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Methodenartikel

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

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DOI:

10.3791/56627

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5. Januar 2018

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1ARC Centre of Excellence in Plant Energy Biology, Department of Animal, Plant and Soil Science, School of Life Science, La Trobe University, 2School of Biological Sciences, Flinders University, 3ARC Centre of Excellence in Plant Energy Biology, University of Western Australia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Da Mitochondrien nur ein kleiner Prozentsatz der Pflanzenzelle sind, benötigen sie für eine Reihe von Studien gereinigt werden. Mitochondrien können aus einer Vielzahl von Pflanzenorganen durch Homogenisierung, gefolgt von Differential und Dichte Gradienten Zentrifugation zu einem hochgereinigten mitochondriale Bruchteil isoliert werden.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind wesentliche Organellen beteiligt zahlreiche Stoffwechselwege in Pflanzen, vor allem die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) aus der Oxidation von reduzierten Verbindungen wie Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide (NADH) und Flavin Adenin Dinucleotide (FADH2). Die vollständige Kommentierung der Arabidopsis Thaliana Genom wurde es festgestellt, als die am weitesten Modell der Anlage verbreitete, und somit die Notwendigkeit, Mitochondrien aus einer Vielzahl von Organen (Blatt, Wurzel oder Blüte) zu reinigen notwendig ist, die Werkzeuge in vollem Umfang nutzen, sind jetzt verfügbar für Arabidopsis, mitochondriale Biologie zu studieren. Mitochondrien sind durch Homogenisierung des Gewebes mit einer Vielzahl von Ansätzen, gefolgt von einer Reihe differentielle Zentrifugation Schritte produzieren einen groben mitochondriale Pellet, der weiter gereinigt wird mit kontinuierlicher kolloidales Dichtegradienten isoliert Zentrifugation. Das kolloidale Dichte Material wird anschließend durch mehrere Zentrifugation Schritte entfernt. Ausgehend von 100 g frisches Blattgewebe, 2-3 mg der Mitochondrien routinemäßig erhalten. Atemwege Experimente auf diese Mitochondrien zeigen typische Preise von 100-250 Nmol O2 min-1 mg Gesamtprotein mitochondriale-1 (NADH-abhängige Rate) mit der Fähigkeit, verschiedene Substrate und Inhibitoren zu verwenden, um festzustellen, welche Substrate werden oxidiert wird und die Kapazität der Alternative und Cytochrom terminal Oxidasen. Dieses Protokoll beschreibt eine Isolierung der Mitochondrien von Arabidopsis Thaliana Blätter mit kontinuierlichen kolloidales Dichtegradienten und eine effiziente Atemwege Messungen der gereinigten Anlage Mitochondrien.

Einleitung

Die Geschichte der mitochondrialen Pflanzenforschung reicht über 100 Jahre1. Intakte Mitochondrien wurden zuerst in den frühen 1950er Jahren isoliert mit differentielle Zentrifugation. Das Aufkommen der kolloidalen Dichtegradient in den 1980er Jahren erlaubt Mitochondrien gereinigt werden, ohne Leiden osmotische Anpassung. Während gradient gereinigte Mitochondrien geeignet für die meisten Zwecke wegen der Empfindlichkeit der Massenspektrometrie sind, auch relativ geringfügige Verunreinigungen können erkannt werden und eine mitochondriale Lage2unangemessen zugewiesen werden können. Die Verwendung von der free Flow-Elektrophorese kann beide plastidic entfernen und Peroxisom Kontamination3, aber frei fließen Elektrophorese ist eine hochspezialisierte Technik und ist für die überwiegende Mehrheit der Studien nicht erforderlich. Darüber hinaus tritt bei Bestimmung der Lage eines Proteins muss es sein, dass zwei oder mehrere targeting von Proteinen erinnert in Zellen. Über 100 dual gezielte Proteine sind beschrieben für Chloroplasten/Plastiden und Mitochondrien4und eine Reihe Proteine gezielt an Mitochondrien und Peroxisomen sind auch5bekannt. Darüber hinaus befindet sich re Proteine unter spezifischen Reize, z. B. oxidativen Stress, eine aufkommende Thema in Zelle Biologie6. So die Position der Proteine im Kontext der studierte Biologie betrachtet werden muss, und eine Vielzahl von Ansätzen dienen zu ermitteln und überprüfen der Position2.

Mitochondrien sind in der Regel von Pflanzengewebe durch Homogenisierung isoliert, ein Gleichgewicht zwischen Aufbrechen der Zellwand um Mitochondrien zu lösen, und nicht zu schädigen die Mitochondrien erforderlich ist. Traditionell werden mit Kartoffeln und Blumenkohl, Homogenisierung Haushalt Mixer/Entsafter Apparat zu einem Flüssigextrakt in einem Puffer mit verschiedenen Komponenten zu erhalten. Isolation von Mitochondrien aus Erbse Blätter (ein beliebtes Material für mitochondriale Isolierung mit Jungpflanzen (~ 10 Tage alt), nutzt ein Blender, um Zellen zu lösen, da das Blattmaterial weich ist. Mit der Verfügbarkeit von Arabidopsis Thaliana T-DNA insertional Knock-out-Linien erforderte die Notwendigkeit, Mitochondrien, funktionelle Untersuchungen durchzuführen zu reinigen können die Entwicklung von Methoden zur Mitochondrien aus Blatt, Wurzel oder Blüte isolieren Gewebe. Insgesamt arbeitete für andere Pflanzen entwickelten Methoden gut7mit Perquisite, die Schleifen des Materials musste optimiert werden. Für Arabidopsis dies in eine Vielzahl von Möglichkeiten (siehe unten) erreicht werden kann, und unterscheidet sich zwischen Gewebetypen (Wurzel im Vergleich zu schießen). Die Verwendung des kontinuierlichen Verlaufs auch optimiert werden als die Dichte von Mitochondrien aus verschiedenen Organen oder Entwicklungsstufen bedeutet, dass sie anders migrieren können. Für maximale Trennung kann so die Dichte des Gradienten verfeinert, um sicherzustellen, um beste Trennung zu erreichen.

Einmal gereinigt, die Mitochondrien können für eine Vielzahl von Studien, einschließlich Protein und tRNA-Aufnahme-Experimente, Enzym-Aktivität-Assays, Atmungskette Messungen und western-Blot Analysen verwendet werden. Isolierte Mitochondrien können auch für Massenspektrometrie Analysen der Protein Fülle verwendet werden. Gezielte mehrere Reaktion monitoring (MRM) Analysen ermöglicht die Quantifizierung der Proteine definiert, aber erfordern erhebliche Assay-Entwicklung. Im Gegensatz dazu bietet Quantifizierung von Dimethyl oder anderen Isotop Etiketten8, einen Entdeckung Ansatz bei der Identifizierung von Differenzen über das ganze Proteom, das verwendet werden kann, um neue biologische Einblicke aufzudecken.

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Protokoll

Dieses Protokoll dient zur Isolierung von intakte Mitochondrien von Arabidopsis Thaliana Organe auf Boden mit kontinuierlichen kolloidales Dichtegradienten angebaut. Alle Verfahren, die nach der Sammlung des Materials erfolgt bei 4 ° C.

1. Vorbereitung des Schleifens Medium, Waschpuffer und Gradient Lösungen

  1. Bereiten Sie 300 mL des Schleifens Medium (minus Ascorbat und Cystein) und 200 mL 2 X Waschpuffer pro Tabelle 1 einen Tag vor der Isolation, bei 4 ° c halten kühl
    Hinweis: Fügen Sie Natrium Ascorbat und L-Cystein (freie Base hinzu), eine Endkonzentration von 17,84 und 20,36 mM, bzw. auf das Schleifen Medium am Morgen der Isolation. Wenn die Mitochondrien verwendet werden für western-Blot oder blau Native-Polyacrylamid gel-Elektrophorese (BN-Seite) Analysen, machen 2 x Waschpuffer ohne BSA.
  2. Bereiten Sie Steigungen am Morgen des mitochondrialen Isolierung (Abbildung 1 und Tabelle 1).
    1. Machen Sie die schweren und leichten Farbverlauf Lösungen in zwei Becher; jeweils 35 mL ist ausreichend für zwei Gradienten Röhren.
    2. Die Kammern der gradient aufschrauben und peristaltische PVC-Schläuche mit entionisiertem Wasser waschen und sorgen für gleichmäßigen durch die Schläuche aus allen Rohren.
    3. Platz 2 Zentrifuge Rohre (50 mL) in einem leichten Winkel auf Eis mit PVC peristaltischen Schläuche Steckdosen mit Klebeband an der Innenseite der Rohre um sicherzustellen, dass die Steigung Lösung auf der Seite der Rohre läuft.
    4. Schließen Sie die Verbindung zwischen den inneren und äußeren Kammern (schwarzen Hebel nach unten). Ein Magnetrührer mit einer kleinen Stir Bar in der Innenkammer gradient Ölspender aufsetzen.
    5. Die schwere Steigung Lösung 35 mL in der inneren Kammer (Kammer mit Schlauch austritt) gießen. Die schwere Steigung Lösung in die zwei Zentrifugen-Röhrchen auf Eis gelegt, bis die Hälfte übrig ist, mit der peristaltischen Pumpe Zinssatz (300 mL/h) schnell zu verzichten.
    6. Füllen Sie die 35 mL leichte Steigung Lösung in der äußeren Kammer (Kammer ohne Schlauch austritt). Öffnen Sie die Verbindung zwischen den Kammern (schwarzes Druckhebels bis zur Hälfte) und ermöglichen Sie Lösungen für vorsichtig mischen. Mischen Sie die Lösungen mit den Magnetrührer.
    7. Die Lösungen langsam laufen lassen (60 mL/h), bis alle des Gradienten-Mix hat verzichtet, aus den resultierenden in zwei Kammern 0 - 4,4 % (w/V) Polyvinylpyrrolidon (PVP) Farbverlauf gefüllte Schläuche. Halten Sie die Steigungen auf Eis bis zum Gebrauch in Schritt 2.12.
      Hinweis: Sobald die Steigung vorbereitet ist, verdünnen Sie 2 x waschen Mittel-und 1 X mit prechilled entionisiertem Wasser und halten Kälte bei 4 ° C.

(2) Homogenisierung und mitochondriale Isolation

  1. Ganze Rosette Gewebe aus 4 - Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen am Boden mit einer Schere zu schneiden, sind mindestens 80 Pflanzen für 1 Prep erforderlich.
    Hinweis: Wasser 10-14 Tag alte Kulturen, mindestens 5 Töpfe/Prep oder 2 - Wochen alten Sämlinge angebaut auf Agarplatten Murashige & Skoog basale Salz Mischung (MS), mindestens 4 Platten können auch verwendet werden.
  2. Legen Sie die Hälfte des Pflanzenmaterials, die in kleine Stücke in einem vorgekühlten 4 ° C große Mörser und Stößel mit 75 mL Schleif-Mittel (Tabelle 1) geschnitten wurde, und Schleifen Sie ausgiebig für einige Minuten, bis keine großen Stücke des Gewebes übrig sind.
  3. Vornässen Sie 4 Schichten aus Filtermaterial (22-25 µm Porengröße) mit Schleifen Medium und Filtern Sie Homogenat durch die 4 Schichten von Filtermaterial durch ein Kunststofftrichter in einer konischen 500 mL-Flasche.
  4. Schleifen Sie die andere Hälfte des Gewebes mit einer anderen 75 mL Medium Schleifen.
  5. Homogenates in die Filtermaterialien zu kombinieren und so viel wie möglich Homogenat durch Filtern.
  6. Schleifen Sie das restliche Gewebe noch auf das Filtermaterial wieder mit die restlichen 150 mL Medium, Filter wieder in den 500 mL konische Kolben Schleifen.
  7. Zentrifugieren Sie die gefilterte Homogenat in 8 vorgekühlt 50 mL Kunststoff Zentrifuge Röhren bei 2.500 x g bei 4 ° C in einem festen Winkel-Rotor für 5 min.
  8. Den Überstand in sauberen Zentrifuge Rohre gießen (50 mL; nicht zu stören das grüne Pellet) und Zentrifuge bei 17.500 x g bei 4 ° C für 20 min in einem festen Winkel-Rotor.
  9. Entsorgen Sie alles andere als < 3 mL Überstand durch Absaugen (oder vorsichtig abgießen, ohne zu stören das Pellet). Sanft Aufschwemmen der Pellets in die verbleibende Überstand mit einem kleinen feinen Pinsel.
  10. Jede Röhre 10 mL 1 x Waschpuffer hinzufügen und kombinieren 4 Röhren in 1 sauber Zentrifugenröhrchen (d.h., was in 2 Röhren).
  11. Füllen Sie diese Rohre mit 1 X Waschpuffer bis 50 mL, und wiederholen Sie Schritte 2.7-2.9.
  12. Pool Rohöl mitochondriale Pellets in 1 Rohr mit einer Pipette und gleichmäßig zu verteilen, mit dem feinen Pinsel (eine kleine Menge von Waschpuffer verwendet werden, aber das Endvolumen muss weniger als 3 mL zu passen auf den Farbverlauf). Sanft Schicht der mitochondrialen Suspension mit einer Pipette auf die 2 kontinuierliche 0 - 4,4 % (w/V) PvP-Gradienten.
  13. Rohre nach Gewicht (mit 1 x Waschpuffer) auszugleichen und Zentrifugieren bei 40.000 x g bei 4 ° C für 40 min. Vergewissern Sie sich die Pause ausgeschaltet ist. Mitochondrien migrieren auf ein Band in der Nähe der Unterseite des Rohres, oder möglicherweise vorhanden, in der schweren Lösung an der Unterseite des Rohres (gekennzeichnet durch eine trübe, gelbliche Band; ( Abbildung 2).
  14. Entfernen Sie vorsichtig die oberen 5 cm der Lösung über die mitochondriale Band durch Absaugen.
  15. Verteilen Sie die restliche Lösung mit den Mitochondrien in 2 saubere Rohre und füllen Sie mit 1 x Waschpuffer. Kolloidales Dichtegradienten und Mitochondrien durch Abdecken der Mündung des Rohres mit einem Kunststoff Paraffin-Film und invertieren mehrmals gleichmäßig zu verteilen. Zentrifuge für 15 min bei 31.000 X g bei 4 ° C mit langsamen Bremsen.
    Hinweis: Vor der Zentrifugation, stellen Sie sicher, dass die Mitochondrien und die verbleibende kolloidale Dichtegradient gleichmäßig verteilt werden. Andernfalls kann die kolloidalen Dichtegradient konzentrieren sich an der Unterseite des Rohres und verhindern Pelletierung der Mitochondrien.
  16. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen, füllen Sie der Schlauch mit 1 X waschen Puffer bis zu 50 mL und kehren wieder um Mischen sicherzustellen. Zentrifuge für 15 min bei 31.000 x g bei 4 ° C mit langsamen Bremsen.
  17. Den Überstand abgesaugt und sammeln die mitochondriale Pellets in möglichst kleinem Volumen (~ 500 µL) wie möglich mit einer Pipette mit modifizierten 200 µL Spitzen (schneiden Sie die Spitze ein wenig über seinem Ende zu seiner Eröffnung zu erhöhen). Legen Sie die Mitochondrien in ein 1,5 mL-Tube und halten Sie auf dem Eis für sofortigen Einsatz oder Speicher bei-80 ° C.
    Hinweis: Wenn Mitochondrien für Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) verwendet werden, verwenden BN-Seite oder Immunoblot Analysen, 1 x Waschpuffer ohne BSA für die endgültige wäscht (d.h. Schritt 2.15 und 2.16).
  18. Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins der Mitochondrien mit der Methode von Bradford.
    Hinweis: Für BN-Seite Zentrifuge Aliquote bei 4 ° C und Shop Pellet bei-80 ° C bis zur Verwendung. Für Sauerstoff-Verbrauch-Messungen können nur frisch isolierte Mitochondrien verwendet werden.

(3) Sauerstoff-Verbrauch-Messungen

Hinweis: Sauerstoff-Verbrauch von isolierten frisch Pflanze, die Mitochondrien mit Clark-Typ-Sauerstoff-Elektrode, ermöglicht die Bestimmung der mitochondrialen Unversehrtheit, Cytochrom c Weg Aktivität und alternativen Wegs Aktivität analysiert werden können.

  1. Software-installation
    1. Installieren Sie lizenzierte Sauerstoff monitoring-Software auf dem Computer für Sauerstoff Verbrauch Messungen verwendet.
  2. Vorbereitung der Atmung Medium, Substrate und chemische Stammlösungen der Clark-Typ-Sauerstoff-Elektrode
    1. Bereiten Sie Atmung Medium (300 mM Saccharose, 10 mM NaCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 0,1 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA), 10 mM TES (pH 7,2)) für Sauerstoff-Verbrauch-Assays verwendet.
    2. Bereiten Sie vor, Substrate, Inhibitoren und Effektoren verwendet zur Messung der mitochondrialen Atmung (Tabelle 2). Diese können zuvor zubereitet und bei-20 ° c gelagert
      Hinweis: Neutralisieren den pH-Wert des sauren Lösungen wie organische Säuren, pH 7,0 mit NaOH vor Gebrauch.
    3. Wärmen Sie die Atmung Medium auf die gleiche Temperatur wie der Assay-Kammer (25 ° C).
    4. Montieren Sie die Clark-Typ-Sauerstoff-Elektrode wie im Protokoll des Herstellers beschrieben.
    5. Legen Sie 1 mL Luft-gesättigten Wasser (Luft-gesättigten Wasser erhält man durch kräftig schütteln eine kleine Menge entionisiertem Wasser in einem großen konischen Kolben) in der Messkammer. Um auf den Rührer zu wechseln, klicken Sie auf "Rührer Speed". Klicken Sie auf "On" und stellen Sie die Rührer-Geschwindigkeit auf 65 u/min ein. Klicken Sie auf "OK", um fortzufahren. Rühren Sie das Wasser ständig bei 25 ° C.
  3. Kalibrierung der Sauerstoff-Elektrode
    1. Warmes Wasser, das für die Kalibrierung auf die gleiche Temperatur wie der Assay-Kammer (25 ° C) verwendet werden.
    2. Warten Sie, bis des Stroms zu stabilisieren und die Sauerstoff-Elektrode zu kalibrieren.
    3. Zur Kalibrierung von der Sauerstoff-Elektrode zu starten, klicken Sie auf "Kalibrieren", wählen Sie "Flüssige Phase Kalibrierung" und dann "Luft gesättigtem Wasser."
    4. Ein neues Fenster öffnet sich (Sauerstoff Kalibrierung (Flüssigphase) - Schritt 1 von 5). Wählen Sie den Kanal (den Kanal, dem die Elektrode-Control-Box verbunden ist) zu kalibrieren und geben Variablen (Set "Temperatur" auf 25 ° C und "Luftdruck", 101.32 kPa). Klicken Sie auf "OK", um fortzufahren.
    5. Im nächsten Schritt (Schritt2 von 5), Einrichtung der Rührer Geschwindigkeit (65 u/min) und klicken Sie auf "OK", um fortzufahren.
    6. Warten Sie in Schritt 3 von 5 auf das Signal, ein Plateau zu erreichen. Der Begriff "Plateau erreicht drücken Sie OK, um fortzufahren", wird im Feld angezeigt. Klicken Sie auf "OK", um fortzufahren.
    7. In Schritt 4 von 5 Null Sauerstoff in der Kammer durch Zugabe von 5 mg Natrium Dithionite zu etablieren. Klicken Sie auf "OK", um fortzufahren.
      Hinweis: Ein Rückgang der Sauerstoffkonzentration in der Ablaufverfolgung sichtbar sein soll und sollte 0 erreichen.
    8. Warten Sie im letzten Schritt der Kalibrierung (Schritt 5 von 5) auf das Signal, ein Plateau zu erreichen. Der Begriff "Plateau erreicht drücken Sie OK, um fortzufahren", wird im Feld angezeigt. Klicken Sie auf "OK", um fortzufahren.
    9. Klicken Sie auf "Kalibrierung speichern", um die Kalibrierung zu speichern. Ein neues Fenster wird geöffnet. Klicken Sie auf "OK" zu bestätigen, um die neue Kalibrierung für die Sauerstoff-Control-Box zu speichern.
      Hinweis: Nach erfolgreicher Kalibrierung wird die Kennzeichnung "Sauerstoff (Nmol/mL)" auf der y-Achse angezeigt.
    10. Reinigen Sie nach der Kalibrierung die Messkammer durch Spülen der Kammer mit Wasser (mindestens 5 - 10 Mal) um die ordnungsgemäße Reinigung zu gewährleisten. Platz 1 mL Atmung Medium in der Messung der Kammer und ermöglichen die Membran zu equilibrate für ein paar Minuten, bis die Sauerstoff-Verbrauch-Ablaufverfolgung linear ist.
    11. Passen Sie das Ausmaß der Sauerstoff Verbrauch Spur um gute Neigung zu sehen. Klicken Sie auf "Zoom XY" und geben Sie Variablen (set "Oxygen" 0 - 300 und der "Zeitachse" auf 0 - 45 min).
  4. Bestimmung der mitochondriale Integrität
    1. Mit Kolben offen 970 µL Luft gesättigt Atmung Medium hinzufügen der Reaktionskammer.
    2. Fügen Sie 30 µL isolierte Mitochondrien oder 150 µg Gesamt mitochondrialen Proteins bestimmt nach Mitochondrien Isolierung (Gesamt-Protein muss danach in Kalkulationen einbezogen werden) in die Reaktionskammer mit einer Pipette mit einer abgeschnittenen Spitze.
    3. Rühren Sie die mitochondriale Aussetzung kontinuierlich mit einem Magnetrührer bar (65 u/min) bei 25 ° C Luft-sättigen die Lösung.
    4. Versiegeln Sie die Kammer mit den Kolben zu, klicken Sie auf "Aufzeichnung starten", um Sauerstoff-Verbrauch zu erfassen und lassen Sie Sauerstoff-Verbrauch-Spur (1-2 min) zu stabilisieren.
    5. Die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs manuell nach Zugabe von 10 mM Ascorbat und 25 µM Cytochrom c für 5 min. zu Fuß die "vor dem Waschmittel" Rate bestimmt.
      Hinweis: Um die Zugabe von Substrate, Inhibitoren und Effektoren direkt in der Ablaufverfolgung zu kennzeichnen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Add Event markieren" und geben Sie die entsprechende Bezeichnung Bezeichnung. Klicken Sie auf "OK", um fortzufahren.
    6. Bestimmen Sie die Rate der Sauerstoffverbrauch manuell für 3 min nach dem Hinzufügen von 0,05 % (V/V) Waschmittel "nach Waschmittel" Preis zu geben. Klicken Sie auf "Aufnahme stoppen".
    7. Klicken Sie auf "Preise der Änderungstabelle". 2 Cursor werden als vertikale Linien auf dem Grafik-Bildschirm angezeigt. Klicken Sie und ziehen Sie das Paar der Rate Cursor an den gewünschten Positionen in der Ablaufverfolgung, die Rate-Intervall zu definieren. Bewegen Sie das Rate-Intervall entlang der Ablaufverfolgung mit dem linken Rate Cursor. Festlegen Sie das Rate-Intervall selbst mit dem richtigen Rhythmus-Cursor. Die monitoring-Software automatisch Sauerstoff zeichnet eine Linie Ausgleichsgerade zwischen den zwei Cursor während der Bewegung die Rate Intervall Cursor entlang der Spur.
    8. Sobald die gewünschte Rate Intervall und Position definiert wurde, geben Sie die Rate auf 1 der 2 Cursor in der Tabelle mit der rechten Maustaste, und wählen Sie "Rate zur Tabelle hinzufügen." Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen" bestätigen, um die Rate der Leitzins-Tabelle angezeigt.
    9. Berechnen Sie mitochondriale Integrität zu, indem man die Rate "vor dem Waschmittel" durch die "nach Waschmittel"-Rate, ausgedrückt als Prozentsatz, und subtrahieren sie von 100.
  5. Bestimmung der mitochondrialen Atmung
    1. Fügen Sie mit Kolben offen 970 µL Medium Luft gesättigt Atmung zu der Reaktionskammer hinzu. Fügen Sie 500 µM ATP und 30 µL isolierte Mitochondrien oder 150 µg Gesamt mitochondrialen Proteins mit einer Pipette mit einer geschnittenen Spitze auf das Medium der Atmung in der Reaktionskammer hinzu.
    2. Rühren Sie die mitochondriale Aussetzung kontinuierlich mit einem Magnetrührer bar (65 u/min) bei 25 ° C.
    3. Schließen Sie Kolben zu, klicken Sie auf "Start Recording" um Sauerstoffverbrauch aufzeichnen, und warten Sie 1-2 min für Sauerstoff-Verbrauch zu stabilisieren (wenn die Sauerstoff-Verbrauch-Ablaufverfolgung linear ist). Fügen Sie 5 mM Succinat. Die Rate der Sauerstoffverbrauch für ca. 2 min aufnehmen.
      Hinweis: Um die Zugabe von Substrate, Inhibitoren und Effektoren direkt in der Ablaufverfolgung zu kennzeichnen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Add Event markieren" und geben Sie die entsprechende Bezeichnung Bezeichnung. Klicken Sie auf "OK", um fortzufahren.
    4. Fügen Sie 1 mM Adenosin diphosphat (ADP). Aufnahme der Sauerstoffverbrauch für 2 min weiter.
    5. Fügen Sie 1 mM NADH. Die Rate der Sauerstoffverbrauch für 4-8 min. aufzeichnen. Diese Rate ist die Kapazität der Atmung über Cytochrom-Oxidase.
    6. 1 mM Kaliumcyanid (KCN) (oder 2,5 µM Myxothiazol oder 5 µM Antimycin A) hemmen die Cytochrom c Weg, und weiter für ca. 2 min Sauerstoff-Verbrauch über die alternative Oxidase beobachten aufzeichnen.
    7. Fügen Sie 5 mM Dithiothreitol (DTT) und 10 mM Pyruvat, die alternative Oxidase vollständig zu aktivieren. Für ca. 5-7 min aufnehmen: Dies ist die Kapazität von der alternative Oxidase.
    8. Fügen Sie 500 µM n-Propyl Gallat (nPG) und für 2 min. aufzeichnen. Hierbei wird beurteilt Restsauerstoff-Verbrauch, die chemisch gehemmt werden kann nicht. Subtrahieren Sie diese Rate von den anderen Preisen aufgenommen, da es keine mitochondrialen Ursprungs sein dürfte. Sauerstoff-Verbrauch weiterhin auftritt nachdem Hemmung von Cytochrom c und AOX Weg (von KCN und nPG) sehr wahrscheinlich aus Peroxidasen als Verunreinigungen in den isolierten Mitochondrien9vorhanden ist.
    9. Klicken Sie auf "Aufnahme stoppen".
    10. Klicken Sie auf "Preise der Änderungstabelle" und geben Sie den Kurs in die Tabelle mit der rechten Maustaste auf eines der zwei Cursor, und wählen Sie "Rate zur Tabelle hinzufügen". Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen" bestätigen, um die Rate der Leitzins-Tabelle angezeigt.
      Hinweis: Beim Hinzufügen von Effektoren in organischen Lösungsmitteln aufgelöst (zB., Antimycin A, nPG, Myxothiazol), die Kammer und die Kolben mit Ethanol gespült werden muss und dann Wasser um ordnungsgemäße Reinigung zu gewährleisten.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll konnten wir verschiedene mitochondriale Proteine durch SDS-PAGE und Immunoblotting erkennen. Wie in Abbildung 3Adargestellt, ist das Protein isoliert vom Wasser Kultur Gewebe ausreichen, um ein schwaches Band (2 µg) zu erkennen. Signalintensität steigt proportional zu den Beträgen geladen. Für Mitochondrien isoliert von Gewebe gewachsen auf Tellern (Abb. 3 b), die Reaktion auf hohe Lichtstress kann Behandlung in ...

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Diskussion

In der Regel verlässt Isolation von Mitochondrien aus Arabidopsis Renditen bis 3 mg der Mitochondrien von ca. 80-100 3 - 4 - Wochen alten Pflanzen, obwohl Renditen von mehr als 5 mg oft mit gründlichen Schleifen erreicht werden können. Der Ertrag variiert je nach Wachstumsbedingungen und sinkt dramatisch, als Senesce, verlässt obwohl Mitochondrien Struktur scheint während der Seneszenz9gut gepflegt werden. Eines der wichtigsten Features, einen guten Ertrag zu erhalten ist die Methode des Schleifen...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt durch eine australische Forschung Rat Centre of Excellence in Anlage Energie Biologie CE140100008, eine australische Rat Zukunft Forschungsstipendium (FT130100112), MWM und ein Feodor-Lynen-Forschungsstipendium (Alexander von Humboldt Stiftung, Deutschland), JS.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ADPSigma-AldrichA2754Chemikalie
Antimycin ASigma-AldrichA8674Chemikalie, gelöst in Ethanol
AOX Antikörpervon Tom ElthonElthon et al., 1989
AscorbatSigma-AldrichA0157Ascorbatoxidase von Cucurbita sp.
ATPSigma-AldrichA26209Chemisches
Rinderserumalbumin (BSA)BovogenBSAS 1.0Chemische
Klarheit westliches ECL-SubstratBio-Rad Laboratories1705061Chemisches
Kriterium Fleckenfreie Fertiggele 8-16% 18 WellsBio-Rad Laboratories5678104chemisches
CyanidSigma-Aldrich60178chemisch
Cytochrom cSigma-AldrichC3131Chemikalie
Difco Agar, granuliertBD Biosciences214530Chemikalie
DithiotreitolSigma-AldrichD0632Chemikalie
EDTA DinatriumsalzSigma-AldrichE5134Chemikalie
Gamborg B-5 BasalmediumAustratecG398-100LChemikalie
Gamborg Vitaminlösung (1000x)AustratecG219-100MLChemisches
(H + L)-HRP-KonjugatBio-Rad Laboratories1706516-2mlChemisches
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L)-HRP-KonjugatBio-Rad Laboratories1706515-2mlChemisches
L-CysteinSigmaC7352-100GChemisches
MagnesiumsulfatSigma-Aldrich230391Chemical
Murashige & Skoog Basalsalzmischung (MS)AustratecM524-100LChemikalie
MyxothiazolSigma-AldrichT5580Chemikalie, gelöst in Ethanol
NADHSigma-AldrichN8129Chemikalie
Ndufs4 Antikörpervon Etienne MeyerMeyer et al., 2009
n-PropylgallatSigma-AldrichP3130Chemikalie, in Ethanol lösen
PercollGE Healthcare17-0891-01Chemisches, kolloidales Dichtegradient
Polyvinylpyrrolidon (PVP40)Sigma-AldrichPVP40Chemisches
KaliumcyanidSigma-Aldrich60178Chemisches
Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655Chemisches
PyruvatSigma-AldrichP2256Chemisches
NatriumchloridChem-SupplySA046Chemisches
NatriumdithionitSigma-Aldrich157953Chemisches
Natrium-L-AscorbatSigmaA4034-100G
Chemisches SuccinatSigma-AldrichS2378Chemisches
SaccharoseChem-SupplySA030Chemisches
TESSigma-AldrichT1375Chemisches
Tetranatriumpyrophosphat (Na4P2O7 & Middot; 10H2O)Sigma-Aldrich221368Chemisches
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer KitBio-Rad Laboratories1704271Chemikalie
Triton-X 100Sigma-AldrichX100Chemisches, Detergens
Western Blocking ReagenzSigma11921681001Chemische
WaageMettler ToledoXS204Ausrüstung
BecherIsolab50 mL
ZentrifugeBeckman CoulterAvanti J-26XPAusrüstung
ZentrifugenröhrchenNalgene3117-9500Ausrüstung
ZirkulatorJulabo1124971Angebaut an Sauerstoff-Elektrodenkammer
Konischer KolbenIsolab500 mL
Pipette3 mL
FestwinkelrotorBeckman CoulterJA25.5Ausrüstung
TrichterPer Alimenti14 cmZum Filtern
GradientenausgießerBio-Rad165-4120Zur Vorbereitung von Gradienten
Magnetrührer ATEVELP ScientificaF20300165 Equipment
MiraclothVWREM475855-1RFiltrationsmaterial
Mörser und StößelJamie OliverGranit, 6 ZollEquipment
O2viewHansatech InstrumentsSauerstoffüberwachungssoftware
Oxygraph Plus SystemHansatech Instruments1187253Sauerstoffelektrode vom Typ Clark
PinselKünstler erste Wahl1008R-12
ParafilmBemisPM-996Kunststoff-Paraffinfolie
SchlauchpumpeGilsonF155001Zur Vorbereitung von Gradienten
PVC-SchlauchGilsonF117930Zur Vorbereitung von Gradienten
WasserbadVELP ScientificaOCBAusrüstung
Ziegen-Anti-Maus-IgG

Referenzen

  1. Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
  2. Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
  3. Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
  4. Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
  5. Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
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