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Methodenartikel

Auf der Suche nach Treiber Wege erworbene Resistenz auf die gezielte Therapie: resistente Subclone Generation und Sensibilität wiederherzustellen, indem Sie Gene Knock-down-

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DOI:

10.3791/56583

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11. Dezember 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dies ist eine Zeit und Kosten wirtschaftlicheren in-vitro- Protokoll untersucht die Mechanismen der erworbenen Resistenz gegen gezielte therapeutische Wirkstoffe, die eine höchst medizinischer Bedarf im Krebs-Management.

Zusammenfassung

Die letzten zwei Jahrzehnten haben eine Verlagerung von Zytostatika, zielgerichtete Therapie in der medizinischen Onkologie gesehen. Obwohl gezielt Therapeutika beeindruckender klinische Wirksamkeit und minimiert Nebenwirkungen als herkömmliche Behandlungen gezeigt haben, geworden Resistenzen die wichtigste Einschränkung auf ihre Vorteile. Mehreren präklinischen/in vitro/in vivo Modellen der erworbene Resistenz gegen gezielte Mittel in der klinischen Praxis wurden hauptsächlich mit Hilfe von zwei Strategien entwickelt: i) Genmanipulation für die Modellierung von Genotypen der erworbenen Resistenz und (Ii) in-vitro- / in-vivo beständig Modellauswahl. In der vorliegenden Arbeit schlagen wir einen einheitlichen Rahmen für die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen verantwortlich für erworbene Resistenz zu zielgerichteten Therapeutika, ausgehend von der Generation von Medikamenten-resistenten zellulären Subclones zur Beschreibung der Verfahren zur Wiederherstellung der Empfindlichkeit der Inhibitors-Stummschaltung. Diesem einfache Zeit und Kosten wirtschaftlicheren Ansatz ist vielseitig einsetzbar und kann leicht erweitert werden, um die Resistenzmechanismen gegenüber anderen gezielten therapeutischen Medikamenten in verschiedenen Tumor Histotypes zu untersuchen.

Einleitung

Im Anschluss an die entscheidenden Entdeckungen in der molekularen und zellulären Biologie, haben eine Reihe von neuartigen synthetisierten krebsbekämpfende Moleküle entwickelt, um selektiv onkogenen Signalwege in einer Vielzahl von Tumorarten abzielen. Vor allem zwei Kategorien von zielgerichteten Therapeutika mit einzigartigen Eigenschaften in der Onkologie, nämlich synthetische chemische Verbindungen und rekombinanter monoklonaler Antikörper, sind dafür bekannt, klinische Erfolge und dramatisch verändert Krebsbehandlung in erreicht haben den letzten Jahrzehnten1,2,3.

Dennoch, trotz ihrer beeindruckenden ersten Ansprechen auf die Behandlung haben die meisten Krebspatienten Resistenzen auf alle zielgerichteten Therapeutika, monoklonale Antikörper und Kinase-Inhibitoren entwickelt. Infolgedessen ist Resistenzen, die große Hürde für die klassische Anti-Krebs-Medikamente4, nach wie vor eine große Herausforderung für neue zielgerichtete Therapien5,6.

Widerstand gegen gezielte Therapie möglicherweise intrinsischen (d.h.primäre) oder erworbene (d.h., sekundäre). Intrinsische Resistenz beschreibt de Novo mangelnder Ansprechen auf die Therapie, während sekundäre Resistenz nach einer Antwort auf Droge Behandlung7auftritt. Letzteres ist verursacht durch Ausbrüche der kleinen Kohorten von Tumorzellen innerhalb der Großteil des ursprünglichen Tumors oder eingebettet in den distalen kryptische anatomische Nischen, ausstellen von bis zu 90 % Widerstand gegen eine oder mehrere gezielte Therapeutika. Molekulare Mechanismen einer Resistenzentwicklung, gezielte Therapie vor allem ergeben sich aus Ziel-Gen-Mutationen und redundante Aktivierung von anderen pro-Survival Signalwege, deren Verständnis noch lange nicht komplett8 ist.

In dieser Arbeit haben wir vorgeschlagen, einen Zeit und Kosten wirtschaftlicheren Ansatz zur Untersuchung der in-vitro- Mechanismen der erworbenen Resistenz gegen gezielte Therapeutika, ausgehend von der Generation von Medikamenten-resistenten zellulären Subclones zur Beschreibung der zum Schweigen zu bringen Verfahren zur Wiederherstellung der Empfindlichkeit auf den Inhibitor, ein entscheidendes Instrument für testen und validieren der Arbeitshypothesen verwendet. Insbesondere war unser Ansatz verwendet, zu untersuchen, bei Magenkrebs, die Resistenzmechanismen zu Trastuzumab (z.B.Herceptin), ein humanisierter monoklonaler Antikörper gezielt die extrazelluläre Domäne des HER2-Protein-9. Trastuzumab + Chemotherapie ist weithin anerkannt als der standard Erstlinien Behandlung von HER2-positivem metastasierendem Brustkrebs. Dank den letzten präklinischen Studien, die zeigen, dass Anti-HER2 Therapien haben signifikante Aktivität in beide in Vitro und in Vivo HER2-positivem Magenkrebs Modelle10,11, molekulare Medikamente gegen HER2 gewesen umfassend in klinischen Studien untersucht, sind von denen einige noch im Gange, bei Patienten mit Gastroesophageal Krebs12,13,14,15.

Diese Studien haben betont, dass die steigende Zahl von Patienten, bei denen Widerstandsfähigkeit gegen Trastuzumab16, ähnlich wie was für andere gezielte therapeutische Inhibitoren beobachtet wird. Insbesondere die Rücklaufquote von Trastuzumab betrug 47 %, und die mediane Gesamtüberleben für Trastuzumab + Chemotherapie-Patienten betrug nur 2,7 Monate länger als bei Patienten unter Chemotherapie allein17. Dies schlug während primäre Trastuzumab-Resistenz vorherrscht, sekundäre Trastuzumab Widerstand unvermeidlich ist. Aus diesem Grund ist die dringende Notwendigkeit zur Klärung der Mechanismen, die HER2-gezielte Therapieresistenz bei Magenkrebs, was angesichts die Intra-Tumor genetische Heterogenität dieser Neoplasie18noch problematischer ist.

Darüber hinaus haben die Mechanismen der Resistenz gegen Trastuzumab bei Magenkrebs schwierig zu erklären, teilweise aufgrund der Schwierigkeiten bei der Beschaffung von zuverlässigen präklinischen Modellen Vertreter dieser Erkrankung bewährt. Oshima Et Al. berichtet eine in Vivo Auswahlmethode Trastuzumab resistenten Magen-Krebs-Zell-Linien, bestehend aus einer wiederholten Kultur eine kleine verbleibende peritonealen Metastasen nach einer Behandlung mit Trastuzumab19. Allerdings trugen die Notwendigkeit eines Gehäuses, bestimmten tierischen Umgang mit Know-how und der Genehmigung der Tier-Ethik-Kommission, so dass es eine Methode zeitaufwändig und Kosten. Der Ansatz, den wir in dieser Arbeit zu beschreiben ist einfach und vielseitig einsetzbar und kann leicht erweitert werden, um die Resistenzmechanismen gegenüber anderen therapeutischen Medikamenten in verschiedenen Tumor Histotypes20zu untersuchen.

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Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll wurde speziell für die Analyse der Mechanismen, die erworbenen Resistenz gegen Trastuzumab HER-positivem Magenkrebs Zell-Linien angepasst. Alle Laborgeräte benötigt werden in der Tabelle der Materialiengemeldet.

1. Generation der gezielten Therapie resistente Subclones

Hinweis: Dies ist der kritische und schwierige Schritt in das Protokoll zu standardisieren, da verschiedene Zelllinien unterschiedliche Empfindlichkeiten, die gezielte therapeutische Inhibitor unabhängig von ihrem Tumor Histotype oder Medikament Konzentration aufweisen können verwendet.

  1. Kultur NCI-N87 Zelle Line-in RPMI Medium ergänzt mit fetalen Kälberserum (10 %) und Glutamin (2 mM, 1 %), als eine Monolage bei 37 ° C und Samen es auf 25 cm2 Kulturflaschen.
  2. Fügen Sie zu dem Kulturmedium in jeder Flasche 10 µg/mL Trastuzumab als die Anfangsdosis. Setzen Sie die Zellen, die die Anfangsdosis aus, bis sie wachsen wieder aufzunehmen.
    Hinweis: Die Anfangsdosis von der gezielten Therapie Inhibitor sollte 10-Mal niedriger als seine Plasmakonzentration Höhepunkt sein. Plasma-Peak-Konzentration ist die höchste Stufe der Arzneimittelkonzentration im Patientenblut in der Regel durch mehrere Dosen der Standardtherapie erkannt. Dieser Wert kann aus Studien zur Pharmakokinetik abgerufen werden.
  3. Zellwachstum mit dem Trypan blau-Ausschluss-Verfahren zu überwachen; Wenn Zellwachstum (in der Regel nach einem Zeitraum von zwei bis drei Wochen) fortgesetzt wird, setzen Sie Zellen zu einer 10-divisibel höhere Dosis Konzentration von Trastuzumab.
  4. Setzen Sie Zellen zu einer allmählich zunehmenden Dosis von Trastuzumab (ab 100 µg/mL bis 400 µg/mL) bis Zellen halten trotz der Anwesenheit von einer hohen Wirkstoffkonzentration (mindestens 2,5 - 4-fach höher als der Plasma-Gipfel) (nach ca. 2 Wochen) wachsen.
  5. Führen Sie einen klonogenen-Assay, um das Niveau des Widerstands zur gezielten Therapie bei jeder Änderung in der Konzentration von der Ziel-Therapie-Inhibitor in das Kulturmedium zu bewerten, und definieren Sie relative Resistenz IC50 Index (RR IC50) wie folgt.
    1. Samen Sie 500 Zellen in 24 Multi-gut Kultur Platten.
      Hinweis: 5 Brunnen müssen für jede Bedingung vorbereitet werden.
    2. Setzen Sie Zellen zu steigenden Ziel Therapie Inhibitor (Trastuzumab) Konzentrationen von 100 µg/mL bis zu 400 µg/mL.
    3. 15 Tage inkubieren Sie Zellen in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C.
    4. Nach der Inkubation zu beheben und Proben wie folgt zu beflecken.
      1. Medium und spülen Sie Zellen mit 10 mL 1 X PBS zu entfernen. Entfernen Sie 1 X PBS zu, und fügen Sie 2-3 mL Fixierung-Lösung (acetic Acid: Methanol, 1:7 (Vol/Vol)). Entfernen Sie die Fixierung Lösung, und fügen Sie 0,5 % Kristallviolett-Lösung. Inkubation bei Raumtemperatur für 2 h
      2. Entfernen Sie die Kristallviolett-Lösung durch Absaugen mit einer Pipette vorsichtig und Tauchen Sie Platten in Leitungswasser abzuspülen Rückstände Kristallviolett-Lösung. Für bis zu 2 Tage an der Luft trocknen Sie bei Raumtemperatur.
    5. Anzahl der Kolonien von mehr als 50 Zellen mit einem inversen Mikroskop (4 X Vergrößerung).
      Hinweis: Zwei unabhängige Beobachter sind dafür erforderlich.
    6. Berechnen Sie RR IC50 als das Verhältnis zwischen dem IC50 Wert der Target-Therapie-resistente Subclone Zellen und den Wert der Original/naive Zellen.

2. Validierung Protokoll für den Kandidaten gezielte Therapie-Resistenz-Gen (R-gen)

Hinweis: Nach der Charakterisierung der Genexpression, Signaturen zugeordneten erworbene Resistenz Ziel Therapie und jedes Kandidaten-gen als Fahrer des Widerstands durch untersucht werden: (a) RT-PCR und (b) Western blot Analyse.

  1. Real-Time RT-PCR
    1. Gesamt-RNS von Zelllinien mit Säure Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Mischung zu extrahieren (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Reversen Transkription (RT) Reaktionen mit random Hexamer Primer durchzuführen und stellen die Thermocycler folgendermaßen: bei 25 ° C für 5 min, RT bei 46 ° C für 20 min und RT-Inaktivierung bei 95 ° C für 1 min grundieren.
    3. Einsatz 400 ng von Gesamt-RNS 20 µL zu reagieren. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch für Probe wie folgt: 7 µL RNase frei H2O 2 µL cDNA (10 ng/µL) 1 µL 20 x Leuchtstoff-Label gezielt Sonde und 10 µL 2 x Mix enthaltenden Puffer, dNTPs und DNA-Polymerase (siehe Tabelle der Materialien).
    4. Jede gut Platte 20 µL des Reaktionsgemisches hinzu und führen Sie das folgende Programm: holding Phase bei 50 ° C für 2 min bei 95 ° C für 10 min (1 Zyklus); dann 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 s und bei 60 ° C für 1 min.
  2. Western-blot
    1. Zellsuspensionen zu erholen, indem Sie 2 mL 0,05 % Trypsin/EDTA-Lösung hinzufügen und 2-3 min. für Trypsin zu arbeiten.
    2. Fügen Sie 2 Bände der mittlere mit 10 % fötalen Rinderserum zu neutralisieren (z.B.2 mL Medium für jeweils 1 mL Trypsin) Trypsin und Zentrifugieren bei 1.200 x g für 5 min. verwerfen überstand und waschen Zellen mit kalten 1 X PBS hinzu.
    3. 1.200 x g für 5 min Zentrifugieren und überstand verwerfen. Aufschwemmen der Zelle Pellet mit Lyse Puffer und eine Wippe bei 4 ° C für 30 min inkubieren.
      1. Die Höhe der Lyse Puffer hängt von der Anzahl der Zellen (z.B. 100 µL 1 x 106 Zellen); Achten Sie auf frische Lyse Puffer jedesmal vorzubereiten. Für 1 mL Lyse Puffer Vorbereitung (Urlaub auf dem Eis): verwenden Sie 975 µL M-pro Säugetier-lysate Puffer, 15 µL Protease und Phosphatase-Inhibitoren und 10 µL 100 µM PMSF Inhibitoren.
    4. Wiederherstellen Sie das überstehende Protein durch Zelle lysate Zentrifugation bei 13.000 x g bei 4 ° C für 15 Minuten.
    5. Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen mithilfe eines BCA Protein Assays.
    6. Fügen Sie 4 x LaemmLi Probenpuffer Proteinproben (mindestens 20-30 µg Protein) und Hitze bei 100 ° C für 3 Minuten.
    7. Verwenden Sie vorgefertigte 4-20 % Gele und laden Sie 20-30 µg Proteinlösung LaemmLi und 5-10 µL Protein standard pro Probe.
    8. Den Western-Blot-Ring mit TRIS/GLICYNE /SDS 1 X Puffer füllen und Gel bei 110 V 30-60 min. ausgeführt werden (wenn die Zeit steht, Check, die der Farbstoff das Ende des Gels still, sonst laufen für ein paar weitere Minuten erreicht hat)
    9. Electroblot Protein in einer PVDF-Membran übertragen (siehe Tabelle der Materialien) mit einem semi-dry-System.
    10. Blockieren Sie die Membran durch Einweichen in der entsprechenden Proteinlösung (Milch/BSA 5 %) auf den Shaker für 1 h bei Raumtemperatur.
    11. Machen Sie eine 1: 400-Lösung mit primären Antikörper Anti-IQGAP1 in einer 5 %-Milch-Lösung (siehe Tabelle der Materialien).
    12. Legen Sie die Membran in primären Antikörper-Lösung auf einem Shaker in einem kalten Raum über Nacht.
    13. Am nächsten Tag die Antikörperlösung zu verwerfen und in T-TBS 1 X Lösung einweichen (1 x T-TBS: 1 X Kochsalzlösung Tris-Puffer hinzugefügt durch Tween20 0,1 %) auf einem Schüttler bei Raumtemperatur für 7 Minuten.
    14. Verwerfen Sie T-TBS 1 x Lösung und ersetzen. Wiederholen Sie 3 Mal.
    15. Machen Sie eine 1: 10.000 Sekundärantikörper Maus Lösung durch Zugabe von Antikörper für standard Western blot Erkennung (siehe Tabelle der Materialien) und die Membran auf einen Shaker; lassen Sie bei Raumtemperatur für 2 h.
    16. Die Antikörperlösung zu verwerfen und in T-TBS 1 X Lösung auf einem Schüttler bei Raumtemperatur für 7 min einweichen.
    17. Verwerfen Sie T-TBS 1 x Lösung und ersetzen. Wiederholen Sie 3 Mal.
    18. Membran für 5 min in eine Chemolumineszenz Lösung einweichen, und die Membran auf einen Chemilumineszenz-Imager Bild.

3. Wiederherstellung der Target-Therapie Inhibitor Empfindlichkeit von Kandidaten Knock-down-R-gen

  1. Handy-Vorbereitung
    1. Bereiten Sie einzelne Zellsuspension durch Trypsinization. Führen Sie Transfektion auf den Tag, an dem die Zellen überzogen sind.
      1. NCI-N87 waschen mit PBS Zellen und Inkubation bei 37 ° C mit 0,05 % Trypsin/EDTA Lösung für ca. 5-10 min. Add 2 Volumen von RPMI Medium mit 10 % fetalen Rinderserum, Trypsin (z.B.2 mL Medium für jeweils 1 mL Trypsin) zu neutralisieren.
      2. Anzahl Zellen mit einer Hemocytometer verwenden Trypan blau zu färben. 2.5 x 105 Samenzellen (60 % Zusammenfluss) auf ein T25 cm2 Fläschchen für jede Bedingung.
        Hinweis: Die entsprechende Anzahl von Zellen für die Aussaat richtet sich nach der Verdopplungszeit der Zelllinie und die Dauer des Experiments. Ziel ist es, das Zielgen Knock-down-für die gesamte Dauer des Experiments zu erreichen. Neun T25 cm2 Flaschen sind ideal für Transfektion Bedingungen und der klonogenen-Assay (3 Flaschen für Steuerelemente, 3 Flaschen für negative Transfektion Steuerelemente, 3 Flaschen für gen-Ziel Transfektion).
  2. Umgekehrte Transfektion
    1. Gen-Ziel vorzubereiten und negative Kontrolle Transfektion Mix für jede T25 cm2 Kolben wie folgt.
      1. Verdünnen Sie 12,5 µL der einzelnen Gene-targeting SiRNA Oligonukleotide oder Negativkontrolle SiRNA Oligonukleotide in minimalen wesentliche Transfektion Medium (Verhältnis 01:55; siehe Tabelle of Materials).
      2. Fügen Sie eine kationische Liposomen Transfection Reagens (Verhältnis 1:1 mit gen-targeting SiRNA Oligonukleotide; siehe Tabelle of Materials). Bei Raumtemperatur für 20 min inkubieren.
        Hinweis: Das Gesamtvolumen der Transfektion Mischung ist 700 µL.
      3. Jedem T25 cm2 Kolben 700 µL der Transfektion Mischung hinzufügen. 1-3 Tage inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C.
    2. Knock-down gen durch RT-PCR und Western-Blot Analyse zu überprüfen. Überprüfen Sie die Auswirkungen des vermeintlichen R-gen Knock-Down auf die Wiederherstellung der Sensibilität für das gezielte therapeutische Mittel durch Kolonie-Bildung-Experimente (wiederhole Schritt 1.5).

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Ergebnisse

Abbildung 1 steckt den Rahmen für die Versuchsdurchführung. Drei Magenkrebs-Zelllinien mit dem Ausdruck eines hohen Maß an HER2 und anfällig für Trastuzumab (IC50 < Plasma Spitzenpegel von Drogen, Figur 2A, linke Diagramm) im Kulturmedium, enthält das gezielte therapeutische Mittel gewachsen waren. Eine Dosis 10-Mal niedriger als der Peak-Plasma-Konzentration von Trastuzumab (10 µg/mL) wurde als die Anfangsdosis und...

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Diskussion

Während personalisiert und gezielte Therapien haben wachsende Begeisterung ausgelöst, diese so genannten "intelligenten" Therapien stellen die gleiche Hürde als herkömmliche Chemotherapeutika, d. h., die schnelle und unvorhersehbare Übernahme von Resistenzen. Um die Ergebnisse der gezielten Therapie zu verbessern, müssen Medikamentenresistenz Probleme durch ein besseres Verständnis der Mechanismen gelöst werden, die sie verursachen. Hier haben wir eine leicht zugänglich in-vitro- Methodik zur Untersuchu...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren möchten Dr. Veronica Zanoni danken für das Manuskript zu bearbeiten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
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Precision Plus Protein WesternC Blotting-StandardsBio-Rad1610376Precision Plus Protein Prestained Standards sind in den Formaten Dual Color, All Blue, Kaleidoscope und Dual Xtra erhältlich. Alle vier haben die gleichen Gelmigrationsmuster mit 3 hochintensiven Referenzbanden (25, 50 und 75 kD).
10x Tris/Glycin/SDSBio-Rad161073210x Tris/Glycin/SDS ist ein vorgemischter Laufpuffer zur Trennung von Proteinproben mittels SDS-PAGE.
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Precision Protein StrepTactin-HRP KonjugatBio-Rad1610381StrepTactin-Meerrettichperoxidase (HRP) Konjugat für den chemilumineszierenden oder kolorimetrischen Nachweis von Precision Plus Protein Ungefärbten Proteinstandards oder Precision Plus Protein WesternC Protein Standards auf Western Blots.
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