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Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

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DOI:

10.3791/56675

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17. November 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, James Madison University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Zelle-autonome Funktionen der Gene im Gehirn können durch Induktion Verlust studiert werden oder der Funktion in geringer Dichte Bevölkerungen der Zellen gewinnen. Hier beschreiben wir in Utero Elektroporation Cre-Rekombinase in spärlichen Bevölkerung kortikale Neuronen mit Floxed Genen zu entwickeln, Verlust der Funktion in Vivozu liefern.

Zusammenfassung

Zelle-autonome neuronale Funktionen der Gene können aufgedeckt werden, indem Sie verursachen Verlust oder Gewinn der Funktion eines Gens in einer kleinen und spärlich Population von Neuronen. Dazu muss erzeugen ein Mosaik in die Neuronen mit Verlust oder Gewinn der Funktion eines Gens von genetisch unbeirrt Gewebe umgeben sind. Hier verbinden wir das Cre-Lox-Rekombinationssystem mit in Utero Elektroporation um Mosaik Hirngewebe zu generieren, die verwendet werden, um die Zelle-autonome Funktion von Genen in Neuronen zu untersuchen. DNA-Konstrukte (erhältlich über Repositories), Codierung für eine fluoreszierende Label und Cre-Rekombinase werden in kortikalen Neuronen mit Genen flankiert mit LoxP-Sites in den Gehirnen von Mäuseembryonen in Utero mit Entwicklung eingebracht Elektroporation. Darüber hinaus beschreiben wir verschiedene Anpassungen, die in Utero Elektroporation-Methode, die Überlebensfähigkeit und Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Diese Methode erfordert auch einen Titer für Cre-vermittelten Rekombination in einer spärlich oder Dichte Bevölkerung der Neuronen. Histologische Präparate von beschrifteten Hirngewebe nicht erforderlich (aber kann angepasst werden) Immunohistochemistry. Die Konstrukte verwendet garantieren, dass das Eindringmittel Neuronen tragen das Gen für Cre-Rekombinase beschriftet. Histologische Präparate können morphologische Analyse von Neuronen durch konfokale Bildgebung der dendritischen und axonalen Lauben und dendritischen Dornen. Weil Verlust oder Gewinn der Funktion im spärlich Mosaik Gewebe erreicht wird, erlaubt diese Methode das Studium der Zelle-autonome Notwendigkeit und Angemessenheit der Gen-Produkte in Vivo.

Einleitung

Generierung von einem genetischen Mosaik ist ein klassischen experimentellen Paradigma zum Verständnis der Funktion eines Gens von Interesse. Um festzustellen, ob ein Gen für eine zelluläre Phänotyp notwendig ist, ist der einfachste Ansatz einen Verlust der Funktion des Gens in den Organismus (z.B. Ko) verursacht. Um festzustellen, ob ein Gen gezielt in einem bestimmten Zelltyp benötigt wird, ist jedoch nicht KO des Gens in den Organismus ein gültiger Ansatz. Stattdessen eine Methode ist erforderlich, dadurch wird den Verlust der Funktion eines Gens in einer bestimmten Zelle während von Wildtyp (d. h. genetisch unbeirrt) Gewebe umgeben ist – in anderen Worten, Mosaik Gewebe zu schaffen. Wenn die mutierte Zelle einen mutierten Phänotyp zeigt, aber umgebenden Wildtyp-Zellen nicht, der Genfunktionen Zelle-autonom. Analyse der Mosaik-Gewebe, in dem Wildtyp Gewebe, mutierte Zellen umgeben sind eignet sich für das Verständnis der Zelle-autonome Funktionen der Gene, vor allem im Gehirn, wo Neuronen und Glia eine große Verbundnetz des Gewebes bilden.

Verschiedene Formen von Mosaik Hirngewebe lieferten leistungsstarke Modelle um Zelle-autonome Funktionen der Gene zu untersuchen. Studien konzentrierten sich auf neuronale Transplantation1weiblichen X-chromosomal Mosaikbildung2,3,4, und endogenen somatische Mosaikbildung5,6 haben ihre Schlußfolgerungen basierend auf Mosaik Hirngewebe. Bedingte Löschung eines Gens durch die Cre Lox Rekombinationssystem ist eine Methode, die die große Verfügbarkeit der transgene Mauslinien nutzt. Bei dieser Methode werden zwei LoxP-Standorten eingeführt, auf beiden Seiten einer erforderlichen Sequenz eines Gens (z. B. ein Exon), flankiert von LoxP-Websites, die beide in die gleiche Richtung ("Floxed") stehen lassen. Cre-Rekombinase beschneidet die Reihenfolge zwischen den LoxP-Websites-7. CRE-vermittelten Rekombination kann durch Kreuzung Floxed Mäuse mit einer anderen Mauslinie mit dem Ausdruck Cre-Rekombinase zusammen mit einem fluoreszierenden Marker in einer Teilmenge von Zellen ("Cre-Reporter-Linie") erreicht werden. Dies wurde in einer Vielzahl von Möglichkeiten, um die Funktionen eines Gens in Teilmengen von Zellen, wie z. B. exzitatorischen Neuronen oder Astrozyten8aufzudecken nachgewiesen. CRE-Reporter Linien CreERT2 Cre-vermittelten Rekombination sein Medikament-induzierbaren (Single Neuron Etikettierung mit induzierbaren Cre-vermittelten Ko oder glatt) ermöglichen ausdrücken können9. In eine andere Strategie als Mosaik-Analyse mit doppelter Marker (MADM)10,11ermöglicht Cre-vermittelten interchromosomal Rekombination eine homozygote Mutante neben heterozygot Gewebe geschaffen werden. In diesen Ansätzen muss eine neue Linie von Mäusen produziert werden jedes Mal für jeden Kandidaten-gen oder zellulären Subtyp, der überprüft wird. Alternativ kann Cre-Rekombinase postnatal durch Iontophorese12 oder durch virale Vektoren (z.B. Adeno-assoziierten Viren13 oder Lentiviren14 mit zellulären Subtyp-spezifische eingeführt werden Promotoren). Diese Strategie schafft starke und postnatale beschriften. Zu dünn und pränatal zerebrale kortikale Neuronen entwickeln, ist eine ideale Strategie in Utero Elektroporation Cre-Rekombinase mit einem fluoreszierenden Marker.

Neben der Kombination von Cre Lox Rekombination durch in Utero Elektroporation produzieren Mosaik Gewebe in Vivo, mehrere Anpassungen stellen wir Verfahren aus anderen veröffentlichten Protokolle15,16, 17,18,19,20,21. Wir geben Informationen zum Erfolg in der Zucht timed-trächtige Weibchen zu verbessern. Auch beschreiben wir unsere zwei Strategien einzuführen, spärlich und hellen Kennzeichnung von Neuronen im kortikalen Gewebe: eine Strategie ist, die Ebenen von einem einzigen Konstrukt Codierung für Cre-Rekombinase und einem fluoreszierenden Marker22titrieren. Eine weitere Strategie ist das "Supernova"-System, speziell mit diesen Parametern im Geist23,24verwenden. Darüber hinaus bieten wir Verbesserungen auf die Herstellung von konsistenten Mikroinjektion Pipetten und Vereinfachungen, die in Utero Elektroporation Chirurgie. Zu guter Letzt erläutern wir wichtige Schritte in einem vereinfachten histologischen Präparat, das die Analyse von dendritischen Dornen und dendritischen und axonalen Dorne, ohne weitere Färbung oder Immunohistochemistry ermöglicht.

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Protokoll

Hier beschriebene Methoden von Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) von James Madison University genehmigt worden und sind in Übereinstimmung und die Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Richtlinien.

(1) Maus-Setup

  1. Ein junges Haus (> P60) männliche und weibliche homozygot Floxed Maus zusammen, um einen Züchter paar25einzurichten.
    Hinweis: Eine gute Negativkontrolle ist ein paar zusätzliche Züchter von Wildtyp-Mäusen, eingerichtet in denen Cre Rekombinase Ausdruck nicht dazu ein Mosaik-26 führen wird.
  2. Das Weibchen gebären und erhöhen ihren ersten Wurf mit dem Mann zu ermöglichen. Halten Sie das Männchen zusammen mit das Weibchen zu dem Wurf überleben zu erhöhen. Nach dem Absetzen des Wurfes, z.B. bei postnatalen Tag (P) 21, trennen Sie die weiblichen und männlichen.
  3. Murine Zucht
    1. Richten Sie eine zeitgesteuerte Paarung zwischen den weiblichen und männlichen25. Verwenden Sie visuelle Hinweise bestimmen die Brunst-Zyklus der weiblichen27sowie für vaginalen Stecker am Morgen nach der Paarung25.
    2. Wenn ein Stecker befindet, trennen, und das Weibchen wiegen. Die Anzahl der Tag als embryonale Tag (E) 0,5.
    3. Fahren Sie fort, wiegen das Weibchen alle 3-5 Tage, um festzustellen, ob sie schwanger ist. Trächtige Weibchen haben eine 10-20 % ige Erhöhung des Körpergewichts 7-10 Tage nach der Empfängnis (E0).
      Hinweis: Dieser Schritt bestätigt Schwangerschaft früher und zuverlässiger als Sichtprüfung25.
    4. Wenn die Frau nicht schwanger ist, wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.3.
  4. Sobald die Schwangerschaft bestätigt ist, wählen Sie das Datum von der Elektroporation in Utero . Auf Layer II/III kortikalen pyramidale neuronalen Vorläuferzellen, führen Sie Elektroporation an E15.5.

(2) DNA-Aufbau

  1. Wählen Sie eine einzelne DNA zu konstruieren, dass Codes für Cre-Rekombinase sowie einen fluoreszierenden Marker, wie grün fluoreszierendes Protein (GFP)28,29. Alternativ verwenden Sie die "Supernova"-System, ausführlich in früheren Publikationen23,24. Sehen Sie Liste der Materialien zum Beispiel konstruiert.
  2. Die DNA-Construct(s) aus Schritt 2.1 in E. Coli mit mikrobiologischen Standardtechniken30zu verstärken.
  3. Reinigen Sie die DNA-Konstrukt mit einem Endotoxin-freie Plasmid-Reinigung-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Eluieren Sie Konstrukt mit Endotoxin-freies Wasser.
    Hinweis: Auswahl eine Endotoxin-freie Reinigung-Kit über ein standard-Reinigung-Kit ist entscheidend.
  4. Das Eluat DNA, 1-3 mg/mL je nach gewünschten Kennzeichnung Dichte26zu konzentrieren.
    Hinweis: Ein Titer muss immer eingerichtet werden, bei der Arbeit mit einer neuen DNA-Konstrukt, angesichts der Tatsache, dass sie unterschiedliche Längen und Promotoren. Betrachten Sie injizieren ein Konstrukt an mehreren verschiedenen Konzentrationen und/oder Mengen Ausdruck zu beurteilen. Z. B. Injektion von 1 µL oder 1,5 µL von 2,0 mg/mL GFP. CRE ist in der Lage, spärlich (1 µL) oder dichten (1,5 µL) verursachen Kennzeichnung von Schicht II/III visuellen kortikalen pyramidale Neuronen26.
  5. Hinzufügen von 0,4 % Trypan blau in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 H2O, angepasst auf pH 7.4 mit HCl) 01:10, die konzentrierte DNA-Lösung.
  6. 10 X PBS 01:10 die konzentrierte DNA-Projektmappe hinzufügen.
  7. Lagern Sie die konzentrierte DNA-Lösung bei 4 ° c Die Lösung kann auf unbestimmte Zeit aufbewahrt werden.

3. Pipette Set-up

  1. Mit ein Glas Kapillare Abzieher, ziehen Sie eine Pipette mit einem sehr langen (10-15 mm) Kegel und sehr feine Spitze, typisch für Pipetten für embryonale Stammzellen Injektion oder Kerntransfer31.
    Hinweis: Um Ablagerungen verhindern Kontamination der Pipetten, sollten sie innerhalb von 2 Tagen nach der Operation erfolgen.
    1. Kalibrieren Sie den Glas-Kapillare-Abzieher durch eine Rampe Test, nach den Anweisungen des Herstellers. Nutzung der daraus resultierende Heizwert ein ziehen zu programmieren-Protokoll mit den folgenden Parametern: Wärme = (Rampe Testwert + 15), ziehen = 30, Vel = 120, Zeit = 100, Druck = 200. Legen Sie die Glas-Kapillare, am Puller an Klemmen befestigen und das programmierte ziehende Protokoll, Erstellung einer Verjüngung auf der Glas-Kapillare zu aktivieren.
    2. Sicherzustellen, dass die Kegel zwischen beträgt 10-15 mm mit einem zusammengesetzten Lichtmikroskop (z.B. 10 X Objektiv)31.
  2. Zurück zu brechen die Pipette, um eine grobe Kanten Tipp auf 20-25 µm Durchmesser zu bilden.
    1. Zentrieren Sie eine einlagige Aufgabe wischen (siehe Materialliste) über ein 50 mL Becherglas "und" Dehnen wischen Sie mit einer Hand straff. Festhalten Sie mit der anderen Hand und eine Pipette (Kegel Seite nach unten) senkrecht und vollständig durch das Zentrum der Tücher, verursacht einen klaren Bruch in der Kegel31.
      Hinweis: Drücken die Pipette voll und ganz durch das wischen wird ein 20-25 µm Durchmesser Spitze etwa 70 % der Zeit produzieren.
    2. Bestätigen Sie unter einem zusammengesetzten Lichtmikroskop (z. B. 20 X Objektiv).
      Achtung: Verwenden Sie Augenschutz beim Einschlagen der Scheibe.
  3. Kalibrieren einer Pipette durch Absaugnadeln 1 µL 0,4 % Trypan blau mit 1 X PBS-Puffer in einem teilweise gefüllten Piptte, dann dem Studium der Pipette mit 1 µL Markierungen basierend auf der Höhe von 1 µL in der Pipette, mit einer feinen Spitze alkoholbeständigen Marker. Verwenden Sie die kalibrierte Pipette die andere Pipetten vor dem Wegwerfen zu absolvieren. Halten Sie Pipetten in einer Pipette Halterung frei von Staub und andere Partikel.

4. in Utero Elektroporation

  1. Graefe Pinzette, Iris-Schere Hartman Moskito-Zange, Vlies Gaze Schwämme, Ring-bestückte Zange und Petrischalen auf einem Edelstahl-Tablett legen und mit Alufolie umwickeln. Fach und 1 L 0,9 % Kochsalzlösung (0,9 % wt/Vol NaCl in Wasser) im Autoklaven zu platzieren. Autoklaven bei 121 ° C und 3,5 kPa für 40 min. vom Autoklaven und legen Sie in eine desinfizierte OP-Bereich.
    Hinweis: Es ist entscheidend für die sterile Bedingungen während der Operation zu erhalten.
  2. Wärmen Sie die autoklaviert Kochsalzlösung 1 L-Flasche in einem kleinen Wasserbad bis 38 ° C mindestens 2 h vor der Operation.
  3. Die Pinzette-Typ-Elektroden und Fußpedal zum Generator zu verbinden (siehe Materialliste). Nach den Anweisungen des Herstellers, den Generator zu fünf 50 ms Pulse von 50 V (mit einem 950 ms Intervall) Wann liefern festgelegt durch das Fußpedal ausgelöst. Desinfizieren Sie die Pinzette-Typ-Elektroden und setzen auf die desinfizierte OP-Bereich.
  4. Machen Sie eine Narkose Nase Kegel als zuvor veröffentlichten32, aber verwenden Sie am Ende eines Nitril oder Latex-Handschuh Finger, um eine Membran zu bilden, die sicher über die Bugnase Öffnung passt. Schneiden Sie ein Loch im Zwerchfell groß genug, um über die Maus Schnauze passen.
  5. Betäuben Sie tief schwangere Mäusen in E15.5 in einer Induktion Kammer gefüllt mit Isofluran (2-4 %) in reinem Sauerstoff bei 1 L/min fließt. Nach ~ 1 min, testen den aufrichtenden Reflex (vorsichtig kippen die Induktion Kammer und sicherzustellen, dass die Maus sich nicht richtig). Wiegen Sie Maus, um später während der Operation verabreicht Analgesie Dosierungen zu bestimmen.
  6. Übertragen Sie die Maus auf den OP-Bereich und verwalten Sie inhalativen Isofluran (1-2 %) in reinem Sauerstoff fließt bei 1 L/min durch ein Prüfkopf, Maus in chirurgischen Flugzeug zu halten. Pinzette verwenden, um das Pedal Reflex testen (drücken Sie sanft die Pfote und sicherzustellen, dass die Maus keinen Reflex zurückkehrt), Anesthetization zu überprüfen. Atemfrequenz und Mühe, auf der Suche nach Tiefe, regelmäßige Atmung zu überwachen (~ 70-100 Atemzüge/min), und die Schleimhäute in der Farbe rosa und feucht sind.
  7. Wenden Sie genügend tierärztliche Augenheilkunde Salbe über den Augen, sie ganz zum Schutz vor Austrocknen während des Verfahrens zu decken.
  8. Flex Metall-Aktivator-Scheibe aus einem versiegelten Beutel gefüllt mit übersättigt Salzlösung (siehe Materialliste), Aktivierung einer exothermen Kristallisation des Salzes. Legen Sie 2 einlagige Aufgabe Tücher auf den Beutel zu, und platzieren Sie den Mauszeiger auf den Beutel, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
  9. Massieren Sie Enthaarungscreme auf den Bauchbereich mit Wattestäbchen zu, bis Bauch-Fell (ca. 20-40 s) löst, dann wischen Sie Bauch-Fell. Jede verbleibende Rückstände und Enthaarungsmittel Creme mit 70 % Ethanol und Baumwolle Tupfer reinigen Sie vorsichtig. Positionieren Sie ein gefenstert steriles OP-Tuch über den Bauchbereich.
  10. Aseptischen Technik, ziehen Sie die Haut und vom Bauch mit Graefe Pinzette und machen Sie einen ~ 2 cm ventralen Mittellinie Schnitt auf der Haut mit Iris-Schere, um sicherzustellen, dass die darunter liegenden Muskeln nicht geschnitten wird.
    Hinweis: Eine akzeptable Alternative zu machen einen Schnitt mit Graefe Pinzette und Iris-Schere ist mit einem Skalpell wie zuvor17veröffentlicht.
  11. Finden Sie die Linea Alba, die Mittellinie des Rectus Abdominis zu visualisieren. Muskel und vom Bauch mit Graefe Pinzette ziehen, und ein weiteres ~ 2 cm Mittellinie Schnitt es mit Iris-Schere, Freilegung der Bauchhöhle (die Gebärmutter ist lichtdurchlässig und Embryonen werden unter sichtbar). Sicherstellen Sie, dass die zugrunde liegende Gebärmutter und Darm Gewebe nicht geschnitten wird. Machen Sie der Einschnitt nur groß genug (in der Regel ~ 2 cm), herausziehen und setzen die Gebärmutter bequem.
    Hinweis: Eine akzeptable Alternative zu machen einen Schnitt mit Graefe Pinzette und Iris-Schere ist mit einem Skalpell wie zuvor17veröffentlicht.
  12. Mit einer sterilen 10 µL Mikropipette Spitze, Carprofen (aufgelöst in steriler 0,9 % Kochsalzlösung) bei 4 mg/kg in die Bauchhöhle für Analgesie zu verzichten.
  13. Klemmen Sie ein Hartman Moskito Zange am linken Rand der Rectus Abdominis Einschnitt. Rest der Zange auf umgestürzten Petrischale auf der linken Seite des Schnittes, die linke Seite des Schnittes offen zu halten. Klemmen Sie ein weiteres Hartman Moskito Zange am rechten Rand des Rectus Abdominis Schnittes und ruhen Sie die Zange auf einem umgestürzten Petrischale auf der rechten Seite des Schnittes, der rechten Seite des Schnittes offen zu halten. Positionieren Sie Gaze Schwamm, um den Bereich des Schnittes.
  14. Mit Ring Pinzette (ohne eine angeschlossene Grenze Schraube), ziehen Sie in der Gebärmutter zwischen zwei benachbarten Embryonen ohne Quetschungen oder jedem möglichem Gewebe zu verletzen. Beginnen Sie alle Embryonen durch die Inzision, legte sie auf die Gaze Schwamm herausziehen. Wenn die letzte Embryonen aus der Bauchhöhle herausziehen, darauf achten Sie, nicht auf die Eierstöcke oder Muttermund zu ziehen. Sobald ausgesetzt, ist es wichtig, die Gebärmutter mit warmen Kochsalzlösung feucht zu halten. Die Gebärmutter enthält in der Regel zwischen 5 und 8 Embryonen.
    Hinweis: Es ist möglich die saline17Penicillin und Streptomycin hinzu.
  15. Schließen Sie eine kalibrierte Pipette an der Absauganlage Strahler (siehe Materialliste), und Spritzen genau 1 µL DNA-Lösung in Schritt 2 durch die Gebärmutterwand in einer seitlichen Ventrikel jedes Embryos vorbereitet. Lateralen Ventrikel erscheinen als zwei Flecken auf der dorsalen Telencephalon des Embryos (Patches sind dunkler als die umliegenden Gewebe des Telencephalon). Verwenden Sie zwischen Daumen und Zeigefinger während der Mikroinjektion und Elektroporation um zu manipulieren, die Embryonen, enthüllt die lateralen Ventrikel und ermöglicht die Embryonen während der Injektion sanft gegen die Gebärmutterwand gedrückt werden. Bestätigen Sie erfolgreiche Injektion durch die Beobachtung Trypan blau füllen den seitlichen Ventrikel.
  16. Platzieren die Kathode Pinzette-Art Elektroden (siehe Materialliste) auf die Gebärmutter direkt über den medialen und kaudalen Kortex auf den visuellen Cortex (alternative Bereiche des Gehirns gezielt verschiedene Elektroden Platzierung benötigen)16, 26. Ort der Anode auf die Gebärmutter, nur minderwertig und anterior der Embryo Kopf.
  17. Bestätigen Sie, dass die Anode und Kathode die Gebärmutter umgibt den Embryo bei den entsprechenden Stellen berühren. Lösen Sie mit einem Fußpedal aus, die Lieferung von fünf 50 ms Impulsen von 50 V (mit einem 950 ms Intervall) zwischen den Elektroden.
    Hinweis: Die injizierten, negativ geladene DNA bewegt sich in Richtung der Kathode und werden in ventrikuläre Zone Zellen am nächsten an der Kathode einfließen.
  18. Zurückgeben der Gebärmutter zur Bauchhöhle in der gleichen Ausrichtung wurde festgestellt. Verwenden Sie Kochsalzlösung, um die Gebärmutter zu schmieren, während es manuell und äußerst schonend Führung kümmert sich nicht um Embryonen aus ihrer Position in der Gebärmutter zu verdrängen.
  19. Schließen Sie die Bauchmuskeln mit resorbierbaren Fäden (siehe Materialliste) verwenden eine einfache unterbrochene Masche, die Enden mit einem Chirurgen der Knoten binden. Tun nicht Clip aus, den die Enden zu nahe an den Knoten oder Knoten werden gelöst.
    Hinweis: Es ist wichtig, Naht die Bauchmuskeln geschlossen, so dass die Ränder der Wunde vollständig geschlossen sind, aber ohne blanchieren des Muskels. Knoten sollten dicht sein, damit diese gelöst werden können.
  20. Schließen Sie die Hautschicht mit resorbierbaren Fäden (einfache unterbrochenen Stich, Chirurg der Knoten, wie in Schritt 4.19). Wenden Sie eine kleine Menge des Klebers Gewebe um die Wunde zu verschließen. Gewebe-Kleber auf den Knoten zu lösen. Mithilfe einer Mikropipette entfernen keine Gewebe Kleber rund um die Wunde, die durch die Mikropipette abgesaugt werden kann.
  21. Geringere Isofluran auf 0,5-1,5 %. Sobald Gewebe Klebstoff ist trocknen (Test durch berühren Handschuh Kleber), entfernen von Isofluran und weibliche allein in einem warmen Käfig zu erholen. Verwalten von Buprenorphin intraperitoneal bei 0,03 mg/kg eine 1 mL Spritze mit einer 26G, ½" Nadel.
  22. Weiterhin die Maus zu verfolgen, bis die Maus vollständig erholt ist und Verhalten normalerweise (z.B. Pflege, Käfig zu erkunden, Essen oder trinken). Nach der Wiederherstellung setzen Sie wieder in Käfig mit männlich weiblich.
    Hinweis: Wenn alle Schritte befolgt werden, die Maus wird in der Regel wieder Bewusstsein innerhalb von 2 min und sofort bewegen über den Käfig, keine Anzeichen von Unbehagen.
  23. Wenn die Maus Anzeichen von Beschwerden (z.B. gebeugt Haltung, Porphyrin Sekrete)33 zeigt, verwalten Sie Carprofen bei 0,1 mg/mL in der Wasserversorgung. Wenn mehrere Anzeichen von Unbehagen vorhanden sind, oder wenn Beschwerden weiterhin für mehr als 4 h trotz Carprofen Verwaltung, sofort einschläfern der Maus durch die Verabreichung einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (240 mg/kg) - Xylazin (48 mg/kg)- Acepromazine (1,85 mg/kg)-Cocktail mit einer 1 mL Spritze mit einer 26 G, ½" Nadel, und mit einer genehmigten sekundären Form von Euthanasie33folgen.
  24. Um das Überleben der elektroporiert Embryonen nach der Geburt zu erhöhen, halten Sie den Käfig in einem ruhigen Raum, frei von Geräuschen und Vibrationen halten. Bereichern Sie die Umgebung mit Kunststoff-Iglus, Verschachtelung Materialien und Nahrungsergänzungsmittel wie Sonnenblumenkerne (siehe Materialliste). Nicht bewegen Sie oder stören Sie den Käfig, besonders während der ersten 3 Tage nach der Entbindung.

(5) histologische Vorbereitung für Fluoreszenz-Mikroskopie

Hinweis: Diese Histologie-Protokoll ist für die Zubereitung von Gewebe von Tieren, die älter als postnatale Tag (P) 13, die elektroporiert in Uterowurden optimiert. Um Gewebe aus jüngeren postnatale Tiere (P0-P13) vorzubereiten, empfiehlt es sich, alle Schritte (einschließlich Transcardial Perfusion), obwohl das Gehirn in Agar vor der Vorbereitung Abschnitte (Schritt 5.9) eingebettet werden sollte. Gewebe kann sogar bereit aus Embryonen innerhalb von 1-2 Tagen nach Electroporation Methoden zuvor beschriebenen18,20.

  1. Bereiten Sie Paraformaldehyd (PFA) Lösung.
    Hinweis: Es ist zwingend notwendig, um frische PFA innerhalb eines Tages nach dem Experiment vorbereiten.
    Achtung: Paraformaldehyd ist giftig und sollte in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden.
    1. Zu 50 mL 4 % PFA, 40 mL Wasser bis 60 ° C. 2 g PFA unter ständigem Rühren mit einem Glasstab Stab- oder Rühren zugeben. Fügen Sie 10 µL 10 M NaOH alle 2 min bis PFA auflöst.
    2. 5 mL 10 X PBS und Lösung zu einem Endvolumen von 50 mL mit Wasser.
    3. Passen Sie nach 50 mL Lösung bringen pH-Wert 7,4 nach Bedarf an, mit 10 M HCl. zulassen Lösung zur Kühlung und Lagerung bei 4 ° C.
  2. Einschläfern Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (240 mg/kg) - Xylazin (48 mg/kg) - Acepromazine (1,85 mg/kg) cocktail Nadel eine 1 mL Spritze mit einer 26G, ½". Transcardially perfundieren 10 oder 20 mL eiskaltes 1 X PBS, gefolgt von 25 oder 40 mL frisch zubereitet, eiskalt 4 % PFA17. Verwenden Sie niedrigere Absatzmengen für junge postnatale (P0-P13) Mäuse und höhere Absatzmengen bei älteren Mäusen (P14 und höher).
  3. Unmittelbar nach Perfusion Enthaupte Maus Kadaver zwischen Hinterhauptsbein und C1 Wirbel mit großen Scheren und abziehen und entsorgen Sie die meisten der Schädel mit Iris-Schere umgebenden Haut, Haut besonders umliegenden Frontal und Parietal occipital Knochen. Schädel und Gehirn intakt zu halten.
  4. Legen Sie den Schädel und das Gehirn in 10 mL 4 % PFA in einem 50 mL konische Röhrchen für 24 Stunden bei 4 ° C, Post-Gewebe zu beheben. Fügen Sie dann 30 mL 1 X PBS, konische Rohr, verdünnen Sie die Lösung auf 1 % PFA zur Lagerung bei 4 ° C.
    Hinweis: Verwenden Sie eine separate konischem Rohr für jeden Schädel und Gehirn Post-behoben werden. Inkubieren Sie das Gehirn nicht in 1 % PFA für länger als 2 Wochen oder Fluoreszenz zu verblassen beginnt.
  5. Ort des Gehirns und des Schädels auf einer ebenen Fläche mit einlagige Aufgabe Tücher angefeuchtet mit 1 X PBS. Verwenden der Pinzette (siehe Materialliste), restliche Haut oder Membran umgibt den Schädel zu entfernen.
  6. Mit einer Pinzette, entfernen Sie zunächst das Hinterhauptsbein, dann entfernen Sie vorsichtig das Scheitelbein, verschieben die Pinzette heraus und Weg von der Oberfläche des Gehirns. Entfernen Sie vorsichtig alle Hirnhaut um Schäden an der Rinde zu vermeiden.
  7. Keil von der Rückseite der Pinzette unter das Gehirn entlang der Schädel alle Hirnnerven zu durchtrennen, und das Gehirn zu entfernen.
  8. Für junge postnatale (P0-P13) Gehirn
    1. Machen Sie 25 mL 4 % Agar durch Erhitzen 25 mL 1 X PBS bis 80 ° C. Umrühren und 1 g Agar mit einem Glasstab Stab- oder Rühren auflösen).
    2. Coole Lösung auf 35 ° C, während Sie weiterhin rühren. Gehirn in einem kleinen Behälter (z. B. die Kappe einer 50 mL konische Röhre), und mit Agar Lösung übergießen Gehirn. Lassen Sie Agar aushärten.
  9. Machen Sie einen koronalen Schnitt manuell mit einer Rasierklinge Single-Rand durch das Gehirn, rostral, Bregma ca. 0,5 mm. Machen Sie eine weitere koronalen Schnitt durch das Gehirn ca. 0,5 mm kaudalen zum visuellen Kortex. Stellen Sie einen Pool von Cyanacrylat-Klebstoff mit den gleichen Durchmesser wie die rostral Ende des Gehirns auf die Mitte von der vibrierenden Mikrotom Objektplatte. Legen Sie die rostral Ende des Gehirns auf den Pool von Leim, um sicherzustellen, dass die gesamte rostral Fläche des Gewebes an der Objektplatte mit Leim gebunden ist.
  10. Pufferwanne auf vibrierenden Mikrotom befestigen und sichern mit eingebauten Klemmhebel. Messerhalter Messer stecken und Messerhalter auf vibrierenden Mikrotom mit integrierter Spannschraube montieren. Objektplatte mit Kopf aufs Pufferwanne mit eingebauter Spannvorrichtung zu sichern. 5.33 (53,3 Hz) Geschwindigkeitseinstellung, 5.70 (= 0.285 mm/s) und Frequenzeinstellung gesetzt.
  11. Füllen Sie die Kammer über dem Niveau des Gehirns mit 1 X PBS und senken Sie das Sägeblatt in der PBS. Beginnen Sie, die 100 µm koronalen Abschnitte durch das Gewebe.
  12. Wenn auch ohne Weiterverarbeitung, z. B. 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) nukleare Färbung oder Immunohistochemistry.
    1. Verwenden Sie einen feinen Spitzen Pinsel Abschnitte direkt von vibrierenden Mikrotom auf einen Objektträger, 4-6 Teile auf jeder Folie passend zu übertragen.
    2. In den Abschnitten durch Feuchtigkeitstransport Weg Lösung mit einem feinen Spitzen Pinsel trocknen, so dass die Gehirnscheiben nicht mehr auf den Folien driften zu ermöglichen.
    3. Legen Sie dann einen Tropfen Eindeckmedium (siehe Materialliste) auf die einzelnen Abschnitte auf der Folie.
    4. Sanft legen Sie ein 24 x 50 mm-Deckglas darauf, sicherzustellen, dass (1) keine Luftblasen Form auf den Abschnitten (2) die Abschnitte nicht bewegen, und (3) die Eindeckmedium deckt den Bereich zwischen der Folie und dem Deckglas. Lassen Sie Eindeckmedium mindestens 24-48 Stunden aushärten.
  13. Kerne mit DAPI für histologische Untersuchung der kortikalen Schichten Fleck
    1. Verwenden Sie einen feinen Spitzen Pinsel übertragen jeden Abschnitt in eine Lösung mit 10 µg/mL DAPI (siehe Materialliste) mit 1 X PBS-Puffer von Stammlösung (20 mg/mL DAPI im Wasser) verdünnt.
    2. DAPI-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie, dann verwenden Sie einen feinen Spitzen Pinsel Abschnitt von DAPI-Lösung 1 X PBS übertragen und mit 1 X PBS-Puffer für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie Abschnitt zwei weitere Male auf frische 1 X PBS für 5 min. Dann, mit einem feinen Spitzen Pinsel, Transfer Abschnitt auf einen Objektträger folgen Schritte 5.11.2-5.11.4, und fahren Sie mit Schritt 5.13.
  14. Erhitzen Sie eine Glas-Petrischale mit Valap (gleiche Teile Vaseline, Lanolin und Paraffin) auf einer heißen Platte bei schwacher Hitze bis Sie vollständig geschmolzen. Dichtung ausgesetzt Kanten der Folien durch Bürsten auf geschmolzenen Valap.
  15. Um Fluoreszenz im Gewebe zu überprüfen, verwenden Sie ein Lichtmikroskop oder confocal Mikroskop (siehe Materialliste) und einen Filter setzen, ausreichend für die Anzeige der Fluorophor (z. B. DAPI: Erregung 325-375 nm, Emission 435 485 nm; GFP: Erregung 450-490 nm, Emission 500-550 nm)17. Konfokale Aufnahmen mit Low - (4 X, numerische Apertur NA = 0,20), Medium-(20 X, NA = 0,75), und High-Power (60 X, NA = 1.40) Ziele.

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Ergebnisse

Die einzelnen Konstrukt GFP. CRE (siehe Materialliste) war elektroporiert bei E15.5 und visualisiert auf P14. Abhängig von der Konzentration des Konstrukts und das Volumen der Injektion erhalten Sie ein spärliches oder dichtes Ergebnis22,26. Beispiel: Injektion von 1 µL von 2 mg/mL GFP. CRE-Ergebnisse in eine spärliche Verteilung der markierten Zellen, von die einige helle (Abbildung 1A) und lokalisie...

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Diskussion

Hier stellen wir die Kombination von in Utero Elektroporation mit Cre-Rekombinase bei Floxed Mäusen, Mosaik Hirngewebe zu generieren. Ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass eine neue Mauslinie muss nicht jedes Mal generiert werden ein verschiedenen zellulärer Subtyp wird ins Visier genommen werden: in Utero Elektroporation kann verwendet werden, um exzitatorischen Neuronen, hemmende Neuronen oder Gliazellen je nach Ziel und Lage der Elektroporation15,1...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Danksagungen

Die Autoren danken die großzügige Unterstützung der James Madison University Department of Biology und James Madison Universität Licht Mikroskopie und Imaging Facility. Dr. Mark L. Gabriele für hilfreiche Ratschläge zur Vorbereitung junger postnatale Gewebe, und DRS. Justin W. Brown und Corey L. Cleland für großzügige Koordinierung der chirurgischen Materialien und Raum. Diese Forschung wurde teilweise durch ein Collaborative Research Grant durch 4-VA, eine partnerschaftliche Zusammenarbeit zur Förderung der Commonwealth von Virginia (etfolgreich) und durch eine Virginia Akademie der Wissenschaft kleine Projekt Research Grant (etfolgreich) finanziert. Unterstützung hat wurde großzügig zur Verfügung gestellt von einer Betty Jo liebevolle Butler 58 Stiftung für Undergraduate Research Stipendium (K.M.B), ein Sommer-Forschungsstipendium Farrell (auf K.M.B), ein James Madison Universität zweiten Jahrhundert Stipendium (K.M.B), ein James Madison University Centennial Stipendium (C.J.H.), ein James Madison Universität Lucy Robinson Suche 30 Memorial Stipendium (Z.L.H.) und ein James Madison University College von Wissenschaft und Mathematik Fakultät Hilfe gewähren (etfolgreich).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C57BL/6J MäuseDas Jackson Laboratory#000664Siehe "1. Maus-Setup" (Schritt 1.1, "Wildtyp-Mäuse")
GFP. Cre leerer VektorAddGene#20781Siehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.1 "einzelnes DNA-Konstrukt, das sowohl für die Cre-Rekombinase als auch für einen Fluoreszenzmarker kodiert"). GFP. Der leere Vektor Cre war ein Geschenk von Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#69138Siehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.1 "Supernova"-System) und http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) war ein Geschenk von Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova)AddGene#69136Siehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.1 "Supernova"-System) und http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) war ein Geschenk von Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#85006Siehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.1 "Supernova"-System) und http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) war ein Geschenk von Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen#12362Siehe "2. DNA-Setup" (Schritt 2.3 "Endotoxin-freies Plasmid-Aufreinigungskit")
Trypanblau-Pulver, BioReagenz-QualitätSigmaT6146-5GSiehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.5 "Trypanblau")
Natriumchlorid, ACS, 2,5 kgVWRBDH9286-2,5KGSiehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.5 "NaCl")
Kaliumchlorid, ACS, 500 gVWR#97061-566Siehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.5 "KCl")
Natriumphosphat zweibasisch, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichS0876-100GSiehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.5 "Na2HPO4")
Kaliumphosphat monobasisch, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichP5379-100GSiehe "2. DNA-Set-up" (Schritt 2.5 "KH2PO4")
Salzsäure, ACS-Reagenz, 500mL Fisher ScientificA144-500Siehe "2. DNA-Setup" (Schritt 2.5 "HCl")
P-97 MikropipettenabzieherSutter InstrumentP-97Siehe "3. Pipetteneinrichtung" (Schritt 3.1 "Glaskapillarabzieher")
3,0 mm breite Rinne FilamentSutter InstrumentFT330BSiehe "3. Pipetteneinrichtung" (Schritt 3.1 "Glaskapillarabzieher")
Dünnwandige Glaskapillaren, 4", 1 / 0,75 OD/IDWorld Precision InstrumentsTW100-4Siehe "3. Pipetteneinrichtung" (Schritt 3.1.1 "Glaskapillare")
Einlagige Soft-Tech Tücher, 4,5"PhenixLW-8148Siehe "3. Pipetteneinrichtung" (Schritt 3.2.1 "Einlagiges Abwischen der Aufgabe"); Es können auch andere einlagige Tücher (z.B. Kimwipes) verwendet werden.
Graefe Pinzette, 7 cm, gerade, 0,7 mm 1x2 ZähneWorld Precision Instruments#14140Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.1 "Graefe Pinzette")
Irisschere, 11,5 cm, gerade, 12er-PackWorld Precision Instruments#503708-12Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.1 "Irisschere")
Hartman Mosquito Pinzette, 9 cm, gerade, 12er-PackWorld Precision Instruments#503728-12Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.1 "Hartman-Mückenzange")
Allzweck-Vliesschwämme, 2" x 2", 4-lagigMedrepexpress#2204-cSiehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.1 "Vlies-Mullschwämme")
Ringpinzette, 10 cm, gerade, 2,2 mm IDWorld Precision Instruments#503203Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.1 "Ringpinzette")
Pyrex-Petrischalen komplett, Außendurchmesser & mal; H 100 mm & mal; 20 mmSigma-AldrichCLS3160102-12EASiehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.1 "Petrischale")
Flache Instrumentenablage, Edelstahl, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"AmazonB007SHGAHASiehe "4. In utero-Elektroporation" (Schritt 4.1 "Edelstahl-Tablett")
Platin-Pinzette, 5 mmBTX#45-0489Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.3 und 4.16 "Pinzetten-Elektroden")
ECM 830 FußpedalBTX#45-0211Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.3 und 4.17 "Fußpedal")
ECM 830 GeneratorBTX#45-0052Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.3 "Generator")
Eintierisches Isofluran-Anästhesiesystem mit kleiner Induktionsbox,Harvard-Gerät#72-6468Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.4 und 4.6 "Nasenkonus", Schritt 4.4 "Induktionskammer")
AugensalbeHanna Pharmaceutical Supply Co#0536108691Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.7 "Veterinär-Augensalbe")
Space Gel (AIMS)VWR#95059-640Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.8 "versiegelter Beutel gefüllt mit übersättigter Salzlösung")
Haarentferner-Gel-Creme, empfindliche FormelVeet#062200809951Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.9 "Enthaarungscreme")
10ul Low Retention Tip Starter (960 Spitzen/Packung)Phenix Research ProductsTSP-10LKITSiehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.12 "steril 10 & Mikro; L Mikropipettenspitze")
Aspiratorröhrchen für kalibrierte MikrokapillarpipettenSigma-AldrichA5177Siehe "4. In utero-Elektroporation" (Schritt 4.15 "Montage des Aspiratorschlauchs")
Geflochtenes resorbierbares Nahtmaterial, 4-0, Nadel NFS-2(FS-2), 27"MedrepexpressMV-J397Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.19 "Resorbierbare Nähte")
" LiquiVet Rapid" GewebekleberMedrepexpressVG3Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.20 "Gewebeadhäsiv")
Injektionsspritzen, Polypropylen, Luer-Lock-Spitze, Fassungsvermögen 1,0 mLSigma-AldrichZ551546-100EASiehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.21 "1 mL Spritze")
BD Precisionglide Spritzennadeln Stärke 26, L 1/2 in.Sigma-AldrichZ192392-100EASiehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.21 "26G, ½ ”
Nestlets Nesting MaterialAncareNES3600Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.24 "Nistmaterialien")
Sonnenblumenkerne, Schwarzöl, sterilBio-ServS5137Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.24 "Sonnenblumenkerne")
Paraformaldehyd, 97%Alfa AesarA11313Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.1.1 "PFA")
Economy Pinzette #3, 11 cm, 0,2 x 0,4 mm SpitzenWorld Precision Instruments#501976Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.5 "Pinzette")
AgarpulverAlfa Aesar#10752Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.8.1 "agar")
Einschneidige Rasierklingen, #9 KlingeStanley Tools#11-515Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.9 "Einschneidige Rasierklinge")
Probenscheibe S D 50 mmLeica#14046327404Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.9 "vibrierende Mikrotom-Probenscheibe")
Pufferschale S MontageLeica#1404630132Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.10 "Pufferschale")
VT1000 S VibratomeLeica#14047235612Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.10 "vibrierendes Mikrotom")
Doppelschneidige RasierklingenPersonnaBP9020Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.10 "Klinge")
Messerhalter SLeica#14046230131Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.10 "Messerhalter")
Studio Elements Golden Taklon Rundbürstenset mit kurzem GriffAmazonB0089KU6XESiehe "5. Histologie" (Schritt 5.12.1 "Pinsel mit feiner Spitze")
Superfrost Plus SlidesElectron Micron Microscopy Services#71869-11Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.12.1 "Objektträger")
ProLong Diamond Antifade Eindeckmittel, 10 mlThermofisherP36970Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.12.3-5.12.4 "Eindeckmittel")
Deckglas, 24 x 50 mm, Nr. 1Phenix Research ProductsMS1415-10Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.12.4 "Deckglas")
4′,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI)Sigma-AldrichD9542Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.13.1 "DAPI")
FesttischmikroskopOlympusBX51WISiehe "5. Histologie" (Schritt 5.15 "Lichtmikroskop")
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopNikonTE2000/C2siSiehe "5. Histologie" (Schritt 5.15 "Konfokalmikroskop")
4x Objektiv, NA = 0,20NikonCFI Plan Apo Lambda 4XSiehe "5. Histologie" (Schritt 5.15 "Low-Power-Objektiv")
20x Objektiv, NA = 0,75NikonCFI Plan Apo Lambda 20XSiehe "5. Histologie" (Schritt 5.15 "Objektiv mittlerer Leistung")
60x Objektiv, NA = 1.40NikonCFI Plan Apo VC 60X ÖlSiehe "5. Histologie" (Schritt 5.15 "Hochleistungsobjektiv")

Referenzen

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Genetische MosaikanalyseStudie zum neuronalen Ph notypInjektion von DNA KonstruktenTrypanblau Kalibrierungkonfokale BildgebungsanalyseSparse Labeling TechnikTargeting kortikaler Schichten

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