In dieser Studie beschreiben wir den hinteren Semicircular Kanal-Ansatz als eine zuverlässige Methode für Innenohr-gen Lieferung bei neugeborenen Mäusen. Wir zeigen, dass gen-Lieferung durch den hinteren Semicircular Kanal in der Lage, das gesamte Innenohr durchspülen.
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Methodenartikel
Posterior Semicircular Canal Ansatz für Innenohr-gen Lieferung in Neugeborenen Maus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Innenohr Gentherapie bietet große Versprechung als potenzielle Behandlung von Schwerhörigkeit und Schwindel. Der wichtige Determinanten für den Erfolg des Innenohrs Gentherapie ist eine Lieferung Methode zu finden, die konsequente Transduktion Effizienz der gezielten Zelltypen führt bei gleichzeitiger Minimierung der Hörverlust. In dieser Studie beschreiben wir den hinteren Semicircular Kanal-Ansatz als eine praktikable Methode für Innenohr-gen Lieferung bei neugeborenen Mäusen. Wir zeigen, dass gen-Lieferung durch den hinteren Semicircular Kanal in der Lage, das gesamte Innenohr durchspülen. Die leicht anatomische Identifikation des hinteren Semicircular Kanals sowie minimale Manipulation des Schläfenbeins erforderlich, machen diesem chirurgischen Ansatz eine attraktive Option für Innenohr-gen Lieferung.
Einleitung
Innenohr Gentherapie ist ein sich rasant entwickelnden Gebiet der Untersuchung. Es wurde in verschiedenen Ausführungen der Tiere zu bekämpfen Ototoxizität, Lärm Trauma und erbliche Gehör Verlust1angewendet. Mehrere neuere Studien belegen funktionelle Erholung des Hörens und Gleichgewicht Funktionen mutierte Mäuse nach Innenohr Gen Therapie Lieferung2,3,4,5,6, 7. einer der wichtigsten Faktoren bei der Bestimmung der Erfolg des Innenohrs Gentherapie ist das chirurgische Vorgehen verwendet, um Zugriff auf das Innenohr. Im Idealfall das chirurgische Vorgehen wäre einfach durchzuführen, die anatomischen Landmarken wäre konsistent und leicht zu identifizieren, und die daraus resultierende Transduktion von gezielten Zelltypen wären hoch.
In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass bei viralen Gentherapie durch den hinteren Semicircular Kanal der Wirbler mutierte Maus (ein Modell der Hörverlust und vestibulären Dysfunktion) injiziert wurde, effizienten Transduktion von sensorischen Haarzellen in der vestibulären gesehen wurde auch Organe wie die Cochlea-5. Die hohe Effizienz der sensorischen Haarzellen Transduktion führte zu Verbesserung der auditorischen und vestibulären Funktionen in diesen mutierten Mäusen.
In diesem Artikel beschreiben wir ausführlich den hinteren Semicircular Canal Ansatz um die Neugeborenen Maus Innenohr gelangen.
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Protokoll
Alle tierische Verfahren stimmten die Animal Care und Use Committee am nationalen Institut auf Taubheit und anderen Kommunikationsstörungen (NIDCD ASP1378-15).
1. Verfahren einrichten und Vorbereitung
- Sterilisieren Sie alle Instrumente von Ethylenoxid in den Beginn des Experiments. Zwischen Tieren reinigen Sie mit Wulst Sterilisation Instrumente.
- Laden Sie die Projektmappe mit viralen Gentherapie in einer Mikropipette auf dem Mikro-Injektor. Die viralen Vektoren, die in dieser Studie verwendet wurde AAV2/8-whirlin (1 x 1013 Genom Kopien pro Milliliter, siehe die Tabelle der Materialien).
Hinweis: In der Regel ist 1,1 µL Gesamtvolumen in die Mikropipette geladen.
(2) Anästhesie
Hinweis: In dieser Studie verwendete Maus-Stamm ist der Wirbler Maus. Reinerbige Mutanten (WhrnWLAN/wi) und heterozygote Wurfgeschwistern (Whrn+ / wi) dienten.
- Legen Sie die Mutter in einem separaten Käfig (getrennt aus dem Wurf).
- Legen Sie die Heimat Käfig mit dem Wurf (P0 - P5 Welpen) auf einem umlaufenden Wärmekissen (Set bei 37,5 ° C) um die Mäuse warm zu halten.
- Schneiden Sie den Daumen Teil eines Latex-Handschuh, und entgegenbringen Sie einen Welpen.
- Platzieren Sie den Welpen in Latex-Handschuh Daumen in einen Eimer mit Eis für ~ 2 min.
- Platzieren Sie den narkotisierten Hund auf einem großen quadratischen kommerziellen Kunststoff Einfrieren-Pack mit einem 4 "x 4" Gaze zwischen den Welpen und das Pack Oberfläche.
- Einen schweren Latex-Handschuh mit crushed Ice füllen und den Eis-Handschuh rund um die Welpen zu platzieren.
- Überprüfen Sie, ob der Welpe ausreichend durch das völlige Fehlen von jeder Reaktion auf verschiedene Reize (einschließlich einer festen Fuß Klemme) betäubt ist. Lassen Sie den Welpen auf das Packeis für die Dauer der Operation (ca. 5-10 min).
Hinweis: Wir empfehlen die Welpen auf das Packeis für nicht mehr als 15 min während der Operation.
3. chirurgische Vorgehen (Abbildung 1)
- Reinigen Sie die Haut hinter dem Ohr mit einer Jod-wischen und ein Alkohol abwischen, sobald das Tier betäubt ist.
- Machen Sie einen postauricular Schnitt ~ 2 mm hinter dem Ohr mit Mikro-Schere, und teilen Sie den sternocleidomastoideus-Muskel mit Mikro-Schere.
- Nervus facialis und die Bulla zu identifizieren. Die Bulla ist knorpelig und semi-transparent in diesem Alter und es liegt medial Nervus facialis. Die stapedial Arterie durch die Bulla in diesem Alter sehen, die ein nützliches Wahrzeichen ist.
- Nervus facialis zu folgen, souverän und nach hinten, die hinteren Semicircular Kanal (PSCC) zu finden. Entfernen Sie die Muskelfasern und Weichgewebe über den hinteren Semicircular Kanal mit Mikro-Schere.
Hinweis: In diesem Alter ist die PSCC knorpelig. - Dringen Sie die PSCC mit einem Glas Mikropipette (~ 10 μm Durchmesser) auf der Mikro-Injektor.
- Injizieren Sie virale Gentherapie in das Innenohr.
Hinweis: In der Regel insgesamt 20 Injektionen von 49 nL der Gentherapie werden geliefert in den hinteren Semicircular Kanal über ~ 40 s (Gesamtvolumen ~ 1 µL). Die virale Titer verwendet wurde 1 x 10-13 -Genom-Kopien pro mL. - Schließen Sie der Hautschnitt mit einem 5: 0 Polyglactin Naht.
4. postoperative Pflege
- Ort der Welpe auf eine wärmende Unterlage, um eine normale Körpertemperatur während der Wiederherstellung aus der Narkose mit konstanter manuelle Stimulation/Rollen mit behandschuhten Fingern menschlichen wiederherzustellen.
- Sobald der Welpe wach ist, legen Sie sie zurück in seine Heimat Käfig.
- Streicheln Sie jeder Welpe mit einem Wattestäbchen, das die Heimat Käfig Einstreu ausgesetzt worden ist.
Hinweis: Der Zweck davon ist, haben die Mäuse riechen wie sie es vor der Operation, das erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Mutter ihr Wurf nach der Operation wieder zu akzeptieren. Wenn möglich, kann Urin von der Mutter gesammelt und rieb auf die Welpen mit einem Wattestäbchen, um die Wahrscheinlichkeit einer Ablehnung weiter zu verringern. - Nase, die Mutter um ihre8desensibilisieren Mineralöl zuweisen und Wiedereinführung der Muttergottes in den Käfig zu Hause.
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Ergebnisse
Injektion von AAV8 whirlin Gentherapie in Neugeborenen Wirbler Mäuse durch den hinteren Semicircular Kanal führte zu whirlin Ausdruck (grün) in utricular Haarzellen (Abbildung 2), mit der Infektion Gesamtwirkungsgrad von 53,1 % (SD 38,1, n = 28)5 . Haarzellen ausgestrahlt hatte Stereocilia (rot) im Vergleich zu Haarzellen von kontralateralen nicht injiziert Ohren länglich (5,35 ± 2.11 µm vs. 3,20 ± 0,34 µm bzw.)5
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Diskussion
Mehrere chirurgische Ansätze sind beschrieben worden, um Nager inneren Ohren zu gelangen. Cochleostomie und Rundfenster Ansätze werden am häufigsten verwendet Zugriff die Cochlea, während die hinteren Semicircular Canal und endolymphatic Sac Ansätze in der Regel die vestibulären Organe1Zugriff auf verwendet werden. In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass posterior Semicircular Canal, die hohe Effizienz der Haarzelle Transduktion in der vestibulären Organe und die Schnecke
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine entsprechenden Angaben zu machen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde mit Mitteln aus der NIDCD Abteilung der intramuralen Forschung /NIH (DC000082-02 bis W.W.C.) sowie DC000081, erweiterte Bildgebung Kern unterstützt. Wir sind dankbar für die NIDCD Tierhaus Mitarbeiter für die Pflege unserer Tiere.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Operationsmikroskop | Zeiss | OPMI Pico HNO-Mikroskop. Andere Präpariermikroskope würden auch funktionieren. | |
| Mikrorezepte | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 und #55 Dumont |
| Mikroschere | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 Mikroinjektor | World Precision Instruments | ||
| Heizkissen | Mastex | Modell 500/600 | |
| 5-0 Vicryl-Nähte | Ethicon | ||
| AAV8-Whirlin | Vector Biolabs | ||
| Glaspipette | Sutter Instruments | B100-75-10 | Borosilikatglas |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
