Dieses Papier stellt eine Methode, mit der Synthese und Charakterisierung von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen und den entsprechenden assays für Biokompatibilität und Fähigkeit der Micelle binden an Monozyten zu testen.
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Methodenartikel
Synthese von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen für die Bildgebung der Atherosklerose
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Atherosklerose ist ein wesentlicher Faktor für kardiovaskuläre Erkrankungen, die häufigste Todesursache weltweit, der jährlich 17,3 Millionen Todesopfer fordert. Atherosklerose ist auch die häufigste Ursache des plötzlichen Tod und Myokardinfarkt, angestiftet von instabilen Plaques, die platzen und verdecken das Blutgefäß ohne Vorwarnung. Aktuelle bildgebende Modalitäten kann nicht unterscheiden zwischen stabilen und instabilen Plaques, die platzen. Peptid amphiphilen Micellen (PAMs) können diesen Nachteil überwinden, wie sie können, mit einer Vielzahl geändert werden von targeting Moieties, die speziell auf erkranktes Gewebe zu binden. Monozyten haben gezeigt, zu frühe Marker für Arteriosklerose, während große Ansammlung von Monozyten Plaques anfällig für Bruch zugeordnet ist. Daher können Nanopartikel, die Monozyten abzielen kann verwendet werden, verschiedene Stadien der Arteriosklerose zu unterscheiden. Zu diesem Zweck hier beschreiben wir ein Protokoll für die Vorbereitung des Monocyte-targeting PAMs (Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sind selbst zusammengebaut durch Synthese unter milden Bedingungen, Form Nanopartikel von 15 nm im Durchmesser mit in der Nähe von neutralen Oberflächenladung. In Vitro, PAMs erwiesen sich biokompatible und hatte eine hohe Bindungsaffinität für Monozyten. Die hier beschriebenen Methoden zeigen, Versprechen für ein breites Anwendungsspektrum in Atherosklerose sowie anderen entzündlichen Erkrankungen.
Einleitung
Herz-Kreislauf-Krankheiten bleiben die führenden Todesursachen weltweit mit etwa 17,3 Millionen Todesfälle weltweit1. Herz-Kreislauf-Krankheiten sind durch Arteriosklerose, eine Bedingung trugen in denen Plaques in den Arterien, dadurch hemmende Blut- und Sauerstoffzufuhr zu den Zellen des Körpers2,3bauen. Die Progression der Atherosklerose beinhaltet die Verdickung und Verhärtung der Arterien durch eine entzündliche Reaktion, unregelmäßige Fettstoffwechsel und Plaquebildung, führt zu Plaque Ruptur und Myokardinfarkt4,5. Endothe....
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Protokoll
Hinweis: Lesen Sie das MSDS für Reagenzien und befolgen Sie alle chemischen Sicherheitsmaßnahmen gemäß lokalen Institution.
1. Vorbereitung des MCP-1 PAMs
-
Vorbereitung von MCP-1-Peptid
- Wiegen Sie 0,25 Mmol Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang in einem Reaktionsgefäß (RV). Spülen Sie die Seite des RV mit 5 mL Dimethylforamide (DMF) in einem chemischen Abzug.
- Laden Sie die RV auf eine automatisierte Benchtop-Peptid-Synthesizer. Last abgepackte Aminosäure Ampullen, N "- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C", aus dem C, N-Terminus. Enthalten Sie eine Leere Phiole am Ende für den endgültigen Deprotection Schritt.
Hin....
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Ergebnisse
Vorbereitung von MCP-1 PAM
Das CCR2-Bindung-Motiv (Rückstände 13-35) der MCP-1 Protein [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] oder Rührei Peptid [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] wurde modifiziert, indem ein Cystein-Reste auf dem N-Terminus. Das MCP-1-Peptid wurde durch eine Fmoc-vermittelten Festphasen-Methode unter Verwendung eines automatisierten Peptid-Synthesizers synthetisiert. Das rohe-Peptid wurde gereinigt, durch Reverse-Phase-HPLC auf eine Spalte C8 bei 50 ° C mit 0,1 % TFA in Ace.......
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Diskussion
MCP-1 PAMs sind eine vielversprechende molekulare Bildgebung-Plattform, bestehend aus einer hydrophilen targeting Peptid und hydrophobe Endstück, das treibt die selbstgebaute Natur der Nanopartikel. Diese Monocyte-targeting Micelle kann durch einfache Synthese und Reinigungsschritte der MCP-1-Peptid und DSPE-PEG (2000)-MCP-1 hergestellt werden. PAMs haben viele vorteilhafte Eigenschaften für molekulare Bildgebung in Vivo wie ihre Selbstmontage unter milden Bedingungen, intrinsische biologische Abbaubarkeit und s.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren möchten die finanzielle Unterstützung von der University of Southern California, das National Heart, Lung, und Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli Edythe breiten Innovationspreis und l.k. Whittier Stiftung Non-Krebs zu erkennen Translational Research Award, EJC gewährt. Die Autoren danken Zentrum für Elektronenmikroskopie und Mikroanalyse, Center of Excellence in NanoBiophysics, Kompetenzzentrum für molekulare Charakterisierung und translationale Imaging Center der University of Southern California für die Unterstützung bei Instrumental-Setups.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,2-Ethanedithiol | VWR | E0032 | für die Peptidsynthese |
| 10 mL serologische Einwegpipetten | VWR | 89130-898 | für Zellkulturen |
| 15 mL Zentrifugenröhrchen, Polypropylen | VWR | 89401-566 | für verschiedene Anwendungen |
| 2,5-Dihydroxybenzoesäure, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | für MALDI |
| 25 mL Einweg serologische Pipetten | VWR | 89130-900 | für Zellkulturen |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | für Zellkulturen |
| 5 mL serologische Einwegpipetten | VWR | 89130-896 | für Zellkulturen |
| 50 mL Zentrifugenröhrchen | VWR | 89039-658 | für verschiedene Anwendungen |
| 75 cm2 Kulturkolben | Fisher Scientific | 13-680-65 | für Zellkulturen |
| 75 mL Reaktionsgefäß | Protein Technologies | 3000005 | für die Peptidsynthese |
| 96-Wells Zellkulturplatte | VWR | 40101-346 | für MTS-Assay |
| Acetonitril, HPLC-Qualität | Fisher Scientific | A998SK-4 | für die HPLC-Aufreinigung |
| Borosilikatglas, 1 Dram | VWR | 66011-041 | für die PAM-Synthese |
| Borosilcat-Glaspipette, lange Spitzen | VWR | 14673-043 | für verschiedene Anwendungen |
| Deckglas, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | für die konfokale Mikroskopie |
| Cy5-Amin | Abcam | ab146463 | für die Peptidkonjugation |
| Diethylether, ACS-Qualität | Fisher Scientific | E138-1 | für die Peptidfällung |
| Einweg Spritzen, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | für die HPLC-Aufreinigung |
| Doppeltes Neubauer-Regel-Hämozytometer | VWR | 63510-13 | für die Zellzählung |
| DSPE-PEG(2000) Amin | Avanti | 880128P | für die Peptidkonjugation |
| DSPE-PEG(2000) Maleimid | Avanti | 880126P | für die Peptidkonjugation |
| DSPE-PEG(2000)-NHS-Ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | für die Konjugation mit Cy5 |
| Dulbecco's modifiziertem Eagle | Sigma Aldrich | D5796-500ML | für die Zellkultur |
| Fötales Rinderserum, qualifiziertes, hitzeinaktiviertes | ThermoFisher Scientific | 10438026 | für die Zellkultur |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | für die Peptidsynthese |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | für die Peptidsynthese |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | für die Peptidsynthese |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | für die Peptidsynthese |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | für die Peptidsynthese |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | für die Peptidsynthese |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | für die Peptidsynthese |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | für die Peptidsynthese |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | für die Peptidsynthese |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | für die Peptidsynthese |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | für die Peptidsynthese |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | für die Peptidsynthese |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | für die Peptidsynthese |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang Harz, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | für die Peptidsynthese |
| Ameisensäure, optima LC/MS-Qualität | Fisher Scientific | A117-50 | für die HPLC-Aufreinigung |
| Glycerin | VWR | M152-1L | für konfokale Mikroskopie |
| Handzähler | Fisher | Scientific S90189 | für die Zellzählung |
| Magnetrührstäbchen, eiförmiges | VWR | 58949-006 | für die Peptidkonjugation |
| Methanol, ACS-zertifiziert | Fisher Scientific | A412-4 | für die PAM-Synthese |
| kolorimetrisches MTS-Zellproliferations-Assay-Kit | VWR | 10191-104 | für MTS-Assay |
| N,N-Dimethylformamid, Sequenzierqualität | Fisher Scientific | BP1160-4 | für die Peptidsynthese |
| N-Methylmorpholin | Protein Technologies | S-1L-NMM | für die Peptidsynthese |
| Paraformaldehyd | Fisher | Scientific AC416780250 | für die Fixierung von Zellen |
| PBS, pH 7,4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | für verschiedene Anwendungen |
| Penicillin/Streptomycin, 10.000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | für Zellkultur |
| Peptidsynthesegefäß, 25 mL& nbsp; | Fisher Scientific | CG186011 | für die Peptidsynthese |
| Phosphotungstinsäure | Fisher Scientific | A248-25 | für TEM |
| Piperidin | Spectrum | P1146-2.5LTGL | für die Peptidsynthese |
| Objektträger aus einfachem Glas 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | für konfokale Mikroskopie |
| Reagenzreservoire, steril | VWR | 95128093 | für Zellkultur |
| Selbstschließende Pinzette | TedPella | 515 | für TEM |
| TEM Trägerfolie | TedPella | 01814F | für TEM |
| Trifluoressigsäure | Fisher Scientific | BP618-500 | für die Peptidspaltung und HPLC-Aufreinigung |
| Triisopropylsilan | VWR | TCT1533-5ml | für die Peptidspaltung |
| Trypanblau-Lösung, 0,4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | für die Zellzählung |
| Pinzette, universell gezahnt | VWR | 231-SA-SE | für die konfokale Mikroskopie |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | Maus-Monozyten |
| automatisierter Tisch-Peptidsynthesizer | Protein Technologies | PS3 Tisch-Peptidsynthesizer | |
| α- Cyano- 4- Hydroxyzimtsäure, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | für MALDI |
Referenzen
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
- Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12....
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Nachdrucke und Genehmigungen
