Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes

12K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/56647

⸱

5. Februar 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt einen in-vitro- live-Imaging Phagozytose Assay phagocytic Kapazität von Astrozyten zu messen. Gereinigte Ratte Astrozyten und Mikroglia sind zusammen mit pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes verwendet. Diese Methode kann in Echtzeit Engulfment und Abbau Kinetik erkennen und bietet eine geeignete Screening-Plattform für Astrozyten Phagozytose modulierende Faktoren zu identifizieren.

Zusammenfassung

Astrozyten sind die wichtigen Zelltyp im Gehirn und Synapsen und Blutgefäße direkt zu kontaktieren. Obwohl Mikroglia-Zellen die wichtigsten Immunzellen und nur Fresszellen im Gehirn betrachtet, haben neuere Studien gezeigt, dass Astrozyten auch Teilnahme an verschiedenen phagocytic Prozesse, z. B. Entwicklungsstörungen Synapse Beseitigung und Clearance von Beta Amyloid-Plaques bei Alzheimer-Krankheit (AD). Trotz dieser Erkenntnisse ist die Effizienz der Astrozyten Engulfment und Abbau ihrer Ziele unklar im Vergleich mit der Mikroglia. Dieser Mangel an Informationen ist meist aufgrund des Fehlens von einem Testsystem, in denen die Kinetik der Astrozyten und Mikroglia vermittelt Phagozytose sind leicht vergleichbar. Um dieses Ziel zu erreichen, entwickelten wir einen langfristige live-Imaging in Vitro Phagozytose Assay zur Bewertung der phagocytic Kapazität der gereinigten Astrozyten und Mikroglia. In diesem Test ist Echtzeit-Erkennung von Engulfment und Abbau möglich mit pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes, die leuchtend rote Fluoreszenz in sauren Organellen, wie Lysosomen abgeben. Unsere neuartige Assay bietet einfache und effektive Erkennung von Phagozytose durch live-Imaging. Darüber hinaus kann dieser in-vitro- Phagozytose Assay als Screening-Plattform verwendet werden, um zu identifizieren, Chemikalien und Substanzen, die zu verbessern oder hemmen die phagocytic Kapazität der Astrozyten. Wie synaptic Pruning Fehlfunktion und Pathogene Protein Akkumulation gezeigt wurden, psychischen Störungen oder neurodegenerativen Erkrankungen verursachen, sollte Chemikalien und Substanzen, die die phagocytic Kapazität von Gliazellen modulieren hilfreich bei der Behandlung von verschiedenen neurologische Erkrankungen.

Einleitung

Gliazellen, die nicht leicht erregbaren Zellen im Gehirn beziehen, sind die wichtigen Zelltyp in das zentrale Nervensystem (ZNS). Zuvor galten Gliazellen als bloße Stützzellen, die vor allem passive Rollen bei der Aufrechterhaltung neuronaler überleben und basalen synaptischen Eigenschaften spielen. Anzeichen dafür ergab jedoch, dass Gliazellen in verschiedene Aspekte der Neurobiologie, wie Gehirn Homöostase, Vermittlung von Synapse Bildung1,2,3 und Synapse eine aktivere Rolle spielen Beseitigung4,5, und modulierenden synaptische Plastizität6,7. Gliazellen des ZNS gehören Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia. Zwischen diesen Zellen, Astrozyten und Mikroglia haben gezeigt, dass phagocytic Rollen zu spielen, indem Sie verschlingen Synapsen4,5, apoptotischen Zellen8, neuronale Trümmer9und Pathogene Proteine wie Amyloid beta Plaketten10,11. In das sich entwickelnde Gehirn beseitigen Astrozyten Synapsen im dorsalen seitlichen gekniet Nucleus (CGN) durch MERTK und MEGF10-abhängige Phagozytose4. In ähnlicher Weise Mikroglia auch beseitigen C1q-beschichtete Synapsen während Entwicklungsstadien durch die klassische Ergänzung Kaskade5. Interessanterweise wurde vermutet, dass Mängel in Synapse beschneiden einer der Initiatoren von verschiedenen neurologischen Störungen sein können. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass Mutationen in Ergänzung Komponente 4 (C4), die Ergänzung-vermittelten Synapse Beschneiden von Mikroglia zunimmt, eng mit der Prävalenz von Schizophrenie in Menschen12 sind. Eine neuere Arbeit hat auch gezeigt, dass die klassische Ergänzung Bahn Überaktivierung in der Einleitung von AD und frühem Verlust der Synapse in dieser Krankheit13induziert.

Verglichen mit Mikroglia-vermittelten Phagozytose, ob Astrozyten vermittelt Phagozytose, die Initiierung und Progression von verschiedenen neurologischen Erkrankungen beiträgt, ist weniger klar. Eine neuere Arbeit legt jedoch nahe, dass Faktoren, die die Rate der normalen Synapse Beschneidung von Astrozyten verändern können Gehirn Homöostase zu stören und zu AD Anfälligkeit und Pathologie14beitragen. Die Rate der Synapse Beschneidung von Astrozyten steuert kraftvoll ApoE -Isomere, mit einer schützenden Allel für AD (ApoE2) stark erhöhen die Rate und eine Risiko-Allel für AD (ApoE4) die Rate deutlich zu senken. Darüber hinaus angesammelt transgene Mäuse, die mit dem Ausdruck ApoE4 viel mehr synaptische C1q als Kontrolle oder ApoE2 Mäuse14. Diese Daten deuten darauf hin, dass Sehbehinderte Astrozyten vermittelt Phagozytose in den frühen AD Gehirn kann induzieren die Anhäufung der alternde C1q-beschichtete Synapsen/synaptische Trümmer, die Ergänzung-vermittelten Mikroglia Phagozytose, fahren synaptischen Degeneration aktiviert . Die beeinträchtigte phagocytic Kapazität der Astrozyten in ApoE4 Trägern kann auch die unkontrollierte Anhäufung von Beta Amyloid-Plaques im Gehirn AD betroffen beitragen.

Darüber hinaus hat gezeigt, dass Gliazellen im Gehirn im Alter von Drosophila ihre phagocytic Kapazität aufgrund der verringerten Übersetzung von Draper, ein Homolog des Megf10 , die Astrozyten verwenden verlieren für phagocytosing Synapsen. Wiederherstellen von Draper Ebenen gerettet phagocytic Kapazität von Gliazellen, die effizient beschädigte axonalen Schutt im alten Gehirn in ähnlichem Ausmaß wie im jungen Gehirn darauf hinweist, dass Altern ausgeglichen-induzierte Veränderungen in der phagocytic Kapazität von Astrozyten können zu Störungen des Gehirns Homöostase15beitragen.

Möglicherweise modulieren die phagocytic Kapazität der Astrozyten basierend auf diese neuen Erkenntnisse, eine attraktive therapeutische Strategie zur Vorbeugung und Behandlung von verschiedenen neurologischen Erkrankungen. In diesem Zusammenhang gab es mehrere Versuche, phagocytic Astrozyten, beispielsweise verstärkt durch Induktion Versauerung der Lysosomen mit sauren Nanopartikel16 und überexprimierenden Transkriptionsfaktor EB (TFEB), die erhöhen können Lysosomen Biogenese17. Trotz dieser Bemühungen ist noch unklar, wie Astrozyten und Mikroglia-Zellen unterscheiden sich in ihrer phagocytic Kinetik und ob wir erhöhen oder verringern Sie ihre phagocytic Kapazitäten bei verschiedenen Erkrankungen sollten.

In diesem Beitrag präsentieren wir eine neuartige in-vitro- Test zur Erkennung von phagocytic Kapazität der Astrozyten in Echtzeit. Die Daten zeigen unterschiedliche Kinetik der Engulfment und Abbau in Astrozyten und Mikroglia. Astrozyten konditioniertes Medium (ACM), die von Astrozyten sezernierten Faktoren enthält, ist essentiell für effektive Phagozytose von Astrozyten und Mikroglia. Darüber hinaus spielt Megf10, einen phagocytic Rezeptor in Astrozyten und ein Homolog von Ced-1 und Draper, wichtige Rollen in Astrozyten vermittelt Phagozytose8,18.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Korea Advanced Institute of Science und Technologie institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC), KA2016-08 genehmigt.

1. Synaptosome-Reinigung

Hinweis: Diese Verfahren sind von einer zuvor veröffentlichten Papier19 mit mehreren Änderungen zur Verbesserung der Ausbeute von gereinigten Synaptosomes (Abbildung 1) angepasst.

  1. Diskontinuierlich Dichte Gradienten Medien vorbereiten.
    1. Legen Sie die folgenden auf Eis: 3 %, 10 % und 23 % Dichte Gradienten Lösungen im Farbverlauf Puffer (bringen Sie in 250 mL Wasser mit 109,54 g Saccharose, 606 mg Tris und 5 mL 0,2 M EDTA, pH 7,4); homogenisierende Puffer (25 mL 4 x gradient Puffer und 500 µL 50 mM DTT in 74,5 mL Wasser hinzufügen); Homogenisator Mörser und Stößel.
      Hinweis: Dichte-Gradienten-Lösung und Vorbereitung sind in Tabelle 1dargestellt. Um 3 %, 10 % und 23 % Dichte Gradienten Lösungen vorzubereiten, verwenden Sie Rohdichte gradient Lösung.
    2. Bereiten Sie sechs ultra-klare Zentrifugen-Röhrchen pro drei erwachsenen Mäusen.
    3. Am unteren Rand jeder Zentrifugenröhrchen mit einer 1-mL-Pipette 3 mL 23 % Dichte-Gradienten-Lösung zugeben. Machen Sie langsam dann eine Schicht mit 3 mL 10 % ige Dichte Gradienten Lösung auf die 23 % Dichte Gradienten Lösung mit einer Pipette Weide und 1-mL-Pipette. Schließlich fügen Sie 3 mL 3 % Dichte-Gradienten-Lösung an der Spitze. Verwenden Sie in diesem Schritt Vorsicht, um Einführung von Luftblasen zu vermeiden.
    4. Decken Sie die Zentrifuge Rohre mit Plastikfolie ab und halten Sie die Rohre auf dem Eis.
  2. PreCool, eine High-Speed-Zentrifuge und Ultrazentrifugen bis 4 ° C.
  3. Chirurgische Instrumente (Schere, Schere Castroviejo Frühling und gebogene Pinzetten in Betrieb) mit 70 % Ethanol zu sterilisieren. Bereiten Sie ein kleines Glasgefäß mit 25 mL homogenisierende Puffer auf Eis und wiegen Sie das Becherglas.
  4. Extrahieren Sie die Gehirne von männlichen Mäusen drei Erwachsenen (ca. 12 Wochen alt).
    1. Verrücken Sie der Halswirbel und schneiden Sie den Hals mit einer Schere. Die Haut des Kopfes und der Schädel entlang der Mittellinie mit operativen Schere und gebogenen Zange abziehen. Verbrauchssteuern Sie die olfaktorischen Birnen und Kleinhirn mit einer Schere Castroviejo Frühling.
  5. Legen Sie die restlichen Gehirne in das Becherglas mit gebogenen Pinzette und wiegen Sie die Köpfe. Spülen Sie die Gehirne mehrmals mit eiskalten homogenisierende Puffer, Blut auf der Oberfläche des Gehirns zu entfernen.
    Hinweis: Zuvor war 9 mL homogenisierende Puffer bis 1 g von Hirngewebe empfohlen.
  6. Hinzugeben Sie 4 mL Homogenisieren Puffer und 1 g Hirngewebe Homogenisator Mörtel. Während die Gehirne zu homogenisieren, fügen Sie bis zu 8 mL Puffer homogenisieren.
  7. Das Homogenat in zwei High-Speed-Zentrifuge 50 mL Röhrchen aufteilen. Waschen Sie den Mörtel mit 1 mL frisch homogenisierende Puffer und fügen Sie es an den Rohren.
    Achtung: Fahren Sie durch 1,3-1,7 Schritte so schnell wie möglich. Weniger als 20 Minuten wird empfohlen.
  8. Zentrifuge Homogenates in High-Speed-Zentrifuge Röhren bei 1.000 x g für 10 min bei 4 ° C mit langsamer Bremsen.
    Hinweis: Festgelegt die Entschleunigung Rate (Bremse) an zwei oder drei, wenn der Höchstsatz der Entschleunigung neun ist.
  9. Sorgfältig eine neue 50-mL-Tube überstand hinzu, und fügen Sie bis zu 12 mL homogenisierende Puffer.
  10. Vorsichtig und langsam pipette 2 mL verdünnten Überstand über die 3 % ige Dichte-Gradienten-Lösung mit einer 1-mL-Pipette und die Rohre auf Eis.
  11. Zentrifugieren Sie bei 31.000 x g für 5 min bei 4 ° C ohne Bremsen.
    Hinweis: Die Entschleunigung Rate an einem (null) festgelegt oder Küste.
  12. Legen Sie die Rohre auf dem Eis und sammeln Sie den Synaptosome-Bruch zwischen 23 % Dichte-Gradienten-Lösung und 10 % Dichte-Gradienten-Lösung mit einer 2-mL-Pipette in ein 50-mL-Tube. Fügen Sie eiskalte Saccharose/EDTA Puffer bis zu 80 mL und teilen Sie ihn in vier High-Speed-Zentrifuge 50-mL-Tuben.
    Hinweis: Siehe Abbildung 3 für fraktionierte Synaptosomes mit beschrifteten Steigungen.
  13. Zentrifugieren Sie bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° c, mit weniger Unterbrechungen.
    Hinweis: Festgelegt die Entschleunigung Rate an zwei oder drei, wenn der Höchstsatz der Entschleunigung neun ist.
  14. Sorgfältig entfernen des Überstands mit einer 1-mL-Pipette, Aufschwemmen Synaptosome Pellet mit 1 mL isotonische physiologischen Puffer (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES und 10 mM Glukose, pH 7,4)20. Fügen Sie 1 mL 10 % DMSO in isotonischen physiologischen Puffer (Endkonzentration von DMSO: 5 %) und sammeln Sie die Synaptosomes in eine High-Speed-Zentrifuge 50 mL Tube.
  15. Aliquoten 1 mL in 1,5 mL Röhrchen. Die Konzentration des Proteins von der Synaptosomes mit der Bradford-Test zu messen.
  16. Schnell frieren Sie der Rohre ein und speichern Sie Rohre in einem-80 ° C Tiefkühlschrank bis pH-Indikator-Konjugation zu.

2. pH Indikator Konjugation

  1. Zentrifugieren Sie 1,5 mL Röhrchen mit Synaptosomes 21.092 x g für ca. 3-4 min bei 4 ° C.
  2. Entfernen Sie den Überstand zu, fügen Sie 200 µL 0.1 M Na2CO3 und Mischung gut durch pipettieren.
    Hinweis: Na2CO3 wurde hinzugefügt, um den pH-Wert anzuheben als Succinimidyl Ester am effizientesten mit primären Aminen bei einem leicht alkalischen pH-Wert reagiert.
  3. Am Rohr und sanft Wirbel 2 µL des pH-Indikators hinzufügen.
    Achtung: Verwenden Sie 1 µL des pH-Indikators pro 0,3 mg Synaptosome-Lösung.
  4. Minimieren Sie Belichtung durch die Rohre mit Alufolie abdecken und inkubieren sie 1-2 h bei Raumtemperatur (RT) in einem Twist-Shaker mit sanften Agitation bei 30-40 u/min.
  5. Stoppen Sie Erregung zu und 1 mL des DPBS.
  6. Zentrifugieren Sie die Rohre 21.092 x g für 1-2 min.
  7. Entfernen Sie den Überstand zu und fügen Sie 1 mL des DPBS, das Pellet durch sanfte Pipettieren Aufschwemmen.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 2,6 bis 2,7 mindestens siebenmal, um ungebundenen pH-Indikator zu entfernen.
  9. Entfernen des Überstands und das Pellet mit 200 µL des DPBS mit 5 % DMSO Aufschwemmen.
    Hinweis: an dieser Stelle sind alle Synaptosomes nicht funktionsfähig. Wir haben bestätigt, dass Phosphatidylserin (PS) der äußeren Membran von Synaptosomes, die als fungiert ausgesetzt war eine "Essen-mich" Signal (Abbildung 4).

(3) Astrozyten und Mikroglia Reinigung

Hinweis: Dieses Protokoll für die Astrozyten Reinigung wird aus einer zuvor veröffentlichten Papier21angepasst. In diesem Protokoll wird die Reinigung der Ratte Astrozyten und Mikroglia beschrieben. Spezifische Verfahren zur Reinigung von Maus Astrozyten und Mikroglia sind auch im Anhang beschrieben.

  1. Tag vor der Reinigung
    1. Vorbeschichtete Zelle Kultur Gerichte und Lösungen vorbereiten.
    2. Bereiten Sie fünf 145 mm x 20 mm Petrischalen mit 25 mL 50 mM Tris-HCl (pH 9,5). Platzieren Sie primäre oder sekundäre Antikörper-Behandlung in den Petrischalen separat wie unten beschrieben. Inkubieren Sie die Gerichte in der Tiefkühltruhe über Nacht.
      BSL-1 Schale: 20 µL von 5 mg/mL BSL-1 (Griffonia Simplicifolia Lektin)
      Nur sekundär-Gericht: 60 µL 2,4 mg/mL Ziege Anti-Maus IgG + IgM (H + L)
      CD45 Gericht: 60 µL 2,4 mg/mL Ziege Anti-Maus IgG + IgM (H + L)
      O4-Gericht: 60 µL 2,4 mg/mL Ziege Anti-Maus IgM (µ-Kette-spezifisch)
      Itgb5 (Integrin β5) Gericht für Ratte Astrozyten: 60 µL 2,4 mg/mL Ziege Anti-Maus IgG + IgM (H + L)
      Hinweis: Um die hydrophobe Oberfläche der Petrischale Sekundärantikörper anzubringen, wird langsam Anlage bei niedrigen Temperaturen empfohlen. Allerdings ist es möglich die Petrischale mit Sekundärantikörper für 2 h bei 37 ° C. Antikörper beim Verschieben des Astrozyten sind unterschiedlich je nach Tierart verwendet; z. B. HepaCAM Gericht für Maus Astrozyten: 60 µL 2,4 mg/mL Ziege Anti-Maus IgG + IgM (H + L)
  2. Tag der Läuterung
    1. Immunopanning vorbereiten.
    2. Bereiten Sie 50-mL-Tuben und Hinzufügen von Aktien an den Rohren. Die detaillierte Stammlösung Vorbereitung ist in Tabelle 1dargestellt.
      1. Bereiten Sie Rohr 1 (Enzym): 22 mL Enzym Lager (Enzym-Lager: 1 x Earle es ausgewogen Salzlösung (EBSS)+0.46% D (+)-Glukose + 26 mM Nahco33 und0,5 mM EDTA).
      2. Bereiten Sie Rohr 2 (Low Ovo): 42 mL Inhibitor Lager (Inhibitor Lager: 1 x EBSS+0.46% D (+)-Glukose + 26 Mm Nahco3-3).
      3. Bereiten Sie Rohr 3 (hohe Ovo): 10 mL der Inhibitor Lager.
    3. Die Spitzen der 2-mL Pipetten, verbunden mit einem CO2 (95 % O2 und 5 % CO2) Tank zuordnen Sie 0,22 µm Spritze Filter. Blase CO2 in Röhren 1-3. Stoppen Sie sprudeln, wenn die Lösungen Orange drehen.
    4. Komplettlösungen.
      Achtung: Füllen Sie und inkubieren Sie die Lösung in der Röhre 1 bei 34 ° C für 15 min vor der Verwendung für die Enzym-Aktivierung.
      1. Bereiten Sie Rohr 1 (Enzym): 22 mL Enzym Lager + 180 U Papain + 0,004 g L-Cystein.
      2. Bereiten Sie Rohr 2 (Low Ovo): 42 mL der Inhibitor Lager + 3 mL Low Ovo + 200 µL DNase.
      3. Bereite Rohr 3 (hohe Ovo): 10 mL der Inhibitor Lager + 2 mL hohe Ovo + 20 µL DNase.
      4. Bereiten Sie Schlauch 4 (0,2 % BSA): 19 mL der 1 X DPBS + 1 mL 4 % BSA + 8 µL DNase.
      5. Bereiten Sie Rohr 5 (0,02 % BSA): 1 X DPBS 45 mL + 5 mL Tube 4 + 50 µL DNase.
    5. Heizen Sie einen Wasser-Bad und Wärme-Block bei 34 ° C.
  3. Extrahieren Sie die Ratte Kortex.
    1. Chirurgische Geräte mit 70 % Ethanol zu sterilisieren und 100 mm Petrischalen mit DPBS vorzubereiten.
    2. Bereiten Sie eine Acryl-Box. Legen Sie zwei bis drei Schichten des Gewebes in die Unterseite der Box und 1 mL Isofluran in das Feld ein.
    3. Betäuben Sie Welpen für 20-40 s in der Box zu und bestätigen Sie Anesthetization Fuß Prise mit der Pinzette. Setzen Sie das Herz22 und perfundieren Sie Welpen mit einer 10-mL-Spritze mit DPBS.
      Hinweis: Perfusion wird verwendet, um die Blutkörperchen Kontamination während der Mikroglia verschiebbare Schritt zu vermeiden.
    4. Der Welpe oberen zervikalen Linie des Halses mit operativen Schere geschnitten und die Kopfhaut entlang der Mittellinie einzuschneiden. Auf den Schädel entlang der Mittellinie machen Sie einen Einschnitt und öffnen Sie den Schädel mit gebogenen Pinzette.
    5. Verbrauchssteuern Sie das Kleinhirn mit einer Schere Castroviejo Frühling. Nehmen Sie die restlichen Gehirn und legen Sie sie in ein 100-mm-Petrischale gefüllt mit DPBS.
    6. Entfernen Sie anderen Bereichen wie dem Mittelhirn und Hippocampus mit Castroviejo Feder Schere unter dem Mikroskop aus der Rinde. Entfernen Sie die Hirnhaut mit feinen Pinzette.
    7. Den Kortex in ein neues 60-mm-Gericht zu übertragen und die verbleibenden DPBS in der Schale zu entfernen. Hacken Sie das Gewebe mit einer Klinge Nr. 10.
  4. Die Rinde in einem einzigen Zellsuspension distanzieren
    1. Gießen Sie die gefilterten Rohr 1-Lösung in eine 60-mm-Schale und fügen Sie 50 µL des DNase1. Rühren Sie die Lösung in die Schüssel.
      Hinweis: DNase dient zur Aggregation von DNA aus geplatzten Zellen hemmen.
    2. Legen Sie die Schüssel in ein 34 ° C Heizblock und bedecken Sie es mit einem Deckel, der ein Loch in der Mitte hat. Verwenden Sie einen Lötkolben, um das Loch im Deckel der 60 mm Petrischale zu machen.
    3. Schließen Sie 22-µm-Spritze-Filter zu einem CO2 Tankschlauch an und setzen Sie die Filter-Spitze in das Loch.
    4. Inkubieren Sie der Schüssel bei 34 ° C für 45 min. Wirbel die Lösung in der Schale alle 10 bis 15 Minuten.
  5. Vorbereitung der Schwenk Gerichte zu beenden.
    1. Entfernen Sie die verschiebbare Gerichte, die mit sekundären Antikörper aus dem Gefrierfach einen Tag vor der Zeit beschichtet sind. Lassen Sie die BSL-1 Teller und sekundäre Antikörper nur Gericht bei RT
    2. Waschen Sie die anderen Gerichte dreimal mit 20 mL des DPBS.
    3. Gießen Sie eine ausreichende Menge von 0,02 % BSA in die Gerichte. Platzieren Sie primäre Antikörper in die entsprechenden Gerichte:
      CD45 Gericht: 12 mL 0,02 % BSA + 20 µL 0,5 mg/mL Anti-Ratte Maus CD45
      Itgb5 Gericht: 12 mL 0,02 % BSA + 20 µL 0,5 mg/mL Itgb5
      O4-Gericht: 8 mL 0,02 % BSA und 4 mL O4 Antikörper
      Hinweis: Verwenden Sie für Immunopanning Maus, Maus Anti-Ratte CD45 (0,5 mg/mL) für Mikroglia und HepaCAM (0,5 mg/mL) für Astrozyten.
    4. Bereiten Sie 30 mL 30 % FBS mit Neurobasal Medien und 10 mL 1 X EBSS. Beide Lösungen im 34 ° C Wasserbad erwärmen.
  6. Papain-Reaktion zu hemmen.
    1. Übertragen Sie das Papain-behandelten Gewebe auf eine neue 50-mL-Tube. Warten Sie, bis das Gewebe zu begleichen. Aspirieren Sie Flüssigkeit abgesaugt.
    2. Das Rohr 4 mL Low Ovo-Lösung hinzu und schwenken Sie die Lösung, um die Zellen zu waschen.
    3. Wiederholen Sie Schritte 3.6.1-3.6.2 dreimal um die Enzymreaktion zu stoppen.
  7. Genannte Kortex Gewebe.
    1. Die Wanne 6 mL Low Ovo hinzufügen. Aspirieren Sie und lassen Sie das Gewebe schnell mit einer 5-mL-Pipette.
      Achtung: Stellen Sie Luftblasen.
    2. Bereiten Sie eine neuen 50-mL-Tube und 5 mL Low Ovo. Einzelne Zellen in einem neuen Rohr zu sammeln.
    3. Wiederholen Sie Schritte 3.6.1-3.6.2 zwei Mal und ändern Sie die 5-mL-Pipette in einer 1-mL-Pipette.
    4. Wiederholen Sie die Verreibung, bis mehr als 95 % des Gewebes nicht sichtbar sind.
    5. Machen Sie eine Schicht der hohen Ovo Lösung aus Rohr 3 mit einer 10 mL-Pipette unter niedrigen Ovo-haltigen dissoziiert Zellen.
    6. Zentrifugieren Sie bei 190 X g für 6 min mit paar Bremsen.
      Hinweis: Festgelegt die Entschleunigung-Rate bei ein oder zwei, wenn der Höchstsatz der Entschleunigung neun ist.
  8. Filtrat Einzelzellen.
    1. Vorsichtig Aspirieren des Überstands abgesaugt, dann erneut das Pellet mit 3 mL 0,02 % BSA-Lösung mit einer 1-mL-Pipette.
    2. 0,02 % BSA Lösung hinzufügen bis 9 mL.
    3. Bereiten Sie eine neue 50-mL-Tube und 20 µm Zelle Sieb oben auf das Rohr. Befeuchten Sie die Zelle Sieb mit 1 mL 0,02 % BSA Lösung.
    4. Übertragen Sie die einzelnen Zellsuspension in der Zelle-Sieb. 1 mL auf einmal zu filtern.
    5. Waschen Sie die Zelle Sieb mit 3 mL 0,02 % BSA Lösung. Machen Sie nicht mehr als 15 mL der Suspension gefilterte Einzelzelle.
    6. Inkubieren Sie das Rohr im Wasserbad 34 ° C für 45-60 min für Zelle Erholung. Die Zellen Wiederherstellungsschritt ermöglicht Relokalisierung der Zelle Oberflächenproteine der Membran.
  9. Führen Sie Schwenken der Zellen.
    1. Waschen Sie die CD45 panning Schale dreimal mit 20 mL des DPBS. Waschen Sie jedes Gericht dreimal mit 20 mL des DPBS unmittelbar vor der Anwendung.
    2. Gießen Sie die einzelnen Zellsuspension in der CD45 Schüssel schwenken. Lassen Sie die Schale für 28 min. und schütteln Sie Gericht für 14 min.. Um ungebundene Zellen von der Unterseite zu entfernen, schütteln Sie sorgfältig das Gericht.
    3. Übertragen Sie die Zellsuspension in die Schale nur sekundär. 20 min warten Sie und schütteln Sie vorsichtig die Mahlzeit für 10 Minuten. Um aus der Schale CD45 Mikroglia zu erhalten, gehen Sie zu Schritt 3.9.2.
    4. Die Zellsuspension in den BSL-1 Teller zu übertragen. Lassen Sie die Mahlzeit für 10 bis 12 Minuten.
    5. Transfer in die Schüssel O4. Warten Sie 20 min und 10 min schütteln.
    6. Übertragen Sie in das Itgb5 Gericht. Lassen Sie die Schale für 40 min und schütteln Sie alle 10 Minuten.
      Hinweis: Beim Verschieben des Maus, übertragen Sie die Zellsuspension in das HepaCAM Gericht.
  10. Lösen Sie Zellen aus der Schale.
    1. Mix 400 µL Trypsin (30.000 U/mL in EBSS) mit preincubated 8 mL 1 X EBSS.
    2. Gießen Sie die freistehende Zellsuspension in der Schale in einen Abfall Eimer.
    3. Waschen Sie das Gericht acht Mal mit DPBS.
    4. Gießen Sie 8 mL EBSS mit Trypsin in die Schüssel.
    5. Inkubieren Sie das Gericht für 5 bis 10 min im Inkubator 37 ° C. Inkubieren Sie für 10 Minuten für das CD45-Gericht und 5 min für die Itgb5 und HepaCAM Gerichte.
    6. Tippen Sie auf die Schale und beobachten Sie die Schale unter dem Mikroskop zu.
      Hinweis: Wenn die meisten von den Astrozyten nicht getrennt haben, setzen Sie die Schale wieder in den Brutkasten für weitere 5 Minuten.
    7. Gießen Sie 10 mL 30 % FBS in die Schüssel, Trypsin zu neutralisieren.
    8. Pipette rauf und runter in das gesamte Gericht, Astrozyten und Mikroglia zu lösen.
    9. Übertragen Sie die Lösung in einen 50-mL-Tube.
    10. Fügen Sie 10 mL 30 % FBS und 200 µL DNase in die Schüssel. Die Zellen wieder zu lösen. DNase dient zur Aggregation von DNA aus geplatzten Zellen hemmen.
    11. Übertragen Sie die Lösung in die Röhre. Wenn Zellen in der Schale bleiben, fügen Sie ein weiteres 10 mL 30 % FBS und die Zellen wieder zu lösen.
  11. Platte der Zellen.
    1. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 213 X g für 10 min.
    2. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit Medien.
      Hinweis: Verwenden Sie Immunopanned Astrozyten basischen Medien (IP-ABM) für Astrozyten und Netzhaut Mikroglia basischen Medien (MBM) mit Immunopanned Astrozyten konditioniertes Medien (IP-ACM) für Mikroglia. Die IP-ABM und MBM Kompositionen sind in der Tabelle der Materialienvorgestellt.
    3. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
    4. Platte die Astrozyten und Mikroglia separat in PDL-beschichteten Platten.
      Hinweis: Bereiten Sie die PDL-beschichtete Platte vor dem Gebrauch. PDL-beschichteten Platten vorzubereiten, Gießen Sie eine ausreichende Menge an Lösung in die gut Platte/Schale fügen Sie 50 µL 1 mg/mL Poly-D-Lysin in 5 mL destilliertem Wasser hinzu und warten Sie 30 min. Waschen der Platte/Schale dreimal mit destilliertem Wasser.
    5. Inkubieren Sie die Platte. Ändern Sie die Hälfte der Medien alle 7 Tage für Astrozyten und 3 Tage für Mikroglia.

4. sammeln Sie IP-ACM

  1. Bereiten Sie ein 100-mm-Gericht, wenn Astrozyten übermäßig konfluierende sind.
  2. Entsorgen Sie die Medien und waschen Sie die Schale dreimal mit 10 mL des DPBS.
  3. Gießen Sie 15 mL eiweißarme Medien in die Schüssel.
    Hinweis: Die niedrigen Proteinzusammensetzung Medien wird in der Tabelle der Materialienvorgestellt.
  4. Inkubieren Sie das Gericht für 7 bis 10 Tage im Inkubator 37 ° C.
  5. Sammeln und konzentrieren sich die Medien mit 10k (oder 30k) Zentrifugal Filterschläuche.
  6. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 851 X g bei 4 ° C.
    Hinweis: Zentrifugieren Sie die Rohre, bis die restlichen Medien weniger als 1 mL ist.
  7. Sammeln konzentrierten Medien (IP-ACM) in eine neue 1,5-mL-Tube.
  8. Messen Sie die Konzentration von IP-ACM mittels quantitativer Analysen

(5) Phagozytose Live-Imaging-Assay (Abbildung 2)

  1. Vorbereiten einer 24-Well-Platte (oder jede Platte/Gericht, das für live-Imaging vorbereitet ist) in die Astrozyten konfluierende sind (in der Regel 7 bis 10 Tagen Inkubation nach die Reinigung ideal zur Stabilisierung der Zellen ist).
  2. Entfernen Sie das Medium in jede Vertiefung und waschen Sie die Brunnen mit 1 mL des DPBS, dreimal. Um Luft minimieren, waschen Sie die Brunnen schnell.
  3. Fügen Sie 300 µL IP-ABM mit 5 µL der pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes und weitere Faktoren wie z.B. IP-ACM, die Gliazelle Phagozytose modulieren kann.
  4. Inkubieren Sie die Platte in eine CO2 Inkubator für 40 min. Dieser Schritt ermöglicht es den pH-Wert Indikator konjugiert Synaptosomes an der Unterseite der Platten zu begleichen.
  5. Entfernen Sie das Medium mit ungebundenen pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes und waschen Sie jedes gut mit 1 mL des DPBS, dreimal.
    Achtung: Waschen Sie nicht hart. Um Luft minimieren, waschen Sie die Brunnen schnell.
  6. Fügen Sie IP-ABM 500 µL mit zusätzlichen Faktoren in die Vertiefungen zu testen.
  7. Nehmen Sie die Platte zu einem live-Imaging-Instrument und wählen Sie Positionen. Fokus, Belichtungszeit, Helligkeit und LED Power anpassen.
    Hinweis: Die Einstellungen für Belichtung, Helligkeit und LED-Power sind variabel, je nach Fluoreszenzintensität und den Zweck des Experiments. In der live-Imaging-Test mit pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes wir in der Regel legen Sie diese Werte wie folgt: Exposition: ~ 150-200 ms, Helligkeit: 15 und LED Power: 4-6.
  8. Legen Sie das Bildformat, Zeitintervall und die Gesamtzahl der Zyklen für live-Aufnahmen. Legen das Zeitintervall auf 1 oder 2 h je nachdem, wie viele Positionen ausgewählt sind. 2 Stunden sind Abständen empfohlen, wenn Sie mehr als 150 Positionen für live-Imaging auswählen.
  9. Starten Sie die live-Imaging-Experimenten.
  10. Die Daten zu analysieren.
    1. Die Fidschi-Programm zu öffnen.
    2. Importieren einer Bildsequenz. Umwandeln Sie Bilder in 8-Bit-Graustufen.
    3. Führen Sie Hintergrundabzug mit einem rollenden bar Radius von 50 Pixeln.
    4. Zeit-Serie Analyzer V3 Plugins zu starten.
      Hinweis: Die Adresse für Zeit-Serie-Analyzer V3 Plugins wird in der Tabelle der Materialienvorgelegt.
    5. Ziehen der Region of Interest (ROI) in das Bild und klicken in der ROI-Manager hinzufügen.
    6. Klicken Sie auf "Get Gesamtintensität" in der Zeitreihe V3_0.
    7. Die Ergebnisse speichern und die Daten zu integrieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

In dieser in Vitro Phagozytose Assay mit langfristigen live-Imaging verwendeten wir Synaptosomes von Erwachsenen Maus Gehirn Homogenates, die in der gradient Lösung zwischen 23 % Steigung und 10 % Steigung Lösung, durch Ultrazentrifugation getrennt waren ( ( Abbildung 3). Nach der Zubereitung ausgesetzt Synaptosomes PS in der äußeren Membran (Abbildung 4), was darauf hindeutet, dass sie ihre Funktion verloren und durch P...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

In diesem Artikel präsentieren wir Methoden für einen langfristigen live-Imaging in Vitro Phagozytose-Assay mit gereinigtem Gliazellen und pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes. Wir zeigen, dass im Vergleich zu Mikroglia, Astrozyten besitzen unterschiedlichen Engulfment und Abbau Kapazität während der Phagozytose von Synaptosomes. Darüber hinaus unsere Daten deuten darauf hin, dass Astrozyten abgesondert Faktoren, die Überbrückung Moleküle wie GAS6, Proteine und MEGE8 enthalten, entscheidend für effiziente PS-abh...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Yeon-Joo Jung für ihre experimentelle Unterstützung während Synaptosome Reinigung und Jungjoo Park für Bilder von Synaptosomes mit PS-Exposition. Darüber hinaus danken wir allen Mitgliedern in chungs Labor für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschuss finanziert von der koreanischen Regierung (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 und NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. (C).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Synaptosomen-Aufreinigung
PercollGE Healthcare Life Sciences17-0891-01
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2BIO-RAD5000202
pHIndikator-Konjugation
pHrodo rot, SuccinimidylesterMolecula SondenP36600
Immunopanning
10X Earle' s ausgewogene Salzlösung (EBSS)SigmaE7510
RinderserumalbuminBovogenBSA025
Desoxyrebonuklease 1 (DNase)WorthingtonIs002007
(DMEM)Gibco11960-044
(dPBS)WelgeneLB001-02
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1)Vector LabsL-1100
Ziege Anti-Maus IgG+IgM(H+L)Jackson ImmunoResearch115-005-044
Ziege Anti-Maus IgM (μ-kette)Jackson ImmunoResearch115-005-020
Heparin-bindender epidermaler WachstumsfaktorSigmaE4643
Humaner HepaCAM-AntikörperR& D-SystemeMAB4108
monoklonaler Integrin-Beta-5-Antikörper (KN52)eBioscience14-0497-82
L-CysteinSigmaC7880
L-GlutamatGibco25030-081
N-Acetly-L-Cytein (NAC)SigmaA8199
Neurobasale MedienGibco21103-049
O4 Hybridom überstand(Maus IgM)Bansal et al.23
PapainWorthingtonIs003126
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Pluristrainer 20 μ mPluriSelect43-50020-03
Poly-D-LysinSigmaP6407
ProgesteronSigmaP8783
PutrescindihydrochloridSigmaP5780
Gereinigte Ratte Anti-Maus CD45BD Pharmingen550539
Gereinigte Maus Anti-Ratte CD45BD Pharmingen554875
NatriumpyruvatGibco11360-070
NatriumselenitSigmaS5261
TransferrinSigmaT1147
TrypsinSigmaT9935
TrypsininhibitorWorthingtonLS003086
Ultraklares Rohr (Rohr, dünnwandig, ultraklar)Beckman Coulter344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance Zentrifugalgeräte mit Omega-Membran (10k)PALLMAP010C37
Macrosep Advance Zentrifugalgeräte mit Omega-Membran (30k)PALLMAP030C37
Phagozytose-Live-Imaging-AssayJuli-Tisch
NanoEntek
Time Series Analyzer V3 Pluginshttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html
Dimethylsulfoxid (DMSO)LPS-Lösung DMSO100

Referenzen

  1. Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
  2. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  3. Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
  4. Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
  5. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  6. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
  7. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  8. Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
  9. Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
  10. Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
  11. Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
  12. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
  13. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  14. Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
  15. Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871(2016).
  16. Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
  17. Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
  18. Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355(2017).
  19. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
  20. Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
  21. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

Astrozyten-PhagozytosepH-Indikator-Synaptosomeglialer EinschlussVergleich mit MikrogliaSynaptosomen-PräparationTime-lapse-ImagingFluoreszenzquantifizierungMEGF10-KnockoutScreening neurologischer Erkrankungen
Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.