbesondere Beurteilung Filopodien, Pseudopodien und Lamellipodia Bildung unter Testbedingungen zu charakterisieren. Aktuellen State-of-the-Art-Techniken umfassen die Verwendung von immer ausgefeilteren Mikroskopieverfahren, fluoreszierende Kennzeichnung und/oder komplexe Computer-Algorithmen für die Datenerfassung und Auslegung. Während diese Methoden neue, leistungsstarke Analysetools bieten, schränkt ihre Komplexität ihrer Verbreitung und Anpassungsfähigkeit in Zelle Biologie Experimente. Darüber hinaus ist die exakte Quantifizierung und Beobachtung der Veränderungen der Zellmorphologie Erweiterung nicht in der Regel gemessenen⁹^,¹⁰. Im Gegensatz dazu stellen wir Ihnen hier eine Technik, die Zelle Erweiterung Änderungen mit mikroskopischen Standardtechniken und leicht anpassbar in-vitro- Methoden genau quantifiziert. Diese Methoden auch quantifizieren jeden Erweiterungstyp Zelle gleichzeitig für jede Zelle analysiert und Veränderungen in der Zellmembran Erweiterung Repertoire zu bestimmen. Wir zeigen auch, wie diese Veränderungen auf Zelle Adhäsionseigenschaften beziehen können.

Als ein experimentelles Beispiel verwenden wir eine zuvor erstellte Zelllinie SW-13 bezeichneten SW-DDK3, das hat mit pCMV6-Eintrag/DKK3 Plasmid-Vektoren stabil transfiziert wurden und konstitutiv overexpresses DKK3, ein Unterscheidungsmerkmal in der Nebenniere. Non-transfizierten SW 13 und SW-13 Zellen mit leerer Vektor (pCMV6-Eintrag), benannten SW-Neo, stabil transfiziert werden als experimentelle Kontrollen dienen.