Methodenartikel

Schnelle Erkennung von Entwicklungsstörungen Phänotypen in menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (NPCs)

DOI:

10.3791/56628

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2. März 2018

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1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Neurodevelopmental Prozesse wie Proliferation, Migration und Neurit Auswuchs bei neuropsychiatrischen Erkrankungen oft gestört sind. So präsentieren wir Protokolle, um schnell und reproduzierbar Diese Entwicklungsstörungen Prozesse im menschlichen iPSC-abgeleitete NPCs zu beurteilen. Diese Protokolle ermöglichen auch die Bewertung der Auswirkungen der relevanten Wachstumsfaktoren und Therapeutika auf NPC-Entwicklung.

Zusammenfassung

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Die Entwicklung des menschlichen Gehirns durchläuft eine Reihe von genau orchestrierte Prozessen mit früheren Stadien zeichnen sich durch Proliferation, Migration und Neurit Auswuchs; und spätere Phasen geprägt von Axon/Dendrit Auswuchs und Synapse Bildung. In Neuroentwicklungsstörungen sind oft eine oder mehrere dieser Prozesse gestört führt zu Anomalien im Gehirn Bildung und Funktion. Mit dem Aufkommen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Technologie haben Forscher nun ein reichhaltiges Angebot an menschlichen Zellen, die in nahezu jedem Zelltyp, einschließlich Neuronen unterschieden werden können. Diese Zellen können verwendet werden, um normale Gehirnentwicklung und Pathogenese der Krankheit zu studieren. Eine Reihe von Protokollen mit HiPSCs, neuropsychiatrische Krankheit Verwendung unheilbar zu modellieren differenzierten Neuronen oder 3D Culture Nutzungssysteme als Organellen bezeichnet. Während diese Methoden bei der Untersuchung der Pathogenese der Krankheit beim Menschen von unschätzbarem Wert erwiesen haben, gibt es einige Nachteile. Differenzierung der HiPSCs in Neuronen und Generierung von Organellen sind langwierige und kostspielige Prozesse, die Auswirkungen haben können, dass die Anzahl der Experimente und Variablen, die beurteilt werden können. Darüber hinaus während Post-mitotische Neuronen und Organellen die Untersuchung von krankheitsbezogenen Prozessen ermöglichen, einschließlich Dendrit Auswuchs und Synaptogenese, schließt sie die Studie von früheren Prozessen wie Proliferation und Migration. In Neurodevelopmental Störungen wie Autismus gibt reichliche Beweise für genetische und Post-Mortem-Mängel im frühen Entwicklungsprozessen. Neurale Vorläuferzellen (NPCs), eine hohe proliferative Zellpopulation, möglicherweise ein geeignetes Modell, um Fragen über ontogenetische Prozesse und Krankheit Einleitung. Wir erweitern nun Methoden daraus gelernt Entwicklung bei Maus und Ratte kortikale Kulturen an menschliche NPCs. Die Verwendung von NPCs kann wir untersuchen krankheitsbezogenen Phänotypen und definieren, wie die verschiedenen Variablen (z.B., Wachstumsfaktoren, Drogen) Auswirkungen Entwicklungsprozesse einschließlich Proliferation, Migration und Differenzierung in nur wenigen Tagen. Letztlich kann dieses Toolset in gewissem Sinne reproduzierbar und hohem Durchsatz zur krankheitsspezifische Mechanismen und Phänotypen in Neuroentwicklungsstörungen zu identifizieren.

Einleitung

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Die Verwendung von einfacher Organismen und Maus-Modellen hat die Mechanismen der grundlegenden Gehirnentwicklung sowie Pathogenese der Krankheit aufgeklärt. Trotz dieser Fortschritte bleibt die Ätiologie der vielen neuropsychiatrischen Störungen schwer, weil nicht alle Befunde in einfacheren Organismen direkt für komplexe Aspekte der Krankheit beim Menschen relevant sind. Darüber hinaus die größere Komplexität des menschlichen Gehirns oft macht es schwierig, Modell menschlicher Entwicklung und Erkrankungen bei Tieren. Mit der Entwicklung und der Fortschritt der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) Technologie können Körperzellen an Stammzellen umprogrammiert und dann differenziert in neuronalen Zellen, menschlichen Krankheiten zu studieren. Fortschritte in der HiPSCs und "Omic" (Genomik, Transkriptom, Proteomik, Metabolomik) versprechen, das Verständnis der Entwicklung des menschlichen Gehirns zu revolutionieren. Diese Technologien ermöglichen nun einen "Präzisionsmedizin" Ansatz zur Charakterisierung der neuropsychiatrischen Erkrankungen auf einer Schachtel-durchschachtel Grundlage.

Die aktuellen Heftklammer im Feld HiPSC Krankheit-Modellierung ist es, Zellen in bestimmten neuronalen Subtypen in einem monomolekularen Film zu unterscheiden oder eine 3D Culture-System namens eine organoide verwenden, um Aspekte des Gehirns Entwicklung1,2zu rekapitulieren, 3. Diese Systeme wurden unglaublich wertvoll im Studium und die Aufdeckung der einzigartigen Aspekte der menschlichen Entwicklung und Krankheit4,5,6,7. Erfordern jedoch neuronalen Kulturen und Organellen oft überall von Wochen bis Monate in Kultur bevor sie bereit sind zu lernen. Die aufwändige Art der diese Protokolle und die Menge an Ressourcen benötigt um zu halten, dass diese Systeme oft zu begrenzen, die Zahl der Versuche, die durchgeführt werden können und die Anzahl der Variablen (wie Wachstumsfaktoren oder Drogen), die getestet werden können. Darüber hinaus haben viele Studien, die Verwendung von Post-mitotische Neuronen und Organellen auf Prozesse wie Dendrit Auswuchs oder Synapse Bildung, konzentriert, die später in der Entwicklung auftreten. Während dieser Prozesse in der Pathologie des Entwicklungsstörungen wie Autismus und Schizophrenie verwickelt waren, sind früher Entwicklungsstörungen Ereignisse, die vor dem endgültigen neuronaler Differenzierung auftreten auch wichtig für die Pathogenese der Krankheit8 ,9,10,11,12,13. In der Tat zeigen den letzten genomische Studien, dass der Mitte fötale Periode, die Verbreitung, Prozess Auswuchs und Migration besteht, besonders wichtig bei Autismus Pathogenese11,14 ist. So ist es wichtig zu untersuchen, neurale Stammzellen und Vorläuferzellen Zellpopulationen zu diesen früheren Vorgänge besser zu verstehen. Organoide Systeme, die als bessere Zusammenfassend menschlichen Gehirnentwicklung wegen ihrer 3D Natur und organisierte Struktur sind, enthalten einen Stammvater Pool, der verwendet worden ist, um einige dieser früheren Ereignisse zu untersuchen. Jedoch die Stammvater Bevölkerung in Organellen ist oft spärlich und eher wie radiale Gliazellen als neuronale Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen5,15. Daher wäre es vorteilhaft, eine Hochdurchsatz Methode zur frühe Stadien von Neurodevelopment in einem aktiv proliferativer Zellpopulation zu studieren.

Im Labor haben wir eine Protokoll das HiPSC abgeleitet neuronalen Vorläuferzellen (NPCs), eine gemischte Bevölkerung von neuronalen Stammzellen und Vorläuferzellen hoch proliferative verwendet, Entwicklungsstörungen Prozesse wie Proliferation, Zellmigration, zu studieren und Startvorgang (Neuriten) Verlängerung. Diese Tests wurden von Techniken, die in unserem Labor seit Jahrzehnten erfolgreich studieren Neurodevelopment in Ratte und Maus kortikale Kulturen16,17,18,19,20entwickelt, 21,22,23. Wichtiger ist, es wurde auch gezeigt, dass Phänotypen und regulatorische Signale definiert in der Ratte und Maus Kultur hoch prädiktive Mechanismen aktiv in Vivo sind, die den Wert dieser Techniken16, 17,18,19,24. Nach anfänglichen Differenzierung der HiPSCs mit NPCs erlauben diese Methoden uns, wichtige Entwicklungsprozesse in wenigen Tagen zu studieren. Diese Methoden haben viele Vorteile: (1) sie erfordern wenig anspruchsvolle Geräte und sind einfach zu implementieren, (2) zahlreiche experimentelle Wiederholungen durchgeführt werden können, in kurzer Zeit, so dass für die schnelle Bestätigung die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und (3) Kultur-Variablen wie Beschichtung Matrizen, Effekte von Wachstumsfaktoren und Tätigkeit der Drogen können schnell und kostengünstig getestet werden. Darüber hinaus nutzen wir die etablierten Rolle von extrazellulärer Wachstumsfaktoren als wichtige Regulatoren der unterschiedlichen Entwicklungsprozessen. NSCs wurden ausgesetzt, um Entwicklungsstörungen Signale auswählen, die direkt Veranstaltungen wie Proliferation, Neurit Auswuchs und Zellwanderung zu stimulieren, und haben festgestellt, dass sie zur Verbesserung der Fähigkeit, Mängel zu identifizieren, die nicht offensichtlich im Steuerelement Bedingungen19 , 25 , 26 , 27 , 28. ebenso die einfache Bewertung von Medikamenten bietet eine leistungsstarke Allee um Präzision-Medizin-Techniken um zu testen, die Wirksamkeit verschiedener therapeutischer Interventionen zu übernehmen. Dieses Protokoll ermöglicht so ein hoher Durchsatz, reproduzierbar, und einfache Methode zur frühen Entwicklung des Gehirns, Pathogenese der Krankheit und der potenziellen vorteilhaften Wirkungen von Wachstumsfaktoren und Drogen auf Entwicklungsstörungen Phänotypen zu studieren.

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Protokoll

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(1) Sicherheitsverfahren und Biosafety Cabinet Wartung

  1. Biosafety Level-2 (BSL-2) Sicherheitsverfahren
    1. Richtlinien des Instituts auf die Arbeit mit Materialien BSL-2. Entsorgen Sie BSL-2 Materialien entsprechend der Institution Praktiken. Zeigen Sie Räume und Geräte, die für BSL-2 Materialien verwendet werden. Alle persönlichen Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Kittel und Handschuhe zu tragen.
  2. Biosafety Cabinet Wartung
    1. Verwenden Sie eine biologische Kabinett zertifiziert für den Einsatz von BSL-2 Ebene Materialien.
    2. Schalten Sie das UV-Licht in der Biosicherheit Schrank für mindestens 15 Minuten, und sprühen Sie Oberflächen mit 10 % Bleichmittel-Lösung. Lassen Sie das Bleichmittel-Lösung für 15 min sitzen, wischen Sie das Gehäuse und schalten Sie den Luftstrom vor dem Gebrauch.
  3. Radioaktiven gegebenenfalls [3H]-Thymidin (Tritium) Sicherheitsverfahren
    Hinweis: Tritium ist eine Kategorie 5 radioaktiven Quelle, 'den unwahrscheinlichsten gefährlich' Kategorie. Richtlinien des Instituts für das Arbeiten mit Radioaktivität. Einige Institutionen erfordern Zertifizierungen oder Handhabung von Tritium ermöglicht.
    1. Geschult von der Institution wie richtig handhaben und entsorgen von Tritium. Entsorgen von radioaktiven Abfällen in geeignete Behälter gemäß den Richtlinien des Instituts. Tragen Sie beim Arbeiten mit Tritium PSA.

(2) neurale Induktion von iPSCs

Hinweis: Um NPCs zu machen, folgte eine leicht modifizierte Version eines Protokolls, das eine im Handel erhältlichen neurale Induktion Kit begleitet. Das Kit besteht aus Neurobasal (NB) Medien und ein 50 x neurale Induktion Ergänzung (NIS), die verwendet wird, um eine 1 x neurale Induktion Medium (NIM) zu machen. NIS wird auch verwendet, um 100 % zu machen Expansion Medium (siehe Abschnitt 3.1). Ein Link zum Protokoll findet sich in den Materialien und Ausrüstungen und Verweise Abschnitt43.

  1. Durchgang iPSCs wenn sie 70 %-80 % Zusammenfluss geworden.
  2. Platte 300.000 iPSCs in 1 auch von einer hESC-qualifizierte extrazelluläre Matrix-Mimic Gel (ECM-Mimic Gel) beschichtet 6-Well-Platte mit 2 mL Medium Feeder-freien iPSC mit 5 μM ROCK-Inhibitor. Beschichtung-Brunnen mit ECM-Mimic Gel Anleitungen finden Sie unter Abschnitt 3.2.
  3. Einen Tag später, entfernen der iPSC Medium + ROCK-Inhibitor und waschen iPSCs einmal mit 1 X PBS. Die iPSCs 2 mL NIM hinzufügen.
    Hinweis: 50 mL NIM erfolgt durch Zugabe von 1 mL 50 x NIS und 250 µL (50 Einheiten/mL, 5 μL/mL) von Penicillin/Streptomycin (P/S) bis 49 mL NB Medien.
  4. Wechsel-Medien der neuralen Induktion alle 2 Tage durch Absaugen verbrachte Mittel- und ersetzen mit 2 mL NIM bis Zellen werden konfluierende (ca. 4-5 Tage). Wechseln Sie Medium täglich, sobald Zellen konfluierende sind.
  5. Durchgang Zellen nach 7 Tagen im NIM und Platte in einer ECM-Mimic-Gel beschichtet 6-Well-Platte mit 2 mL 100 % Expansion Medien und 5 μM ROCK-Inhibitor. Die Zellen werden Passage 0 (P0) als NPCs an dieser Stelle. Siehe Abschnitt 3.1 unter Anweisungen zu 100 % Expansion Medien.
  6. Durchgang-Zellen unter Verwendung der in Abschnitt 3.4 beschriebenen Methoden. Warten Sie, bis die Zellen erreicht haben P2 und konfluierende vor abkoppelt um Fleck für NPC-Marker und Überzug für Experimente (Abbildung 1).

3. Kultur, Medien, Beschichtung und Wartung von NPCs

  1. Medien-Vorbereitung für Wartung von NPCs (100 % Erweiterung Media):
    1. Durch die Kombination von 24,5 mL DMEM/F12 mit 24,5 mL NB 50 mL 100 % Expansion Medien zu machen
    2. DMEM/F12 + NB Lösung 1 mL 50 X NIS hinzufügen. Medien 250 μL P/S-Lösung hinzufügen.
      Hinweis: Media kann gekühlt (4 ° C) und für bis zu 2 Wochen verwendet. Kleinere Mengen an Medien können erfolgen durch eine Anpassung der Mengen von DMEM / F12 + NB + NIS verwenden die gleichen Verhältnisse wie bei der 50 mL Volumen.
  2. Vorbereitung der ECM-Mimic Gel beschichtet Kultur Platten für NPC-Wartung
    1. Aliquoten ECM-Mimic-Gel mit der Lautstärke 6 mL Arbeitslösung machen musste. Berechnen Sie aliquoten Volumen durch das Zertifikat Analyse Blatt zu betrachten, da ECM-Mimic gel Verdünnungsfaktor von Charge zu Charge und Charge zu Charge variieren.
    2. Ein ECM-Mimic Gel Aliquoten auf Eis auftauen und lösen sich in 6 mL kalte DMEM/F12-Medien.
    3. Fügen Sie 1 mL der ECM-Mimic Gel/DMEM/F12 Lösung in jede Vertiefung eine 6-well-Platte. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte mit ECM-Mimic Gel-Lösung für 30 min bei 37 ° c
    4. Aspirieren Sie ECM-Mimic Gel Lösung nach 30 min Inkubation und ersetzen Sie durch 100 % Expansion Medien oder kühlen Platten (4 ° C, bis zu 1 Woche) ohne Absaugen von ECM-Mimic Gel-Lösung.
  3. Wartung von NPCs
    1. Platte NPCs in einer Dichte von 1,5 Millionen Zellen in einer ECM-Mimic Gel beschichtet gut mit 2 mL 100 % Expansion Medien.
    2. Inkubieren Sie NPCs bei 37 ° C in einer feuchten Umgebung mit 5 % CO2.
    3. Die Medien fügen Sie 5 μM ROCK Inhibitor für NPCs bei P3 oder niedriger oder aufgetauten NPCs, um übermäßigen Zelltod zu verhindern hinzu. Ändern Sie die Medien nach 24 h, ROCK-Inhibitor zu entfernen.
    4. Durchgang Zellen alle 4 bis 9 Tage, je nachdem, wann sie konfluierende geworden. Zellen sind konfluierende betrachtet, wenn sie einen dicht gepackten monomolekularen Film deckt die gesamte Unterseite der Schüssel Oberfläche werden.
    5. NPCs in einer Dichte von 1 bis 1,5 Millionen Zellen pro einen Brunnen von einem 6-Well-Platte-Platte (siehe Abschnitt 3.4). Entfernen Sie verbrauchte Medien alle 48 h und mit 2 mL 100 % Expansion Medien ersetzen.
  4. Heben, distanzieren und Pellet-NPCs für Wartung und/oder Beschichtung für experimentellen Bedingungen
    1. Aspirieren Sie Mittel, waschen Zellen einmal mit 1 X PBS. Aspirieren Sie PBS und fügen Sie 500 μl 1 X Zelle Ablösung Lösung in 1 auch von konfluierende NPCs. Inkubation für 10 min bei 37 ° C.
    2. Fügen Sie 500 μL der Raumtemperatur (RT) PBS und waschen Sie, die gut mit einer Pipette P-1000 zur Entfernung der Zellen zu gewährleisten. Sammeln Sie die Zellen + PBS-Lösung in ein 15 mL konische Röhrchen. Waschen Sie die Platte wieder mit 1 mL PBS und Flüssigkeit in das Rohr.
    3. Drehen Sie die Zellen nach unten mit 300 X g für 5 min zu Pellets.
    4. Entfernen Sie überstand aus der Zelle Pellet und wieder auszusetzen Sie, die Zellen in 1-5 mL vorgewärmten DMEM/F12-Medien. Verdünnen Sie Zellen zu einer Dichte von 1, 4 Millionen Zellen/mL der Medien. Zellen mit einem Hemocytometer zu quantifizieren.
    5. Platte die erforderliche Anzahl von Zellen, spezifisch für NPC Wartung (Abschnitt 3.3) oder der einzelnen Test durchgeführt (siehe nachfolgende Abschnitte für weitere Details).
    6. Einstellen Sie mit Medien Zelle Aussetzung Lautstärke, so dass für jedes gut/Gericht zwischen 15 und 100 μL der Zellen verwendet werden. Dieses kleine Beschichtung Volumen sorgt dafür, dass es sogar Zelle Verteilung und Wachstumsfaktoren, Drogen oder Substrate in das Medium nicht verdünnt werden.
    7. Zellen bei 37 ° c inkubieren Ändern Sie Medien alle 48 h für NPC Wartung oder finden Sie die spezifischen Details für individuelle Assays.
  5. Medien-Vorbereitung auf die experimentellen Bedingungen (30 % Expansion Media)
    1. Verdünnen Sie die 100 % Expansion Medien um 70 % (30 % bezeichnet Expansion) durch Zugabe von 1:1 DMEM/F12 + NB Lösung um Medien für experimentellen Bedingungen zu machen.
    2. Machen Sie 20 mL 30 % Expansion Medien durch Hinzufügen von 6 mL 100 % Expansion Medien und verdünnen mit 7 mL NB und 7 mL DMEM/F12 Medien. 5 µL/mL P/S-Lösung zugeben.
      Hinweis: Enthält 100 % Medien bereits P/S, dann fügen Sie 5 μL/mL für kombinierte DMEM / F12 + NB (14 mL) = x (5 μL/mL) = 70 μL der P/S anstelle von 100µL.
    3. Beschichtung der Substrate und Wachstumsfaktoren in gewünschten Konzentrationen zu den 30 % Expansion Medien hinzufügen.

4. Bewertung von DNA-Synthese, S-Phase eintritt und Zellzahlen von NPCs

  1. Vorbereitung auf die DNA-Synthese, S-Phase Eintritt und Zelle Nummer Assay
    1. Machen Sie eine 1 mg/mL Stammlösung von Poly-D-Lysin (PDL) in dH2O und Filter zu sterilisieren. 01:10 dH2O machen eine 0,1 mg/mL PDL Lösung und jedes gut von einer 24-well-Platte oder 1 mL in eine 35-mm-Schale 300 μL hinzufügen zu verdünnen. 20 min bei RT inkubieren
    2. Waschen Sie PDL Brunnen 3 Mal für 5 min mit dH2O. Aspirat dH2O und 300 μl/Well oder 1 mL/Schüssel mit Laminin (5 μg/mL) 1 X PBS verdünnt. Abdeckplatten mit Parafilm und halten in einer sterilen, Biosafety Kabinett über Nacht bei RT (12 bis 24 h).
    3. Bereiten Sie 30 % Expansion Medien (siehe Abschnitt 3.5) nach 12 bis 24 h. Add Fahrzeuge, Wachstumsfaktoren oder Drogen auf die gewünschte Konzentration in Mengen, die weniger als 10 % der Gesamtlösung, NIS in der 30 % Verdünnung zu vermeiden sind von Interesse Expansion Medium.
    4. Waschen Sie jeweils auch von der 24-Well-Platte zweimal mit 1 X PBS (5 min). 1 X PBS Aspirieren und 450 μL der Medien (ohne oder mit Drogen/Wachstumsfaktoren) hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für mindestens 15 Minuten vor der galvanischen Zellen.
    5. Für jedes Experiment Brunnen oder Gerichte pro Zustand 2-3 einrichten.
    6. Platte NPCs (siehe Abschnitt 3.4):
    7. NPC-DNA-Synthese-Assay: 100.000 Zellen/Brunnen in einer 24-well-Platte
    8. S-Phase Eintrag: 500.000 Zellen/35-Millimeter-Teller
    9. Zelle Nummer Assay: 50.000 Zellen/Brunnen in einer 24-Well-Platte
  2. Neuronale Vorläufer Zelle DNA Synthese Assay
    1. 100.000 Zellen/Brunnen in einer 24-Well-Platte-Platte und in dreifacher Ausfertigung/Zustand zu beurteilen.
    2. Fügen Sie radioaktiv, gegebenenfalls [3H]-Thymidin in das Kulturmedium (1,5 μCi/mL) in jede Vertiefung nach 46 h im Kultur. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 2 h.
      Hinweis: Bei Verwendung von radioaktiven Materialien geschult von Ihrer Institution, folgen Radioaktivität Sicherheitsprotokolle und radioaktive Stoffe in den entsprechend ausgewiesenen Abfall Behälter entsorgen.
    3. Entfernen Sie und ordnungsgemäß entsorgen Sie radioaktive Medien nach 2 h. hinzufügen 300 μL von 0,25 % Trypsin-EDTA (0,5 mM) vorgewärmt in jede Vertiefung und 20 min bei 37 ° c inkubieren
    4. Biegen Sie auf die Zelle-Erntemaschine (siehe Material und Ausrüstung Abschnitt) und die Pumpe und sicherzustellen, dass der Pumpendruck unter 200 PSI. Legen Sie Filterpapier durch den Raum in der Zelle Harvester und Abreißen der rechten Ecke, Papierausrichtung zu markieren.
    5. Sammeln Röhren von Cell Harvester in eine leere "blank" Fach und drücken Sie das Filterpapier anfeuchten eingespült. Sammeln von Rohren in Probe Brunnen und laufen Sie (Start).
    6. Nach Beendigung die Zelle Harvester Proben heben Sie Klemme und Advance Filterpapier für alle Sample-Sets zu wiederholen. Immer in einen leeren, "blank" Teller Vorwäsche.
    7. Filterpapier unter einer Lichtquelle zu trocknen und entsprechenden Fläschchen in einem Fach eingerichtet. Stanzen Sie Papier Chads in Fläschchen aus und jedes Fläschchen fügen Sie 2 mL liquid funkeln cocktail hinzu. Kappe und Label Fläschchen.
    8. Inkubieren Sie das Fläschchen in liquid funkeln cocktail für mindestens 1 h vor dem Lesen der Zählungen pro Minute (CPMs) auf einer Maschine funkeln.
  3. NPC S-Phase Eintrag Assay
    1. Siehe Abschnitt 3.4 für Schritte heben, distanzieren, pellet und Zellen wieder auszusetzen.
    2. Platte 500.000 Zellen pro Schale in die 35 mm-Gerichte, zubereitet in Abschnitt 4.1, nur 1 Gericht/Bedingung für diesen Schritt.
    3. Schütteln Sie Gerichte hin und her in alle Richtungen, um die gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubieren Sie Zellen bei 46 h 37 ° C.
    4. Bereiten Sie drei 35-mm-Platten beschichtet mit PDL/Laminin pro Zustand nach 24 Stunden. Zum Beispiel, wenn es ein 35 mm-Gericht von 30 % Expansion Medien und ein 35 mm-Gericht von 30 % Expansion Media + FGF (10 ng/mL) dann Mantel 6 PDL/Laminin-Platten für den Einsatz am nächsten Tag.
    5. Fügen Sie 2 μL/mL 5 mm EdU Kulturen nach 46 h Inkubation für 2 h.
    6. Distanzieren und pellet-Zellen (siehe Abschnitt 3.4). Wieder aussetzen der Zelle Pellet in 3 mL 30 % Expansion Medien oder 3 mL 30 % Expansion Medien + gewünschten Wachstumsfaktoren/Drogen.
    7. Platte 1 mL pro Teller auf vorbeschichtete PDL/Laminin-Gerichte. Schütteln Sie Gerichte hin und her in alle Richtungen, um die gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubation bei 37 ° C für 2 h damit die Zellen an das Gericht zu halten. Siehe Abbildung 2 für eine vereinfachte Timeline.
  4. S-Phase Eintrag Analyse
    1. Befestigen Sie Gerichte mit eiskalten 4 % Paraformaldehyd (PFA in 1 X PBS) für 20 Minuten. Dann spülen Sie Geschirr 3 Mal für 5 min mit 1 X PBS.
    2. Fügen Sie 1 mL 1 X PBS mit 0,05 % Natriumazid Bakterien- und Pilzinfektionen Wachstum zu verhindern. Zellen können für bis zu 6 Monate bei 4 ° C gelagert werden, wenn Gerichte (mit Parafilm versiegelt), in der PBS + Natrium gehalten werden Azid Lösung, obwohl nicht alle immunologischen Antigene sind gut erhaltene nach langen Verzögerungen in der Analyse.
    3. Zellen unter Verwendung einer kommerziellen EdU Reaktion Assay kit (siehe Protokoll des Herstellers). Zellen mit DAPI oder einem anderen nuklearen Marker zu beflecken, und Bild mit Fluoreszenz-Mikroskopie.
    4. Den Anteil der EdU positive Zellen über insgesamt lebenden Zellen (Zelle Summe Anzahl) Blind in 10 systematisch Zufallsfelder (10 X) zu beurteilen. Enthalten Sie abgestorbenen Zellen nicht in der Analyse.
    5. Nutzen Sie sowohl Kontrast Phasenbilder und fluoreszierende Bilder um positive EdU Färbung bestimmen und um festzustellen, welche Zellen tot sind oder lebendig (Abbildung 3).
    6. Zählen, die alle Zellen, die haben beide glatt und sogar Zellmembran in Phase Kontrasteinstellungen und einen großen unfragmentiert Kern von nuklearen fluoreszierende DAPI färben, wie diese Zellen sind live (Abbildung 3A-B).
    7. Ausgeschlossen Sie werden alle Zellen, die Phase hell sind, haben Sie eine defekte ungleichmäßige Zellmembran und haben Sie einen kleinen, kondensierten Kern wie durch DAPI Leuchtstofflampen bildgebende Verfahren, wie diese Zellen tot sind (Abb. 3A-B) visualisiert. Bewerten Sie lebenden Zellen für den Ausdruck der EdU durch die Identifizierung von Zellen, die hell fluoreszierende EdU Fleck deckt den gesamten Kern oder gesprenkelten fluoreszierende Färbung im Zellkern (Abbildung 3).
  5. NPC Zelle Nummer Assay
    1. Beschriften Sie nach 2 Tagen in Kultur und bereiten Sie Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL und 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie in jedem 0,5 mL Röhrchen 5 μL Trypan blau.
    2. Entfernen Sie in jede Vertiefung von einer 24-well-Platte Medium und 200 μl 1 x Zelle Ablösung Lösung und Platz im Inkubator für 10 bis 15 Minuten.
    3. Nach der vorgegebenen Zeit sobald Zellen aufgehoben haben, fügen Sie die gewünschte Menge 1 X PBS in jede Vertiefung.
      Hinweis: In der Regel am 2. Tag, fügen Sie 300 μl 1 X PBS gut enthaltenden Zellen plus 200 μL der Ablösung Lösung für ein Gesamtvolumen von 500 μL. Mit zusätzlichen Kultur Inkubationszeit wie Zellen mehr konfluierende geworden, Lautstärke Verdünnung wie nötig. Zum Beispiel am 4. Tag fügen Sie 500 μl 1 x PBS und an Tag 6 hinzu, fügen Sie 800 μl 1 X PBS hinzu. Gesamtmengen werden 700 μl und 1 mL betragen.
    4. Mit einer P-1000-Pipette, pipette rauf und runter in jeder gut 4 bis 5 Mal um Zellen zu entfernen. Untersuchen Sie die Platte unter dem Mikroskop um sicherzustellen, dass alle Zellen getrennt haben. Übertragen Sie Zellen auf 1,5 mL Röhrchen.
    5. Invertieren Sie 1,5 mL Röhrchen mit verdünnter Zellen 2 bis 3 Mal. Dann nehmen Sie eine 50 μL aliquoten von Zellen aus der Mitte des Rohres und 0,5 mL Röhrchen mit Trypan blau hinzufügen (siehe 4.5.1).
    6. Pipette Zelle Lösung nach oben und unten 2 bis 3 Mal. Die Hemocytometer Zellen hinzufügen und sofort zu analysieren. Warten länger als 10 min erhöhen kann, Zelltod oder das Vorhandensein von Zellen, die Trypan blau aufgegriffen haben.
    7. Fügen Sie sorgfältig 10 µL der Zelle + Trypan blau Mischung auf jeder Seite des Hemocytometer replizieren Zählungen durchführen. Anzahl Zellen mit der Phase-Kontrast-Mikroskop. Zählen Sie nicht abgestorbenen Zellen oder die dunklen blauen Zellen, die Trypan blau aufgegriffen haben.
    8. Um der gesamte Zelle Nummer, Verwendung der Durchschnitt zu ermitteln Handynummer von 4 Ecken des die Hemocytometer gezählt und gelten die folgende Gleichung:
      Meine Handynummer x Media-Volumen (mL) X 10,000 = Zelle Summe Anzahl/Brunnen
    9. Aspirieren Sie, und wiederholen Sie den Vorgang auf verbleibenden Brunnen. Wechseln Sie das Medium auf die Zellen, die nicht, alle 48 h. Wiederholung Assay auf Tage 4 & 6 gezählt werden.

(5) NPC Neuriten Assay

  1. Vorbereitung der Gerichte und Medien für Neuriten Assay
    1. Machen Sie eine 1 mg/mL Stammlösung von Poly-d-Lysin (PDL) in dH2O und Filter zu sterilisieren. 01:10 dH2O zu machen eine PDL-Lösung 0,1 mg/mL und 1 mL zu jeder 35-Millimeter-Teller zu verdünnen. 20 min bei RT inkubieren
    2. In der Zwischenzeit bereiten Sie 30 % Expansion Medien (siehe Abschnitt 3.5) und den Medien fügen Sie 5 μg/mL (5 µL/mL) der Fibronektin-Lösung (1 mg/mL Brühe hinzu).
    3. Sobald die Medien vorbereitet ist, fügen Sie Fahrzeuge, Wachstumsfaktoren oder Drogen von Interesse bei gewünschten Konzentrationen.
      Hinweis: Es empfiehlt sich, Fahrzeug, Wachstumsfaktoren oder Drogen, bei Lautstärken hinzufügen < 10 % der Gesamtlösung zu verdünnen der Fibronektin und anderen Komponenten in das 30 % Expansion Medium.
    4. Nach 20 min PDL Abwasch, 3 Mal für 5 min mit dH2O, überschüssige PDL zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass Gerichte trocken sind, bevor Sie Medien hinzufügen.
    5. Legen Sie 1 mL der Medien (mit oder ohne Drogen/Wachstumsfaktoren) + Fibronektin Lösung in jeder PDL beschichtete Teller.
    6. Inkubieren Sie Gerichte bei 37 ° C für mindestens 30 min vor der galvanischen Zellen, um die ordnungsgemäße Befestigung des der Fibronektin an die PDL zu gewährleisten.
    7. Für jedes Experiment 2-3 Gerichte pro Zustand (z.B. 3 Fahrzeug-haltigen Gerichte, 3 wirkstoffhaltigen Gerichte) eingerichtet.
  2. Beschichtung-NPCs für Neuriten Assay
    1. Siehe Abschnitt 3.4 für Schritte heben, distanzieren, pellet und Aufschwemmen Zellen.
    2. Platte 50.000 Zellen pro Schale in den Gerichten, die in Abschnitt 5.1. Schütteln Sie Gerichte hin und her in alle Richtungen, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
    3. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 48 h.
  3. Analyse der Neuriten
    1. Nach Inkubation der Zellen für 48 h, Aspirieren Medium, und beheben Sie Gerichte mit Eis kalt 4 % PFA für 20 Minuten.
    2. Waschen Sie nach 20 min Geschirr 3 Mal für 5 min mit 1 X PBS. Nach dem letzten Waschen fügen Sie 1 mL 1 X PBS mit 0,05 % Natriumazid.
    3. Analysieren Sie blind auf eine Phase Kontrast Mikroskop bei 32 X Gerichte. Zählen Sie insgesamt Zellen und Zellen mit Neuriten in 3, 1 cm-Reihen, aber reproduzierbare Positionen nach dem Zufallsprinzip ausgewählt. Zählen Sie ein Minimum von 150 Zellen pro Schale um angemessene Stichproben zu gewährleisten.
      Hinweis: Ein Neurit ist definiert als eine Erweiterung (Prozess) aus der Zelle Körper, > 2 Zellkörper Durchmessern in der Länge. Für Zellen mit mehreren Prozessen gilt als der längste Prozess für das Kriterium. Zellen mit Prozessen, die < 2 Zellkörper Durchmesser Länge sind nicht enthalten (Abbildung 4).
    4. Addieren Sie die Gesamtzahl der Zellen und die Gesamtzahl der Zellen mit Neuriten in jedes Gericht. Berechnen Sie die % der Zellen mit Neuriten. Durchschnitt der Anteil der Zellen mit Neuriten über Replicate Gerichte. Vertrauen in experimentellen Reproduzierbarkeit wird eingerichtet, wenn alle Zeilen innerhalb jedes Gericht ähneln und Durchschnittswerte unter Gerichte sehr ähnlich, mit der Standardfehler des Mittelwertes (SEM sind) < 10 %.
    5. Alternativ Neuriten analysieren, durch die Durchführung von Immunocytochemistry für Marker wie z. B. Beta-III-Tubulin (TUJ1) oder MAP2. Nach der Färbung für die Markierung von Interesse, 10 systematisch Zufallsbilder am ein Fluoreszenz-Mikroskop um 10 X statt. Mindestens 200 Zellen. In diesem Fall erwerben Sie die Bilder nicht zu nah an den Rand der Schale. Den Anteil der Zellen mit TUJ1 oder MAP2 + Neuriten (siehe Abbildung 10 ein Beispiel) zu analysieren.

(6) NPC Neurosphäre Migration Assay

  1. Neurosphäre Bildung
    1. Fügen Sie 1 mL 100 % Expansion Medien in eine 35-mm-Schale mit Substrat keine Beschichtung. Inkubieren Sie Geschirr für mindestens 15 Minuten bei 37 ° C, bevor plating NPCs. Prepare 2-3 Gerichte um sicherzustellen, dass es genügend Neurosphären für die Zelle Migration Assay werden.
      Hinweis: Das Fehlen eines Substrats, Beschichtung sorgt dafür, dass NPCs in den Medien, schweben die für Neurosphäre Bildung unerlässlich ist. Beschichtung-Gerichte werden Neurosphäre Bildung verhindern.
    2. Siehe Abschnitt 3.4 auf Schritte zu heben, zu distanzieren und pellet-Zellen. Aufschwemmen Zelle Pellet in 2-5 mL vorgewärmten 100 % Expansion Medien. Platte 1 Million NPCs in jedes 35-mm-Gericht im Abschnitt 6.1.1 vorbereitet.
    3. Inkubieren Sie NPCs bei 37 ° C für 48 bis 96 h NPCs zu aggregieren und Form Neurosphären zu ermöglichen. Kugelgröße mit einem live Lineal auf dem Phasenkontrast-Mikroskop zu beurteilen. Warten Sie auf die meisten Kugeln, um einen ungefähren Durchmesser von 100 µm (± 20 μm) zu erreichen (Abbildung 5). Kleinere Kugeln werden vollständig zerstreuen und während der Migration Test auseinander brechen.
  2. Vorbereitung der Platten für Neurosphäre Migration Assay
    1. Lösen Sie ECM-Mimic Gel Aliquote (siehe Abschnitt 3.2 auf) in 6 mL 30 % Expansion Medien. ECM-Mimic gel/30% Expansion Medienlösung vorbereitet, fügen Sie Fahrzeuge, Wachstumsfaktoren oder Drogen der Interessen bei gewünschten Konzentrationen hinzu.
      Hinweis: Fahrzeug, Drogen- und Wachstumsfaktor Konzentrationen müssen erhöht werden, um die Zugabe von 200 µL des Neurosphären in Abschnitt 6.3 zu berücksichtigen.
    2. Platte 1 mL der ECM-Mimic gel 30 % Expansion Medienlösung (± Fahrzeuge, Wachstumsfaktoren oder Drogen) in einen Brunnen von einem 6-Well-Platte. 2-3 Brunnen pro Versuchsbedingung zu machen. Alternativ können die 35-mm-Gerichte verwendet werden. Inkubieren Sie Platten für mindestens 30 min bei 37 ° C.
      Hinweis: Aspirieren Sie ECM-Mimic gel/30% Erweiterung Media-Lösung für diesen Test nicht. Kugeln auf einem aspirierten ECM-Mimic Gel Überzug führt zu schnellen und überschüssige Migration.
  3. Beschichtung Neurosphären
    1. Sammeln Sie Neurosphären gebildet in Abschnitt 6.1 zu und legen Sie sie in eine konische Rohr. Waschen Sie die 35 mm gesammelten Gerichte mit 1 mL 1 X PBS um alle Neurosphären zu sicherzustellen. Spin-down den gesammelten Neurosphären 100 X g für 5 Minuten.
    2. Wieder aussetzen die Neurosphären in 1-3 mL vorgewärmten 30 % Expansion Medien. Wenn 1 Teller von Neurospheres erhoben werden, wird 1 mL der Medien verwendet, um Kugeln aufzuwirbeln. Wenn 2 Gerichten erhoben werden, 2 mL der Medien werden hinzugefügt, um die Kugeln zu Aufschwemmen, etc. Pipette vorsichtig und nur eine P-1000 zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Kugeln nicht gebrochen werden.
    3. Platte 200 μL der resuspendierte Neurosphären in der ECM-Mimic gel/30% Expansion Lösung in Abschnitt 6.2 gemacht. Rock-Platten in alle Richtungen Neurosphären gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Platten für 48 h bei 37° c
    4. ECM-Mimic gel/30% Erweiterung Media Lösung entfernen und reparieren Zellen in 4 % PFA, waschen und halten Zellen in 1 x PBS + 0,05 % Natriumazid.
  4. Analyse von Neurospheres
    1. Bilder des gesamten Neurosphären mit Phase Kontrasteinstellungen bei 10 X zu erwerben. Sicherstellen Sie, dass die Kugeln sich nicht gegenseitig berühren. Durchschnittliche Migration mit ImageJ-Software zu messen.
    2. Die Außenkontur des Neurosphäre, die mit dem Freihandlinie Werkzeug zu verfolgen. Die Freihandlinie kann durch einen Rechtsklick auf das Symbol "geraden" zugegriffen werden. Manuell Ablaufverfolgung mithilfe einer Maus.
    3. Verwenden Sie die Messfunktion zur Berechnung der Fläche der Ablaufverfolgung. Sicherstellen Sie, dass "Raum" als eine Auslesung im Fenster "Set Messungen" finden Sie unter der Registerkarte "Analyze" ausgewählt ist. Spur der Außenkontur in Blau finden Sie unter Abbildung 6 .
    4. Der inneren Zellmasse der Kugel und Maßnahme zu verfolgen. Siehe Abbildung 6 für Spur der Innenkontur in rot. Durchschnittliche Migration durch Subtraktion der inneren Zellmasse aus dem gesamten Neurosphäre zu quantifizieren.
    5. Maßnahme Neurosphären, die einen dicht gedrängten inneren Zellmasse mit Zellen, die Migration als einen zusammenhängenden Teppich (Abbildung 6) aufweisen.
    6. Enthalten Sie Zellen außerhalb des Teppichs oder losgelöst von der Neurosphäre für die Messung nicht. Siehe Abbildung 6 Beispiele für Zellen (eingekreist in weiß), die von der äußeren Teppich Messung ausgeschlossen sind. Analysieren Sie ein Minimum von 20 Neurospheres für jede Bedingung.

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Ergebnisse

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Ein Ziel dieser Studien ist die proliferative Aktivität der NPCs, d. h., ein Anstieg der Zellzahlen definieren. Dies wird erreicht durch die DNA-Synthese des gesamten Zellpopulation, eine Hochdurchsatz-Ansatz, der misst der Aufnahme radioaktiver Tracer gegebenenfalls Thymidin in Zelle Extrakten und spiegelt alle Zellen in der S-Phase, seien es Bewertung Synthese für 5 Minuten oder die ganzen zwei Stunden. Darüber hinaus können diese Tests die Bestimmung des Anteils von Zellen, die S-Phase...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hier vorgestellten Protokolle zeigen, schnelle und einfache Methoden, um grundlegende Neurodevelopmental Prozesse zu studieren und Wachstumsfaktoren und Drogen mit HiPSC abgeleitet neuronalen Vorläuferzellen zu testen. HiPSC Technologie hat die Untersuchung der Pathogenese von Entwicklungsstörungen Krankheiten revolutioniert, indem wir uns mit noch nie da gewesenen Zugang zu menschlichen Nervenzellen von betroffenen Personen leben. In der Tat gab es zahlreiche HiPSC Studien von Entwicklungsstörungen des Rett-Syndrom,...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch den Gouverneur von New Jersey Rat für medizinische Forschung und Behandlung von Autismus (CAUT13APS010; unterstützt. CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markiert Familienstiftung, Coverversion Charitable Lead Trust und der jüdischen Gemeinde-Stiftung von größeren MetroWest NJ.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PSC Neuronales Induktionsmedium:
Protokoll-Link: https://goo.gl/euub7a 		ThermoFischer ScientificA1647801Hierbei handelt es sich um ein Kit, das aus neurobasalem (NB) Medium und einem 50x Neural Induction Supplement (NIS) besteht. Das NIS wird verwendet, um 1X neuronales Induktionsmedium und 100% Expansionsmedium
Advanced DMEM/F12 Mediumherzustellen ThermoFischer Scientific12634-010Komponente des 100% Expansionsmediums
Neurobasales MediumThermoFischer Scientific21103049Komponente sowohl von NIM als auch von 100% Expansionsmedium 
hESC-qualifiziertes MatrigelCorning354277hESC-qualifiziertes extrazelluläres Matrix-Gel (ECM-mimisches Gel)
Y-27632 (2HCl), 1 mgStem Cell Technologies72302ROCK-Inhibitor
6-Well-PlattenCorningCOR-3506Polystyrolplatten zur NPC-Erhaltung und für den Neurosphären-Migrations-Assay
24-Well-PlattenThermoFischer Scientific2021-05Polystyrolplatten: Wird für den NPC-DNA-Synthese-Assay
verwendet 35-mm-SchalenThermoFischer Scientific2021-01Polystyrolplatten: Wird für den NPC-S-Phaseneintritt und den Neuriten-Assay verwendet
Natürliches MauslamininInvitrogen23017-015Substrat für Beschichtungsplatten: Wird für die NPC-DNA-Synthese, den S-Phasen-Eintritt und Zellzahl-Assays verwendet
FibronektinSigmaF1141Substrat für Beschichtungsplatten: Wird für den Neurit-Assay verwendet;
Poly-D-LysinSigmaP0899Substrat für Beschichtungsplatten
Penicillin/StreptomycinThermoFischer Scientific15140122Antibiotikum, Bestandteil von NIM, 100% Expansion und 30% Expansion Medien 
StemPro AccutaseGibcoA11105-011X Lösung zur Zellablösung 
2,5 % Trypsin (10X)Gibco15090-04610X enzymatische Lösung
0,5 M EDTAThermoFischer ScientificAM9261zur Verwendung in Trypsin-Lösung zum Heben von Zellen für die DNA-Synthese
Assay tritiiertes [3H]-ThymidinPerkinElmerNET027E001Radioaktives Tritium, Thymidin
Fisherbrand 7 mL HDPE SzintillationsfläschchenFisherbrand03-337-1Fläschchen für die Flüssigszintillationszählung
EcoLite(+)MP Biomedicals0188247501 Flüssiger Szintillationscocktail
LS 6500 Mehrzweck-FlüssigszintillationszählerBeckman Coulter8043-30-1194Flüssigkeitsszintillationszähler
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Typ 11019Molekulare Geräte & Skatron Instruments, Inc.Halbautomatisches Zellerntegerät
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging KitThermoFisher ScientificC10337EdU und Färbekit für S-Phase Entry Assay
Trypanblau-Lösung, 0,4 %ThermoFisher Scientific15250061Beurteilung der Lebensfähigkeit von Zellen
Filterpapier der Güteklasse GF/CGE Healthcare Life Sciences, Whatman1822-849Glasfaser-Filterpapier
Humanes basisches FGF-2Peprotech100-18BWachstumsfaktor
Hypophysen-Adenylatcyclase aktivierendes Polypeptid (PACAP-38)BACHEMH-8430Neuropeptid

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Neural Precursor CellsProliferation AssayMigration AssayNeurosphere FormationEdU LabelingPhase Contrast ImagingImmunocytochemical StainingCell DetachmentTrypan Blue CountingECM Mimic Gel

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