Eine neuronale Netzwerk-basierte Identifikation der entwicklungsgeschichtlich zuständigen oder inkompetent Maus ausgewachsene Eizellen

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die nicht-invasive Beurteilung der Eizelle Entwicklungskompetenz während ihre in Vitro Reifung von Germinal Vesicle zur Metaphase II Stufe durchgeführt. Diese Methode verbindet Zeitraffer Bildgebung mit Particle Image Velocimetry (PIV) und neuronale Netzwerkanalysen.

Abstract

Die Möglichkeit, entwicklungsgeschichtlich zuständigen vs. inkompetent Eizellen mit nicht-invasiven Verfahren, so verbessert das Gesamtergebnis der Schwangerschaft wählen würde Unfruchtbarkeit Kliniken profitieren. Wir vor kurzem entwickelt eine Klassifizierungsmethode basierend auf mikroskopische live Beobachtungen der Maus Eizellen während ihre in Vitro Reifung von Germinal Vesicle (GV) die Metaphase II Stufe, gefolgt von der Analyse der zytoplasmatischen Bewegungen in diesem Zeitraffer Zeitraum auftreten. Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle dieses Verfahrens. Eizellen sind von ausgewachsenen antrale Follikel isoliert und kultiviert für 15 h in einem Mikroskop für Zeitraffer-Analyse bei 37 ° C und 5 % CO₂ausgestattet. In 8 min Abständen fotografiert. Die Bilder werden analysiert, mit der Particle Image Velocimetry (PIV)-Methode, die für jede Eizelle, das Profil der zytoplasmatischen Bewegung Geschwindigkeiten (CMVs) während der gesamten Kultur vorkommende berechnet. Schließlich werden die CMVs jede einzelne Eizelle durch eine mathematische Klassifizierungs-Tool (Feed-Forward künstliche neuronale Netz, FANN) zugeführt, die Wahrscheinlichkeit, dass ein Gamete entwicklungsgeschichtlich zuständigen oder inkompetent mit einer Genauigkeit von 91,03 % prognostiziert. Dieses Protokoll für die Maus einrichten konnten jetzt auf Eizellen anderer Arten, einschließlich des Menschen getestet werden.

Introduction

Weiblicher Unfruchtbarkeit ist eine Pathologie, die sich eine steigende Zahl von Frauen auswirkt. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sind rund 20 % aller Paare unfruchtbar, mit einer 40 % aufgrund von Unfruchtbarkeit bei Frauen. Darüber hinaus ist ein Drittel der Frauen in der Krebs-Behandlungen (300.000/Jahr und 30.000/Jahr in den USA oder Italien, beziehungsweise) vorzeitige Ovarialinsuffizienz zu entwickeln.

Eine Strategie zur Unfruchtbarkeit bei Krebspatienten zu verhindern ist die Isolation und Kryokonservierung von Eibläschen vor der onkologischen Behandlung, gefolgt von in-vitro- Reifung (IVM) der GV Eizellen auf d....

Protocol

Alle Verfahren, bei denen Tiere stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung und ethischen Komitees an Universität von Pavia. Tiere wurden beibehalten, unter 22 ° C, 60 % Luftfeuchtigkeit und ein hell-dunkel-Zyklus von 12:12 Uhr.

1. Eierstock Isolation

1. Injizieren Sie intraperitoneal 2 vier bis elf Wochen alten CD1 weibliche Mäuse mit 10 U der Follikel-stimulierendes Hormon mit einer sterilen 1 mL Spritze mit Insulin.
2. Warten Sie 46-48 h.
3. Wiegen der Maus und mit einer intramuskulären Injektion von 50 mg/kg der Zoletil (Tiletamina und Zolazepan Cloridrate) zu betäuben. Einschläfern Sie durch zervikale Dis....

Results

Abbildung 2 zeigt eine repräsentative entwicklungsgeschichtlich kompetente und inkompetente Eizelle bzw. am Anfang (GV) und Ende (MII) das IVM-Verfahren. IVM ausgewachsene Maus Eizellen tritt während 15 h Kultur. Die Time-Lapse Beobachtung zeichnet den Verlauf der Meiose und erkennt meiotische Großveranstaltungen, darunter die GVBD und die Extrusion der erste Polkörper.

Die Analyse und den Vergleich.......

Discussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte, die eine kümmern sollte während der Durchführung dieses Protokolls Maus Eizellen sowie mit anderen Arten. Einmal aus den Follikeln isoliert, Eizellen übertragen werden sollte sofort in die Aufnahme sinkt, wie die Trennung von der Begleiter Cumulus löst Zellen Anfang des GV-MII Übergangs. Eine mögliche Änderung dieses Protokolls konnte die Zugabe von 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) M2 Medium für COCs Isolierung verwendet werden. IBMX verhindert die sofortige Auslösung des GV-MII Überga.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Folligon	Intervet	A201A02	Hormonbehandlung
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	Für die Färbung von Heterochromatin-Eizellen
Zellkultur Petrischale 35 mm x 10 mm	Corning	430165	Für die KOK-Isolierung
EmbryoMax M2 Medium (1X), Flüssig, mit Phenolrot	Merck-Millipore	MR-015-D	Für die KOK-Isolierung
MEM Alpha Medium (1X) + Glutamax	Sigma-Aldrich	M4526	Für die In-vitro-Reifung von Eizellen
Zellkultur Petrischale 35 mm Glasboden	WillCo	GWSt-3522	Für bildgebende Experimente
BioStation IM-LM	Nikon	MFA91001	Lebendzellen-Screening-System
Pasteurpipette	Delchimica Scientific Glassware	6709230	Für die Follikelmanipulation
Mineralöl	Sigma-Aldrich	M8410	Zur Verhinderung von Kontamination und Verdunstung von Medien
Penicillin / Streptomycin	Life Technologies	15070063	Zur Verhinderung von Medienkontamination
Fötales Rinderserum (FBS)	Sigma-Aldrich	ML16141079	Zum Schminken & Alpha; MEM-Medium
L-Glutamin	Life Technologies	25030	Für Make-up & Alpha; MEM-Medium
Taurin	Sigma-Aldrich	T0625	Zum Schminken & Alpha; MEM-Medium
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3310	Zum Schminken & Alpha; MEM-Medien
Natriumpyruvat	Sigma-Aldrich	P4562	Zum Konfektionieren Α MEM-Medien
Zoletil (Tiletamina und Zolazepan Cloridrat)	Virbac Srl	QN01AX9	Für die Anästhesie von Mäusen
Cell_PIV Sofware	Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK&	nbsp;                            -	-
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA	-	Für numerisches Rechnen mit mehreren Paradigmen