Methodenartikel

In-vitro- Sumoylierung Assay SUMO E3 Ligase Tätigkeit zu studieren

DOI:

10.3791/56629

⸱

29. Januar 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology and Immunology, National Yang-Ming University, 2UC Davis Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis, 4Institute for Translational Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, 5Division of Molecular and Genomic Medicine, National Health Research Institutes, 6Center for Infectious Disease and Cancer Research, Kaohsiung Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Im Gegensatz zu Ubiquitin Ligases wurden einige E3 SUMO Ligases identifiziert. Dieses modifizierte in-vitro- Sumoylierung Protokoll ist in der Lage, neuartige SUMO E3 Ligases durch eine in-vitro- Rekonstitution Assay zu identifizieren.

Zusammenfassung

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Kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikator (SUMO) Modifikation ist eine wichtige Post-translationale Modifikation (PTM), die die Signaltransduktion in erster Linie durch Modulation der Protein-Protein-Wechselwirkungen vermittelt. Ähnlich wie Ubiquitin Modifikation Sumoylierung Regie eine sequenzielle Enzym Kaskade einschließlich E1-aktivierende Enzym (SAE1/SAE2), E2-Konjugation Enzym (Ubc9) und E3-Ligase (d.h., PIAS Familie, RanBP2 und Pc2). Jedoch anders als bei Ubiquitination, eine E3-Ligase ist unwesentlich für die Reaktion aber bieten Präzision und Wirksamkeit für SUMO Konjugation. Geändert von Sumoylierung Proteine können durch in-Vivo -Test über Immunopräzipitation mit Substrat-spezifische Antikörper und Immunoblotting mit SUMO-spezifische Antikörper identifiziert werden. Die Demonstration der Proteinaktivität SUMO E3 Ligase erfordert jedoch in Vitro Rekonstitution von Sumoylierung Assays mit gereinigtem Enzymen, Substrat und SUMO Proteine. Da in den in-vitro- Reaktionen in der Regel SAE1/SAE2 und Ubc9, allein für SUMO Konjugation ausreichen, ist Verbesserung der Sumoylierung durch eine vermeintliche E3-Ligase nicht immer leicht zu erkennen. Hier beschreiben wir eine modifizierte in Vitro Sumoylierung Protokoll, das konsequent SUMO-Modifikation mit einem in-vitro- rekonstituiert System identifiziert. Eine Schritt für Schritt Protokoll, katalytisch aktiven K-bZIP, eine virale SUMO-2/3-E3-Ligase zu reinigen wird ebenfalls dargestellt. Die Sumoylierung Aktivitäten der gereinigten K-bZIP werden p53, einem bekannten Ziel von SUMO angezeigt. Dieses Protokoll kann nicht nur für die neuartige SUMO E3 Ligases Aufklärung, sondern auch für die Preisgabe ihrer SUMO Paralog Spezifität eingesetzt werden.

Einleitung

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SUMO-Umbau wurde zunächst als reversible Post-translationale Modifikation (PTM) identifiziert, die Protein Stabilität1regelt. Neben direkten Konjugation kann SUMO auch an ein Protein durch nicht-kovalente Wechselwirkungen durch SUMO Interaktion Motive (SIMs)2befestigt werden. Ähnlich wie die Bindung der Tyrosyl-Phosphorylierung von Molekülen beherbergen Src Homologie 2 (SH2) oder Phosphotyrosine Bindung (PTB) Domänen3,4, SUMO Modifikation bietet eine zusätzliche Interaktion Plattform für selektive Rekrutierung von SIM-haltigen Effektor Proteine5....

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Protokoll

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1. Vorbereitung des Baculovirus Ausdruck Konstrukte

  1. SUMO-E3-Ligase K-bZIP durch Klonen die cDNA von K-bZIP19 in eine duale Expressionsvektor Baculovirus zu reinigen (siehe Tabelle der Materialien) mit einem N-terminale Epitop-Tag. Wir hatten Erfolg mit einem Octapeptide Tag (angegeben im gesamten Protokoll als Vektor-Tag-K-bZIP).
    Hinweis: Die DNA-Vorlage für K-bZIP Polymerase Kettenreaktion (PCR) Klonen ist cDNA reverse transkribiert von RNA isoliert von TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 Zellen nach Doxycyclin Behandlung20.
    1. Übertrage die Full-length K-bZIP cDNA19 in den....

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Ergebnisse

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Nach den Angaben des Herstellers ist die Freigepäckmenge von E1 und E2 Enzym in der Sumoylierung Assay 50 nM und 500 nM, beziehungsweise. Die minimale Menge an E2 Konjugation Enzym Ubc9, das SUMOylate p53 wurde zuerst durch eine in-vitro- Sumoylierung Assay bestimmt. So niedrig wie ein Fünftel der Höhe der Ubc9 in der standard in Vitro Sumoylierung Assay-Protokoll verwendet effizient SUMOylate p53 konnte (Abb. 1A). Daher wur.......

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Diskussion

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Die in-vitro- Sumoylierung Protokoll hier beschriebenen wird routinemäßig eingesetzt, die Sumoylierung Status der identifizierten Ubc9 Substrate zu etablieren. Die größte Beschränkung des Standardprotokolls Sumoylierung Funktion des SUMO E3 Ligase zu studieren ist die Fülle der Aktivierung von SUMO E1 und E2 Konjugation Enzyme Ubc9, die die SUMO-Konjugation in in-vitro- Systemen zu maximieren. Angesichts dieser Herausforderung glauben wir, dass Titration von der Menge der SUMO E1 und E2 Enzyme auf das N.......

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Offenlegungen

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Die Autoren offenbaren keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST, 105-2320-B-010-007-MY3, PCC), von den National Health Research Institute (NMRI-EX105-10215BC, PCC), des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (die meisten 105-2314-B-400-019 zu HJK) und aus den National Health Research Institute (NMRI MG-105-SP-10, NMRI MG-106-SP-10 bis HJK). Diese Arbeit wurde auch teilweise mit National Yang-Ming University Manuskript Publikation PCC unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder Wiedergutmachung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pFastBacInvitrogen10359-016Baculovirus-Vektor mit doppelter Expression
pCR2.1-TOPO-VektorInvitrogenPCR-Produktvektor
kompetente Zelle  E. coli DH5αHefe BiotechFYE678-80VLkompetente E. coli Zellen A
E. coli DH10BacInvitrogen10359-016kompetente E. coli Zellen B
FugeneHDRoche04709705001Transfektionsreagenz
Opti-MEMGibco31985062reduziertes Serummedium
T4 LigaseNEW England BioLabsM0202S
CpoI (RsrII)Thermo ScientificER0741
Bluo-galThermo ScientificB1690Galactosidase-Substrat
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Grace' s InsektenmediumGibco11605094
fötales RinderserumGibco10082147
GentamicinThermo Fisher15750060
AmpicillinSigma-AldrichA9393-25G
KanamycinSigma-AldrichK0254-20ML
GentamicinGibco15710-064
TetracyclinSigma-Aldrich87128-25G
LB BrothMerk1.10285.0500
HEPESSigma-AldrichH4034-100G
NaClSigma-AldrichS9888-5KG
KClMerk1.04936.1000
Na2HPO4Sigma-AldrichS5136-500G
KH2PO4J.T.Baker3246-01
NatriumdodecylsulfatMerk1.13760.1000
β-mercaptoethanolBio-Rad161-0710
TRIS (Base)J.T.Baker4109-06
Fettfreie MilchFonterra
glycerolJ.T.Baker2136-01
Triton X-100Amresco0694-1LWaschmittel A
Tween 20Amresco0777-500MLWaschmittel B
Poloxamer 188 LösungSigma-AldrichP5556-100MLWaschmittel C
Proteasehemmer Cocktail TabletteRoche04 693 132 001
3x FlaggenpeptidSigmaF4799
anti-FLAG m2 magnetische BeadsSigma-AldrichM8823mit Antikörpern markierte magnetische Beads
SUMOlink SUMO-1 KitActive Motif40120Standard SUMOylierungsprotokoll
SUMOlink SUMO-2/3 KitActive Motif40220Standard SUMOylierungsprotokoll 
QIAquick Gel-ExtraktionskitQIAGEN28704
QIAGEN Plasmid Mini KitQIAGEN12123Plasmid-Extraktionskit
Polypropylen-RöhrchenFalcon352059
PetrischaleFalcon351029
ZellheberCorningCNG3008
LadespitzeSorenson BioScience28480
PVDFPerkinElmerNEF1002
Blotting FilterpapierBio-Rad1703932
Mini Slab Gel Apparatur (Bio-Rad Mini Protean II Cell)Bio-Rad1658001 EDU
Trans-Blot SD Halbtrockene elektrophoretische TransferzelleBio-Rad1703940
Pierce ECL Western BlottingThermo32106ECL
Reagens-SuspensionsmischerDigisystem Laborinstrumente  Inc.SM-3000
OrbitalschüttlerKansin Instruments Co.OS701
ImageQuant LAS 4000
biomolekularer Imager		GE Healthcare28955810
Sf9Thermo ScientificB82501
Anti-p53-AntikörperCell Signaling#9282
Anti-Kaninchen-AntikörperGE HealthcareNA934-1ML

Referenzen

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  1. Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
  2. Lin, D. Y., et al.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

In vitro RekonstitutionK bZIP Aufreinigungp53 SUMOylierungUbc9 EnzymSDS PAGE AnalyseWestern BlottingMagnetbeadsBaculovirus Expression

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