Da Mitochondrien nur ein kleiner Prozentsatz der Pflanzenzelle sind, benötigen sie für eine Reihe von Studien gereinigt werden. Mitochondrien können aus einer Vielzahl von Pflanzenorganen durch Homogenisierung, gefolgt von Differential und Dichte Gradienten Zentrifugation zu einem hochgereinigten mitochondriale Bruchteil isoliert werden.
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Methodenartikel
Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mitochondrien sind wesentliche Organellen beteiligt zahlreiche Stoffwechselwege in Pflanzen, vor allem die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) aus der Oxidation von reduzierten Verbindungen wie Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide (NADH) und Flavin Adenin Dinucleotide (FADH2). Die vollständige Kommentierung der Arabidopsis Thaliana Genom wurde es festgestellt, als die am weitesten Modell der Anlage verbreitete, und somit die Notwendigkeit, Mitochondrien aus einer Vielzahl von Organen (Blatt, Wurzel oder Blüte) zu reinigen notwendig ist, die Werkzeuge in vollem Umfang nutzen, sind jetzt verfügbar für Arabidopsis, mitochondriale Biologie zu studieren. Mitochondrien sind durch Homogenisierung des Gewebes mit einer Vielzahl von Ansätzen, gefolgt von einer Reihe differentielle Zentrifugation Schritte produzieren einen groben mitochondriale Pellet, der weiter gereinigt wird mit kontinuierlicher kolloidales Dichtegradienten isoliert Zentrifugation. Das kolloidale Dichte Material wird anschließend durch mehrere Zentrifugation Schritte entfernt. Ausgehend von 100 g frisches Blattgewebe, 2-3 mg der Mitochondrien routinemäßig erhalten. Atemwege Experimente auf diese Mitochondrien zeigen typische Preise von 100-250 Nmol O2 min-1 mg Gesamtprotein mitochondriale-1 (NADH-abhängige Rate) mit der Fähigkeit, verschiedene Substrate und Inhibitoren zu verwenden, um festzustellen, welche Substrate werden oxidiert wird und die Kapazität der Alternative und Cytochrom terminal Oxidasen. Dieses Protokoll beschreibt eine Isolierung der Mitochondrien von Arabidopsis Thaliana Blätter mit kontinuierlichen kolloidales Dichtegradienten und eine effiziente Atemwege Messungen der gereinigten Anlage Mitochondrien.
Einleitung
Die Geschichte der mitochondrialen Pflanzenforschung reicht über 100 Jahre1. Intakte Mitochondrien wurden zuerst in den frühen 1950er Jahren isoliert mit differentielle Zentrifugation. Das Aufkommen der kolloidalen Dichtegradient in den 1980er Jahren erlaubt Mitochondrien gereinigt werden, ohne Leiden osmotische Anpassung. Während gradient gereinigte Mitochondrien geeignet für die meisten Zwecke wegen der Empfindlichkeit der Massenspektrometrie sind, auch relativ geringfügige Verunreinigungen können erkannt werden und eine mitochondriale Lage2unangemessen zugewiesen werden können. Die Verwendung von der free Flow-Elektro....
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Protokoll
Dieses Protokoll dient zur Isolierung von intakte Mitochondrien von Arabidopsis Thaliana Organe auf Boden mit kontinuierlichen kolloidales Dichtegradienten angebaut. Alle Verfahren, die nach der Sammlung des Materials erfolgt bei 4 ° C.
1. Vorbereitung des Schleifens Medium, Waschpuffer und Gradient Lösungen
- Bereiten Sie 300 mL des Schleifens Medium (minus Ascorbat und Cystein) und 200 mL 2 X Waschpuffer pro Tabelle 1 einen Tag vor der Isolation, bei 4 ° c halten kühl
Hinweis: Fügen Sie Natrium Ascorbat und L-Cystein (freie Base hinzu), eine Endkonzentration von 17,84 und 20,36 mM, bzw. auf das Schleif....
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Ergebnisse
Dieses Protokoll konnten wir verschiedene mitochondriale Proteine durch SDS-PAGE und Immunoblotting erkennen. Wie in Abbildung 3Adargestellt, ist das Protein isoliert vom Wasser Kultur Gewebe ausreichen, um ein schwaches Band (2 µg) zu erkennen. Signalintensität steigt proportional zu den Beträgen geladen. Für Mitochondrien isoliert von Gewebe gewachsen auf Tellern (Abb. 3 b), die Reaktion auf hohe Lichtstress kann Behandlung in .......
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Diskussion
In der Regel verlässt Isolation von Mitochondrien aus Arabidopsis Renditen bis 3 mg der Mitochondrien von ca. 80-100 3 - 4 - Wochen alten Pflanzen, obwohl Renditen von mehr als 5 mg oft mit gründlichen Schleifen erreicht werden können. Der Ertrag variiert je nach Wachstumsbedingungen und sinkt dramatisch, als Senesce, verlässt obwohl Mitochondrien Struktur scheint während der Seneszenz9gut gepflegt werden. Eines der wichtigsten Features, einen guten Ertrag zu erhalten ist die Methode des Schleifen.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.
Danksagungen
Diese Studie wurde unterstützt durch eine australische Forschung Rat Centre of Excellence in Anlage Energie Biologie CE140100008, eine australische Rat Zukunft Forschungsstipendium (FT130100112), MWM und ein Feodor-Lynen-Forschungsstipendium (Alexander von Humboldt Stiftung, Deutschland), JS.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemikalie |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemikalie, gelöst in Ethanol |
| AOX Antikörper | von Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbat | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbatoxidase von Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemisches |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemische |
| Klarheit westliches ECL-Substrat | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemisches |
| Kriterium Fleckenfreie Fertiggele 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | chemisches |
| Cyanid | Sigma-Aldrich | 60178 | chemisch |
| Cytochrom c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemikalie |
| Difco Agar, granuliert | BD Biosciences | 214530 | Chemikalie |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemikalie |
| EDTA Dinatriumsalz | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemikalie |
| Gamborg B-5 Basalmedium | Austratec | G398-100L | Chemikalie |
| Gamborg Vitaminlösung (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemisches |
| (H + L)-HRP-Konjugat | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemisches |
| Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L)-HRP-Konjugat | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemisches |
| L-Cystein | Sigma | C7352-100G | Chemisches |
| Magnesiumsulfat | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basalsalzmischung (MS) | Austratec | M524-100L | Chemikalie |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemikalie, gelöst in Ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemikalie |
| Ndufs4 Antikörper | von Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propylgallat | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemikalie, in Ethanol lösen |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemisches, kolloidales Dichtegradient |
| Polyvinylpyrrolidon (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemisches |
| Kaliumcyanid | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemisches |
| Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemisches |
| Pyruvat | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemisches |
| Natriumchlorid | Chem-Supply | SA046 | Chemisches |
| Natriumdithionit | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemisches |
| Natrium-L-Ascorbat | Sigma | A4034-100G | |
| Chemisches Succinat | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemisches |
| Saccharose | Chem-Supply | SA030 | Chemisches |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemisches |
| Tetranatriumpyrophosphat (Na4P2O7 & Middot; 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemisches |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemikalie |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemisches, Detergens |
| Western Blocking Reagenz | Sigma | 11921681001 | Chemische |
| Waage | Mettler Toledo | XS204 | Ausrüstung |
| Becher | Isolab | 50 mL | |
| Zentrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Ausrüstung |
| Zentrifugenröhrchen | Nalgene | 3117-9500 | Ausrüstung |
| Zirkulator | Julabo | 1124971 | Angebaut an Sauerstoff-Elektrodenkammer |
| Konischer Kolben | Isolab | 500 mL | |
| Pipette | 3 mL | ||
| Festwinkelrotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Ausrüstung |
| Trichter | Per Alimenti | 14 cm | Zum Filtern |
| Gradientenausgießer | Bio-Rad | 165-4120 | Zur Vorbereitung von Gradienten |
| Magnetrührer ATE | VELP Scientifica | F20300165 Equipment | |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtrationsmaterial |
| Mörser und Stößel | Jamie Oliver | Granit, 6 Zoll | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Sauerstoffüberwachungssoftware | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Sauerstoffelektrode vom Typ Clark |
| Pinsel | Künstler erste Wahl | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Kunststoff-Paraffinfolie |
| Schlauchpumpe | Gilson | F155001 | Zur Vorbereitung von Gradienten |
| PVC-Schlauch | Gilson | F117930 | Zur Vorbereitung von Gradienten |
| Wasserbad | VELP Scientifica | OCB | Ausrüstung |
Referenzen
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell
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Nachdrucke und Genehmigungen
