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Methodenartikel

Synthese von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen für die Bildgebung der Atherosklerose

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DOI:

10.3791/56625

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17. November 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Southern California

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Papier stellt eine Methode, mit der Synthese und Charakterisierung von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen und den entsprechenden assays für Biokompatibilität und Fähigkeit der Micelle binden an Monozyten zu testen.

Zusammenfassung

Atherosklerose ist ein wesentlicher Faktor für kardiovaskuläre Erkrankungen, die häufigste Todesursache weltweit, der jährlich 17,3 Millionen Todesopfer fordert. Atherosklerose ist auch die häufigste Ursache des plötzlichen Tod und Myokardinfarkt, angestiftet von instabilen Plaques, die platzen und verdecken das Blutgefäß ohne Vorwarnung. Aktuelle bildgebende Modalitäten kann nicht unterscheiden zwischen stabilen und instabilen Plaques, die platzen. Peptid amphiphilen Micellen (PAMs) können diesen Nachteil überwinden, wie sie können, mit einer Vielzahl geändert werden von targeting Moieties, die speziell auf erkranktes Gewebe zu binden. Monozyten haben gezeigt, zu frühe Marker für Arteriosklerose, während große Ansammlung von Monozyten Plaques anfällig für Bruch zugeordnet ist. Daher können Nanopartikel, die Monozyten abzielen kann verwendet werden, verschiedene Stadien der Arteriosklerose zu unterscheiden. Zu diesem Zweck hier beschreiben wir ein Protokoll für die Vorbereitung des Monocyte-targeting PAMs (Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sind selbst zusammengebaut durch Synthese unter milden Bedingungen, Form Nanopartikel von 15 nm im Durchmesser mit in der Nähe von neutralen Oberflächenladung. In Vitro, PAMs erwiesen sich biokompatible und hatte eine hohe Bindungsaffinität für Monozyten. Die hier beschriebenen Methoden zeigen, Versprechen für ein breites Anwendungsspektrum in Atherosklerose sowie anderen entzündlichen Erkrankungen.

Einleitung

Herz-Kreislauf-Krankheiten bleiben die führenden Todesursachen weltweit mit etwa 17,3 Millionen Todesfälle weltweit1. Herz-Kreislauf-Krankheiten sind durch Arteriosklerose, eine Bedingung trugen in denen Plaques in den Arterien, dadurch hemmende Blut- und Sauerstoffzufuhr zu den Zellen des Körpers2,3bauen. Die Progression der Atherosklerose beinhaltet die Verdickung und Verhärtung der Arterien durch eine entzündliche Reaktion, unregelmäßige Fettstoffwechsel und Plaquebildung, führt zu Plaque Ruptur und Myokardinfarkt4,5. Endothelzellen express Zytokine und Adhäsion Moleküle, die MCP-1, die an den C-C Chemokin-Rezeptor (CCR2 enthalten) auf der Oberfläche der Monozyten6,7,8bindet. Oxidiertes Cholesterin wandelt Monozyten zu Makrophagen in der frühen Phase der Plaquebildung, die verstärkt der entzündlichen Reaktion in der Region und führt zu Gewebeschäden und die Bildung von Plaques instabil oder gefährdeten9, 10.

Traditionell wird Arteriosklerose durch die Beurteilung der luminalen Stenose durch anatomische Bildgebung mit Ultraschall oder Angiographie11,12ausgewertet. Diese Methoden können aber nur feststellen starke Verengung der Arterienwand und nicht die frühen Stadium der Arteriosklerose, wie erste Gedenktafel Wachstum führt zu arteriellen Umbau um Arterie Größe beizubehalten und blood Flow Rate12,13, 14. Daher underrepresent Angiogramme Atherosklerose Prävalenz. Darüber hinaus nicht-invasive bildgebende Verfahren wie single Photonenemission berechnet Tomographie, Positronen-Emissions-Tomographie und Magnetresonanz-Bildgebung vor kurzem wurden verwendet, um Plaque-Morphologie zu charakterisieren, da sie erste Details bieten können und Charakterisierung von Plaques. Aber diese Modalitäten sind oft begrenzt durch den Mangel an Sensibilität, räumliche Auflösung, oder erfordern die Verwendung von ionisierender Strahlung, machen bildgebende Plaque Fortschreiten in den verschiedenen Phasen viel mehr herausfordernde15,16, 17. Ein bildgebendes System der Lieferung, das speziell Plaques in den verschiedenen Phasen der Atherosklerose identifizieren würde bleibt entwickelt werden.

Nanopartikel haben eine neue Plattform für in Vivo Plaque-targeting und Diagnostik18,19,20,21gezeigt. Insbesondere sind PAMs vorteilhaft aufgrund ihrer chemischen Vielfalt und die Fähigkeit, eine Vielzahl von Moieties, Kompositionen, Größen, Formen und Oberflächen Funktionalisierung22unterbringen. Peptid amphiphilen (PAs) bestehen aus einem hydrophilen, Peptid "Headgroup" befestigt eine hydrophobe Schwanz, die in der Regel sind Lipide; Diese amphiphile Struktur verleiht selbstorganisierende Funktionen und ermöglicht eine multivalente Anzeige der Peptide auf der Oberfläche der Partikel22,23,24. Die Peptid-Headgroups beeinflussen die Kornform durch Falt- und Wasserstoffbindung zwischen Peptide25. Peptide, die durch die Interaktion der β-Blatt Falten haben gezeigt, dass längliche Micellen zu bilden, während α-helikale Bestätigung sowohl sphärische und längliche Micellen22,23,24, bilden kann 25,26,27. Polyethylenglykol (PEG) linker, die Oberflächenladung des Peptids schützen können zwischen der hydrophilen Peptid und das hydrophobe Ende der PAMs, Verbesserung der Verfügbarkeit der Nanopartikel im Körperkreislauf28, platziert werden 29 , 30 , 31. PAMs sind auch vorteilhaft, weil sie biokompatibel sind und gezeigt haben, dass ein breites Spektrum von Anwendungen32,33. Die Wasserlöslichkeit von Micellen bietet einen Vorteil gegenüber anderen Nanopartikel-basierten Systemen wie z. B. bestimmte Polymere Nanopartikel, die nicht in Wasser löslich und in Lösungsvermittler für Injektionen34ausgesetzt werden. Darüber hinaus macht die Fähigkeit zum Erstellen von PAMs, das Zerlegen in Reaktion auf bestimmte Reize PAMs einen attraktive Kandidaten für kontrollierte intrazellulären Droge Lieferung35.

Durch Bindung an den Rezeptor CCR2 und akkumulieren in den Aortenbogen, wurden zuvor PAMs für Monocyte gezielt zur Überwachung der verschiedener Phasen von atherosklerotischen Läsionen in der Aorta9entwickelt. ApoE- / - Mäusen Monocyte Ansammlung steigt proportional zu Plaque Fortschreiten36. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Patienten mit Ruptur neigende, Spätstadium Plaques höhere Mengen an Monozyten37 enthalten. Daher ist die Änderung der PAMs, MCP-1 einzubeziehen nützlich, denn es größere targeting Spezifität und Differenzierung zwischen frühen und späten Stadium atherosklerotische Läsionen ermöglicht. Diese Proof-of-Concept-Studien überprüft auch, ob PAMs sind sicher genug vorklinisch verwendet werden und renally38deaktiviert sind. Da Monozyten und Entzündungen charakteristisch für andere Krankheiten sind, haben MCP-1 PAMs das Potenzial, für therapeutische und diagnostische Anwendungen in anderen Krankheiten über Arteriosklerose8,39,40 verwendet werden , 41.

Hier berichten wir über die Herstellung von hoch skalierbare und selbst-zusammengebauten MCP-1 PAMs, die optimale Größe, Oberflächenladung und gezielte Ausrichtung auf Monozyten für erweiterte imaging-Anwendungen in Atherosklerose des Teilchens nachgewiesen.

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Protokoll

Hinweis: Lesen Sie das MSDS für Reagenzien und befolgen Sie alle chemischen Sicherheitsmaßnahmen gemäß lokalen Institution.

1. Vorbereitung des MCP-1 PAMs

  1. Vorbereitung von MCP-1-Peptid
    1. Wiegen Sie 0,25 Mmol Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang in einem Reaktionsgefäß (RV). Spülen Sie die Seite des RV mit 5 mL Dimethylforamide (DMF) in einem chemischen Abzug.
    2. Laden Sie die RV auf eine automatisierte Benchtop-Peptid-Synthesizer. Last abgepackte Aminosäure Ampullen, N "- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C", aus dem C, N-Terminus. Enthalten Sie eine Leere Phiole am Ende für den endgültigen Deprotection Schritt.
      Hinweis: Eine verschlüsselte Peptid mit Sequenz, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', kann auch synthetisiert werden über das gleiche Protokoll.
    3. Sobald Synthese abgeschlossen ist, übertragen Sie die Peptide auf Harz von der RV auf das Funkeln Fläschchen mit ca. 2-3 mL Methanol bis alle Harze übertragen werden. Nachdem das Harz auf den Boden gesunken ist, entfernen Sie überstand das Methanol zu und verdunsten Sie, die restlichen bis trocken. Vakuum für weitere 2 h oder über Nacht bei Raumtemperatur trocken.
    4. 12 mL Dekolleté-Lösung mit Trifluoracetic Säure (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 Vol % in einem chemischen Abzug zu machen. Schwenken Sie die Dekolleté-Lösung, um sicherzustellen, dass alles gleichmäßig vermischt ist.
      Achtung: Da Triisopropylsilane und Ethanedithiol luftempfindlichen, Argon purge Lager Fläschchen mit Triisopropylsilane und Ethanedithiol für 1 min vor dem Ablegen wieder.
    5. Stellen Sie die Synthese Gefäß (SV) auf einem Arm-Shaker durch Spannen der unteren Hälfte des SV. Übertragen Sie Peptid-Harz auf die SV mit 2 mL Dekolleté-Lösung, bis alle der Peptid-Harze übertragen werden.
    6. Waschen Sie die Seiten des SV mit 3 mL Dekolleté-Lösung. Schließen Sie den Deckel des SV und schütteln bei 300 Schwingungen/min für 4 h.
    7. Eine leere 50 mL Zentrifugenröhrchen abwiegen. Notieren Sie die Masse.
    8. Entleeren Sie nach 4 h die gespalten Peptidlösung vom SV in der 50 mL Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die SV mehrmals mit der restlichen Dekolleté-Lösung.
    9. Verdunsten Sie gespalten Peptidlösung mit Stickstoff bis gibt es weniger als 4 mL in die Zentrifugenröhrchen bleiben.
    10. 36 mL eiskaltes Äther der Peptid gespalten Projektmappe hinzufügen.
    11. Vortex ist die Lösung bis es komplett weiß oder gelb. Zentrifugieren bei 3.000 x g für 5 min bei 4 ° C, und den Überstand abgießen.
    12. Der Tube 40 mL eiskaltes Äther hinzufügen. Wirbel und beschallen wieder. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Den Überstand abgießen.
    13. Trocknen Sie das rohe PA-Pellet mit Stickstoff Gas spülen, bis der Äther sichtbar verdunstet ist.
    14. Geben Sie 20 mL bidestilliertem Wasser, Wirbel und beschallen bis das Peptid in Lösung vollständig gelöst ist.
    15. Frieren die Lösung und lyophilize trocknen.
    16. Sobald das Peptid getrocknet ist, wiegen Sie die Masse der Zentrifugenröhrchen, das rohe-Peptid enthält. Das rohe Peptid in 5 mg/mL Wasser auflösen.
    17. 25 mg von Rohöl MCP-1-Peptid in 5 mL bidestilliertem Wasser eine totale Konzentration von 5 mg/mL zu lösen. Reinigen Sie das rohe MCP-1-Peptid durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit 0,1 % TFA in Wasser (Lösungsmittel A) und 0,1 % TFA in Acetonitril (Lösungsmittel B) als mobilen Phasen auf einer C8-Reverse-Phase-Spalte. Injizieren Sie die 5 mL des Peptids in der HPLC.
      Hinweis: Die erste mobile Phase bestand aus 100 % Lösungsmittel A bei einer Durchflussrate von 9,0 mL/min Lösungsmittel A langsam auf 30 % in 27 min zu verringern und halten Sie in dieser Zusammensetzung für 3 min. Rückkehr der Gradient zu 100 % Lösungsmittel eine über 3 min und halten an dieser Komposition für 1 min zu geben eine Gesamtlaufzeit von 34 min. halten die Spalte Temperatur bei 55 ° C. Verwenden Sie positive Ionen Quellmodus für die Analyse. Ameisensäure kann anstelle von TFA, verwendet werden, wenn TFS zu sauer für die HPLC-Säule. Es wird empfohlen, die organische Lösungsmittel Zusammensetzung Rampe Geschwindigkeit 2%/min für bessere Trennung nicht überschreiten sollte.
    18. Jede Fraktion mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI) Massenspektrometrie für das erwartete Produkt m/Z bei 2.890 zu analysieren.
      Hinweis: Lösen Sie α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure bei 1 mg/mL in Acetonitril/Wasser (50: 50 Vol-% auf) als die Matrixlösung. Vor Ort 0,75 µL Matrixlösung auf den MALDI-Teller, gefolgt von 0,75 µL der einzelnen Fraktionen. Führen Sie die Analyse mit einem positiven reflektierende Ionen-Modus im Massenbereich von 500-5.000 Da.
    19. Kombinieren Sie Produkt Brüche, Abblasen Acetonitril, Einfrieren und lyophilize gereinigte Peptide bis trocken.
  2. Vorbereitung von MCP-1 PA
    1. Bereiten Sie ein 1.1 molaren Überschuss von 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[Amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000) Maleimide Peptid in separaten funkeln Fläschchen. Lösen Sie beide Verbindungen in bidestilliertem Wasser machen ~ 15 mg/mL. Beschallen Sie für 15 Minuten oder bis beide Lösungen völlig klar sind.
      Hinweis: DSPE-PEG (2000)-Cy5 synthetisiert unter Verwendung des gleichen Protokolls mit DSPE-PEG (2000)-Amin und N-Hydroxysuccinimide (NHS) Ester funktionalisiert Cy5, mit Ausnahme von Schritt 1.2.3, wo der pH-Wert der Lösung bis 8,5 eingestellt wird.
    2. Die Peptidlösung DSPE-PEG (2000)-Maleimide-Lösung hinzufügen. Wirbel und beschallen.
    3. Fügen Sie 1 M NaOH tropfenweise (1 µL) nacheinander, bis der pH-Wert der Lösung 7 beträgt.
    4. Stickstoff-Aufräum-Lösung für 5 min. Rühren Sie die Lösung über Nacht.
    5. Frieren die Lösung und lyophilize trocknen.
    6. Sobald das Rohprodukt getrocknet ist, lösen Sie den Feststoff in 5 mg/mL Wasser auf.
    7. Reinigen Sie mit HPLC, wie oben beschrieben.
      Hinweis: Unconjugated Peptid und DSPE-PEG(2000) sollte zwischen 15-30 % organische Konzentration (Vol%), während DSPE-PEG eluieren (2000)-MCP-1-Konjugat sollte zwischen 40-50 % Bio Konzentration eluieren.
    8. Analysieren Sie jede Fraktion mittels MALDI Massenspektrometrie für die entsprechenden m/z. DSPE-PEG (2000)-MCP-1 eine breite m/Z-Spitze bei 5.760 haben sollte.
      Hinweis: 2,5-Dihydroxybenzoic Acid wird am besten als Matrix für DSPE-PEG (2000)-MCP-1 mit MALDI verwendet.
  3. Montage von MCP-1 PAMs
    1. Auflösen von 1,75 mg MCP-1 PAs mit 3 mL Methanol in einem 1-Dram-Fläschchen. Beschallen Sie bis die MCP-1 PA vollständig gelöst ist.
      Hinweis: Cy5 amphiphilen können in einem molaren Verhältnis von 10: 90 MCP-1 PA für imaging-Anwendungen integriert werden.
    2. Verdampfen Sie das Methanol unter Stickstoff in einer kreisförmigen Bewegung während der Seite des Röhrchens das restliche Methanol abspülen, bis ein gleichmäßiger Film an der Unterseite der Flasche entsteht. Vakuum-trockenen Film über Nacht.
    3. Den Film mit 3 mL Wasser oder Phosphat-Puffer-Hydrat Kochsalzlösung (PBS), eine 100 µM-Lösung von MCP-1 PAMs zu machen. Sanft Wirbel und beschallen die Lösung bis frei. Bei 80 ° C für 30 min inkubieren.
      Hinweis: Die erhöhte Temperatur hat gezeigt, dass die Selbstmontage Prozess beschleunigen und ermöglicht es der Peptid-Komponente, die stabilste Sekundärstruktur zu bilden, während die Senkung der kritischen Micelle Konzentration (CMC)42,43.
    4. Die resultierende Dispersion auf Raumtemperatur abkühlen.

2. Charakterisierung von MCP-1 PAMs

  1. Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zetapotenzial
    1. Platz 100 µM von MCP-1 PAM oder Rührei PAM in eine Küvette gemäß den Anweisungen des DLS oder Zeta potential Instruments.
      Hinweis: DLS und Zeta potential Küvetten können unterschiedlich sein auf der Grundlage des Instruments Anweisungen.
    2. Equilibrate das Instrument auf Raumtemperatur. Messen Sie die Größe und die Oberflächenladung der PAM.
  2. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)
    1. Fügen Sie 7 µL von 50 µM MCP-1 PAM oder Rührei PAM auf ein TEM-Raster ausgesetzt in eine selbstschließende Pinzette für 5 min. Docht das Tröpfchen mit einem heiklen Aufgabe abwischen.
    2. Fügen Sie 7 µL Wasser um das Raster zu waschen. Docht entfernt das Droplet.
    3. Fügen Sie 7 µL 1 wt % Phosphotungstic Acid für 2 min. Docht entfernt das Droplet. Wiederholen Sie Schritt 2.2.2.
    4. Trocknen Sie die TEM-Raster vor TEM Analyse.
  3. Kreisförmigen Dichroismus (CD) Spektroskopie
    1. Schalten Sie den Stickstoff für 5-10 min vor dem Gebrauch des Gerätes.
    2. Küvette 300 µL des Rohlings (Wasser oder PBS) entgegenbringen.
    3. Spektren bei 190-265 nm, 0,2 mm-Länge mit einem 1 s Integrationszeit und 1 nm Bandbreite bei Raumtemperatur zu messen. Sammeln Sie 3 Wiederholungen.
    4. Maßnahme 100 µM-MCP-1-Peptid, MCP-1 PAM, kletterte Peptid und Rührei PAM unter den gleichen Bedingungen im Schritt 2.3.3 beschrieben. Subtrahieren Sie vom Rohling.
    5. Passen Sie die Daten über eine lineare Interpolation von Polylysin Grundlage Spektren.
    6. Schalten Sie das Gerät. Warten Sie 10 Minuten vor dem Ausschalten des Stickstoffs.

3. in-vitro- Analyse der MCP-1 PAMs

  1. In-vitro- Biokompatibilität
    1. Kultur und erweitern WEHI 274,1 murine Monozyten in Dulbeccos geändert Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol in 37 ° C weniger als 5 % CO2 , Abschnitt 5.
      Hinweis: WEHI 274,1 sind Aussetzung Zellen. Bei der Kultivierung, sollten die Medien alle 2-3 Tage wieder aufgefüllt.
    2. Pipettieren Monozyten in den Medien in einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C.
    3. Die alten Medien Aspirieren und in 10 mL frische Medien in die Zentrifugenröhrchen Aufschwemmen. Mischen, langsam, bis die Zellen in den Medien gleichmäßig verteilt sind. Zählen der Zellen verwenden Trypan blau Färbung und eine Hemocytometer.
    4. Verdünnen Sie die Zellen so, dass es 4.000 Monozyten pro 90 µL Medien pro Bohrloch. Fügen Sie 90 µL Zellen in Brunnen eine 96-Well-Platte. 24 h inkubieren.
      Hinweis: Vermeiden Sie die Verwendung der Brunnen auf der Außenkante der Platte, um Unterschiede bei der Verdunstung und thermische Veränderungen in der Platte zu vermeiden. Füllen Sie die äußere Vertiefungen mit 100 µL PBS.
    5. 0,15 µmol MCP-1-Peptid, MCP-1 PAM, Rührei Peptid oder Rührei-PAM in 150 µL PBS in separaten, sterilisierte Mikrozentrifugenröhrchen auflösen. Führen Sie serielle Verdünnung um 65 µL 1, 10 und 100 µM jeder Probe zu machen.
    6. Fügen Sie 10 µL PBS für jede Konzentration in Brunnen mit WEHI 274,1 (Gesamtvolumen: 100 µL pro gut, 6 Zeilen, insgesamt 96 Wells). 72 h inkubieren.
    7. Fügen Sie 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) in jede Vertiefung. 1 h inkubieren.
    8. Analysieren Sie die Absorption mit einem Teller Reader auf 490 nm oder basierend auf den Anweisungen des Herstellers.
  2. In-vitro- Micelle Bindung
    1. Samen 500.000 Monozyten in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in 2 mL Medium mit 100 µM Cy5-Label MCP-1 PAM (10: 90 Molverhältnis von DSPE-PEG (2000)-Cy5 und MCP-1 PA). 1 h inkubieren.
    2. Sammeln Sie WEHI 274,1 durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie die Medien.
    3. Aufschwemmen Sie und waschen Sie die Zellen in 2 mL PBS. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 2 mL PBS. Aspirieren Sie die PBS.
    4. Fügen Sie 2 mL kalten 4 % Paraformaldehyd, die Zellen zu beheben. Bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
    5. Pipettieren der fixen Zellen auf einem sterilen Glas Deckgläschen in Brunnen von einem 6-Well-Platte. 400 X g für 5 min zentrifugieren.
    6. Entfernen Sie die Paraformaldehyd. Waschen und Spülen mit 2 mL PBS einmal. Mit 1 mL PB Aufschwemmen
      Hinweis: Beim Spülen, nicht zu stören die Zellen auf das Deckglas.
    7. Setzen Sie 10 µL von 90 % Glycerin mit PBS-Puffer auf eine Folie. Benutzen Sie eine Nadel und Pinzette um zu holen das Deckglas. Trocknen Sie den Rand des Deckglases. Legen Sie vorsichtig das Deckglas auf einer Folie verdeckt.
    8. Versiegeln Sie vorsichtig den Rand des Deckglases mit klaren Nagellack. Legen Sie in den Kühlschrank bis bereit für die Bildgebung.
    9. Verwenden einen konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (CLSM) installiert mit Lasern für Cy5 bei λErregung = 650 nm.

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Ergebnisse

Vorbereitung von MCP-1 PAM
Das CCR2-Bindung-Motiv (Rückstände 13-35) der MCP-1 Protein [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] oder Rührei Peptid [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] wurde modifiziert, indem ein Cystein-Reste auf dem N-Terminus. Das MCP-1-Peptid wurde durch eine Fmoc-vermittelten Festphasen-Methode unter Verwendung eines automatisierten Peptid-Synthesizers synthetisiert. Das rohe-Peptid wurde gereinigt, durch Reverse-Phase-HPLC auf eine Spalte C8 bei 50 ° C mit 0,1 % TFA in Ace...

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Diskussion

MCP-1 PAMs sind eine vielversprechende molekulare Bildgebung-Plattform, bestehend aus einer hydrophilen targeting Peptid und hydrophobe Endstück, das treibt die selbstgebaute Natur der Nanopartikel. Diese Monocyte-targeting Micelle kann durch einfache Synthese und Reinigungsschritte der MCP-1-Peptid und DSPE-PEG (2000)-MCP-1 hergestellt werden. PAMs haben viele vorteilhafte Eigenschaften für molekulare Bildgebung in Vivo wie ihre Selbstmontage unter milden Bedingungen, intrinsische biologische Abbaubarkeit und s...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren möchten die finanzielle Unterstützung von der University of Southern California, das National Heart, Lung, und Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli Edythe breiten Innovationspreis und l.k. Whittier Stiftung Non-Krebs zu erkennen Translational Research Award, EJC gewährt. Die Autoren danken Zentrum für Elektronenmikroskopie und Mikroanalyse, Center of Excellence in NanoBiophysics, Kompetenzzentrum für molekulare Charakterisierung und translationale Imaging Center der University of Southern California für die Unterstützung bei Instrumental-Setups.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,2-EthanedithiolVWRE0032für die Peptidsynthese
10 mL serologische EinwegpipettenVWR89130-898für Zellkulturen
15 mL Zentrifugenröhrchen, PolypropylenVWR89401-566für verschiedene Anwendungen
2,5-Dihydroxybenzoesäure, 99%Fisher ScientificAC165200050für MALDI
25 mL Einweg serologische PipettenVWR89130-900für Zellkulturen
2-Mercaptoethanol, 50 mMThermoFisher Scientific31350010für Zellkulturen
5 mL serologische EinwegpipettenVWR89130-896für Zellkulturen
50 mL ZentrifugenröhrchenVWR89039-658für verschiedene Anwendungen
75 cm2 KulturkolbenFisher Scientific13-680-65für Zellkulturen
75 mL ReaktionsgefäßProtein Technologies3000005für die Peptidsynthese
96-Wells ZellkulturplatteVWR40101-346für MTS-Assay
Acetonitril, HPLC-QualitätFisher ScientificA998SK-4für die HPLC-Aufreinigung
Borosilikatglas, 1 DramVWR66011-041für die PAM-Synthese
Borosilcat-Glaspipette, lange SpitzenVWR14673-043für verschiedene Anwendungen
Deckglas, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mmFisher Scientific12-542Bfür die konfokale Mikroskopie
Cy5-AminAbcamab146463für die Peptidkonjugation
Diethylether, ACS-QualitätFisher ScientificE138-1für die Peptidfällung
Einweg Spritzen, 20 mLFisher Scientific14-817-54für die HPLC-Aufreinigung
Doppeltes Neubauer-Regel-HämozytometerVWR63510-13für die Zellzählung
DSPE-PEG(2000) AminAvanti880128Pfür die Peptidkonjugation
DSPE-PEG(2000) MaleimidAvanti880126Pfür die Peptidkonjugation
DSPE-PEG(2000)-NHS-Ester NanocsPG2-DSNS-10Kfür die Konjugation mit Cy5
Dulbecco's modifiziertem EagleSigma AldrichD5796-500MLfür die Zellkultur
Fötales Rinderserum, qualifiziertes, hitzeinaktiviertesThermoFisher Scientific10438026für die Zellkultur
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Afür die Peptidsynthese
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBFfür die Peptidsynthese
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NTfür die Peptidsynthese
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CTfür die Peptidsynthese
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QTfür die Peptidsynthese
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ifür die Peptidsynthese
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Lfür die Peptidsynthese
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBCfür die Peptidsynthese
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ffür die Peptidsynthese
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SBfür die Peptidsynthese
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TBfür die Peptidsynthese
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YBfür die Peptidsynthese
Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Vfür die Peptidsynthese
Fmoc-Lys(Boc)-wang Harz, 100-200 meshNovabiochem856013für die Peptidsynthese
Ameisensäure, optima LC/MS-QualitätFisher ScientificA117-50für die HPLC-Aufreinigung
GlycerinVWRM152-1Lfür konfokale Mikroskopie
HandzählerFisherScientific S90189für die Zellzählung
Magnetrührstäbchen, eiförmigesVWR58949-006für die Peptidkonjugation
Methanol, ACS-zertifiziertFisher ScientificA412-4für die PAM-Synthese
kolorimetrisches MTS-Zellproliferations-Assay-KitVWR10191-104für MTS-Assay
N,N-Dimethylformamid, SequenzierqualitätFisher ScientificBP1160-4für die Peptidsynthese
N-MethylmorpholinProtein TechnologiesS-1L-NMMfür die Peptidsynthese
ParaformaldehydFisherScientific AC416780250für die Fixierung von Zellen
PBS, pH 7,4ThermoFisher Scientific10010049für verschiedene Anwendungen
Penicillin/Streptomycin, 10.000 U/mLThermoFisher Scientific15140122für Zellkultur
Peptidsynthesegefäß, 25 mL& nbsp;Fisher ScientificCG186011für die Peptidsynthese
Phosphotungstinsäure Fisher ScientificA248-25für TEM
PiperidinSpectrumP1146-2.5LTGLfür die Peptidsynthese
Objektträger aus einfachem Glas 75 x 25 mmFisher Scientific12-550-A3für konfokale Mikroskopie
Reagenzreservoire, steril VWR95128093für Zellkultur
Selbstschließende PinzetteTedPella515für TEM
TEM TrägerfolieTedPella01814Ffür TEM
TrifluoressigsäureFisher ScientificBP618-500für die Peptidspaltung und HPLC-Aufreinigung
TriisopropylsilanVWRTCT1533-5mlfür die Peptidspaltung
Trypanblau-Lösung, 0,4%ThermoFisher Scientific15250061für die Zellzählung
Pinzette, universell gezahntVWR231-SA-SEfür die konfokale Mikroskopie
WEHI-274.1ATCCATCC  CRL-1679Maus-Monozyten
automatisierter Tisch-PeptidsynthesizerProtein TechnologiesPS3 Tisch-Peptidsynthesizer
α- Cyano- 4- Hydroxyzimtsäure, 99%Sigma Aldrich476870-2Gfür MALDI

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